叶酸是一种水溶性的B族维生素(B9)，其作为影响DNA合成和参与蛋氨酸循环的物质，参与细胞增殖和乳蛋白合成等代谢途径[1]，维持着机体正常的生命活动。哺乳动物不能合成叶酸，其体内的叶酸来源于食物，因此，有些西方国家强制性地在食品中加入叶酸[2]。随着叶酸在一些先天畸形、心血管疾病及肿瘤等方面研究的逐步深入[3-5]，叶酸的重要性逐渐被人们所认识。大量研究报道表明，叶酸对人类的健康有着极其重要的作用，叶酸缺乏可使任何年龄阶段的人表现为巨幼红细胞或巨噬细胞性贫血[6]。在老年人中，叶酸的缺乏可能导致认知能力下降进而导致老年痴呆[7]。对于妊娠妇女，妊娠期间叶酸的缺乏会对胚胎和胎儿发育产生严重的不良影响[8-10]。
在畜牧业，叶酸补饲的研究在单胃动物(猪和家禽)上已取得丰富的成果，并广为应用，添加叶酸可有效提高母猪窝产仔数、窝产活仔数及产奶量[11]，有效降低雏鸡死亡率、提高免疫力，显著提高肉鸡日增重和蛋鸡的产蛋量等[12-15]。近年，随着育种和营养科学的快速发展，奶牛的生产性能尤其是产奶量快速提高，瘤胃微生物合成和饲料所提供的叶酸已经无法满足高产奶牛的需要[16]，因此，研究补饲叶酸对高产奶牛生产性能的影响具有重要意义。
随着奶牛产奶量的提高，奶牛身体的负担越来越大，导致许多疾病的发生，给奶业的健康发展带来巨大危机，其中隐性乳房炎发病率较高，危害较大[17]。有研究表明，奶牛隐性乳房炎会造成泌乳量下降和乳品质降低[18-19]。由于隐性乳房炎不易被发觉，造成隐性乳房炎奶牛产奶量长期缓慢的下降、乳品质降低，且可能发展为临床乳房炎，增加兽药成本及奶牛淘汰率，为奶牛养殖业造成巨大的经济损失。张志超等[20]和Khan等[21]通过试验发现，奶牛围产期添加包被叶酸不仅对泌乳早期主要产奶性能产生有利影响，可以有效提高其高峰期泌乳量，降低乳房炎发生率，并且对其免疫力指标及相关基因表达量有着积极作用。宋敏艳[22]使用不同浓度叶酸处理奶牛乳腺上皮细胞(Mac-T细胞)，检测叶酸补给对奶牛金葡菌乳房炎抗性候选基因及炎症细胞因子表达的影响，从细胞水平验证了叶酸对奶牛金葡菌乳房炎的发展有显著抑制作用。但叶酸对奶牛隐性乳房炎有何影响却鲜见报道。因此，本研究以隐性乳房炎奶牛作为研究对象，根据收集饲喂前后的奶牛生产性能测定(dairy herd improvement，DHI)数据以及通过对外周血白细胞进行转录组测序，探究叶酸对其产奶与免疫力性状及相关基因表达的影响，旨在通过优化外在因素的方法(补饲叶酸)，从遗传学角度，综合分析叶酸对于隐性乳房炎奶牛免疫及产奶相关性状的影响及分子机制，为隐性乳房炎奶牛补充叶酸奠定一定的理论依据和实践基础。
1 材料与方法 1.1 试验动物本试验动物是来源于北京郊区某牧场的中国荷斯坦奶牛群体，根据DHI数据，挑选出隐性乳房炎牛。划分依据是：连续两个月体细胞数(somatic cell count, SCC)大于500×103个·mL-1，无临床乳房炎症状，仍在生产群的奶牛作为隐性乳房炎牛(高SCC牛)。选择胎次、体重相近的29头泌乳牛作为研究对象，分为补饲组(n=18)和对照组(n=11)。试验牛平均泌乳天数为187 d，平均胎次为2.88胎。试验开始时间为2016年6月，试验期间所有牛只饲养在同一特定的牛舍内。
1.2 叶酸包被用量及方案由北京市东方天合生物技术有限公司购买叶酸并提供包被，包被叶酸过瘤胃有效率为72%。根据张志超[23]的研究，最终确定试验中包被叶酸最佳用量为每天120 mg/500 kg，根据体重进行等比例换算。
将试验牛分为2组：补饲组为18头高SCC牛，补饲叶酸；对照组为11头高SCC牛，不进行叶酸补饲。对补饲组的18头泌乳牛，根据其体重换算叶酸添加量，并与高产泌乳精料混合，每天在相同的时间进行饲喂，饲喂时间为14 d，其中补饲组有4头因故淘汰，有效饲喂头数为14头。对照组不进行任何处理。
1.3 样品采集及总RNA提取在进行叶酸饲喂试验后，对所有试验个体进行尾根静脉采血并分离出外周血白细胞，保存于Trizol(Ambion公司，USA)中并置于液氮中冻存，运回实验室后，置于-80 ℃超低温冰箱保存。每个组中随机选取4头牛，利用Trizol试剂(Ambion公司，USA)对牛血液白细胞进行总RNA提取。使用NANODROP2000超微量分光光度仪测定总RNA的浓度，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量及完整性。
1.4 测序及转录组数据分析1.4.1 cDNA文库构建及测序 本试验使用的是RNA磁珠调取polyA建库与Illumina NovaSeq 6000技术平台双末端测序，测序读长为150 bp。本试验中，样品转录组建库及测序委托浙江省安诺优达生物科技有限公司完成。
1.4.2 原始数据质控 利用FastQC软件(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)进行测序原始数据(Raw data)的质量评估，通过NGSQCToolkit_v2.3.3软件(http://www.nipgr.res.in/ngsqctoolkit.html)去除低质量的reads(测序时读出的短序列)和碱基，进而得到用于后续分析的Clean data。
1.4.3 基因组比对和注释及差异基因筛选 使用HISAT2软件(http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/manual.shtml)对Clean data与牛参考基因组(Bos_taurus.ARS-UCD1.2.95.gtf)进行比对。使用featureCounts软件(http://subread.sourceforge.net/)计算reads count，最后用DESeq2(https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html)进行差异表达分析。筛选差异表达基因时，本研究设定的基因差异表达显著性标准为P < 0.05，log2|Fold change|>1
1.4.4 基因功能的生物学分析 本研究使用KOBAS3.0在线软件(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/)对差异表达基因进行KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析和GO (gene ontology)条目分析，KEGG通路显著性阈值设定为 P < 0.05，GO富集分析显著性水平为P-adjust < 0.05。对差异基因进行KEGG通路分析，可以了解差异基因所参与的主要代谢和信号途径。通过GO富集分析可以了解差异基因富集在哪些生物学功能、途径或者细胞定位。为了分析差异表达基因其所编码蛋白质之间的互作关系，本研究使用在线STRING进行蛋白互作网络(protein-protein interaction network，PPI)分析(https://string-db.org/)。
1.4.5 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对测序结果的验证 本试验使用TaKaRa公司的反转录试剂盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)将上述经过质量检验合格的RNA制备成cDNA。以GAPDH作为内参基因，随机选择6个差异表达基因利用Primer Primer 5.0设计特异性引物，引物序列见表 1。引物均由擎科生物技术有限公司合成。以上述合成的cDNA为模板，利用Roche公司的荧光定量PCR仪(LightCyclerTM480Ⅱ)进行实时荧光定量PCR的扩增。反应体系：模板cDNA溶液2 μL，Blue-SYBR-Green mix 10 μL，上、下游引物(10-5 mol·L-1)各1 μL，ddH2O 6 μL，总计20 μL。利用2-△△Ct相对定量法计算基因的相对表达量，计算公式：△△Ct=[(Cttarget-Ctcontrol)]test-[(Cttarget-Ctcontrol)]reference；Cttarget为目标区域的Ct值；Ctreference为内参基因的Ct值(GAPDH)；test为待测样本；reference为参考样本。
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表 1 实时荧光定量PCR引物信息 Table 1 The primer information of qRT-PCR |
本研究对比补饲组与对照组在表型上的差异使用的是t检验，P>0.05为差异不显著，P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著。
2 结果 2.1 补饲叶酸对隐性乳房炎奶牛免疫力及产奶性状的影响2.1.1 补饲叶酸对隐性乳房炎奶牛SCC的影响 本研究跟踪收集所有试验奶牛饲喂前后的DHI数据并进行分析。根据SCC的变化发现(图 1)，对隐性乳房炎奶牛补饲叶酸后，补饲组SCC下降了270×103个·mL-1，对照组上升了460×103个·mL-1，补饲组SCC显著低于对照组(P < 0.05)。SCC是评定牛奶质量和乳房健康状况的一项重要依据，SCC越高说明奶牛患乳房炎的风险越高。本试验结果说明，补饲叶酸能降低隐性乳房炎奶牛的SCC，进一步降低乳房炎的发生，改善奶牛的免疫力，进而提高乳品质量。
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*.差异显著(P < 0.05) *. Significant difference(P < 0.05) 图 1 补饲叶酸后的SCC变化 Fig. 1 SCC changes after folic acid supplementation |
2.1.2 补饲叶酸对隐性乳房炎奶牛产奶相关性状的影响 由于试验时正值夏季，奶牛日产奶量降低。从图 2中可以看出，补饲组产奶量的下降趋势明显低于对照组，说明补饲叶酸对夏季奶牛产奶降低情况有所缓解，且这种影响能持续到饲喂后的3个月。饲喂后的3个月，补饲组的产奶量始终高于对照组，差值最大达到3.7 kg·d-1。与补饲前相比，补饲组补饲叶酸后，乳脂率无显著变化，对照组降低了0.2%。补饲组和对照组的乳蛋白率和乳糖率都呈上升趋势。对照组乳蛋白率的上升可能与日产奶量的下降有关，这符合乳蛋白率与产奶量呈负相关的规律。
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图 2 补饲叶酸后产奶相关性状的变化 Fig. 2 Change of milking related traits after folic acid supplementation |
2.2.1 牛血白细胞总RNA提取 从白细胞和Trizol混合物中提取总RNA，溶于40 μL RNase-free 0.01% DEPC水中，取2 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图 3所示，可见总RNA有3条带，28S条带最亮，18S其次，5S条带不明显，说明RNA质量完好。同时利用NanoDrop 2000检测RNA质量，OD260 nm/OD280 nm>1.8，OD260 nm/OD230 nm>1.8，RNA浓度在100~200 ng·μL-1之间，符合后续试验要求。
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图 3 部分样品白细胞提取总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳图 Fig. 3 Detection of RNA extracted from leukocytes by 1% agrose gel electrophoresis of partial samples |
2.2.2 补饲叶酸对隐性乳房炎奶牛相关基因表达的影响 本研究对补饲组和对照组的转录组数据分析发现，共有277个基因差异表达(P < 0.05, log2|Fold change|>1)，其中105个基因的表达发生上调，172个基因的表达发生下调。其中上调基因中的ADGRA1为黏附G蛋白偶联受体A1，这个基因编码的蛋白质是属于G蛋白偶联受体黏附家族，这个家族的蛋白在多个感官系统中起作用，并调节血压和免疫反应等，说明饲喂叶酸可能是通过影响该基因的表达进而提升隐性乳房炎奶牛的免疫力。
2.2.3 差异表达基因的聚类分析 对筛选出的差异表达基因绘制热图(图 4)，结果显示，处理组(S1、S2、S3、S4)和对照组(N1、N2、N3、N4)的样本能分别聚类到一起。说明本试验得出的数据是可靠的，组内一致性和组间差异性也较好。
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每一行表示一个基因，每一列表示一个样本，颜色代表基因在样品中的表达量水平 Each row represents a gene, each column represents a sample, and colors represent the level of gene expression in the sample 图 4 补饲组与对照组差异表达基因热图 Fig. 4 The heatmap of the differentially expressed genes between feeding group and control group |
2.2.4 差异表达基因的GO富集和KEGG通路分析 在补饲组和对照组的比较中，277个差异表达基因主要富集到42个GO条目(P-adjust < 0.05)，且与免疫应答功能相关，包括炎症反应、免疫反应、细胞因子生成调控、细胞分化、白细胞趋化和迁移、调节免疫系统过程等(图 5)。KEGG通路分析中，共富集到33条显著的通路(P < 0.05)，这些通路大多与免疫有关(表 2)。
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箭头指与免疫相关的重要GO条目 The arrows refer to the important gene ontology (GO) terms related to immunity 图 5 补饲组与对照组差异基因的GO分析 Fig. 5 Gene ontology (GO) terms analysis of the DEGs between feeding group and control group |
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表 2 补饲组与对照组差异基因富集通路(top10) Table 2 Functional pathways enriched by differentially expressed genes between feeding group and control group(top10) |
2.2.5 STRING蛋白网络互作分析 对补饲组和对照组277个差异表达基因编码的蛋白进行蛋白质间相互作用分析，如图 6所示，LOC534578、BDKRB2、MCHR1、GPR31、CASR、CCL20、CXCL13、TNFAIP3、IL1B、CCL3、HCAR3、TNF、GRO1、ICAM1、CCL4、CXCL3、IL1A、CXCL2基因编码的蛋白质间高度互相关联。
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图 6 补饲组与对照组差异表达基因编码蛋白网络互作图 Fig. 6 PPI network of differentially expressed genes between feeding group and control group |
2.2.6 差异表达基因与SCC相关性分析 为了寻找与SCC相关关系较密切的基因，本研究对差异表达基因的reads count和SCC作相关分析。分析发现(图 7)，BCL2(r=0.95)、KIR3DS1(r=0.99)、CHML(r=0.92)这3个基因均与SCC极显著相关(P < 0.01)。
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图 7 差异表达基因的校正reads数与SCC相关关系的散点图 Fig. 7 Scatter diagram of somatic cell count and adjust-reads count of the differentially expressed genes |
2.2.7 qRT-PCR对RNA-seq结果的验证 为了验证RNA-seq得到的基因差异表达结果，随机挑选6个基因进行qRT-PCR验证。RNA-seq及qRT-PCR的结果对比见图 8，从中可以看出，各基因在RNA-seq和qRT-PCR具有相同变化趋势，说明RNA-seq结果可信度较高。
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图 8 补饲组与对照组差异表达基因的qRT-PCR与RNA-seq结果对比 Fig. 8 The results comparison of DEGs by qRT-PCR and RNA-seq in feeding group and control group |
本试验目的是探索叶酸对隐性乳房炎奶牛免疫力及产奶相关性状的影响及调控机制。本研究对隐性乳房炎奶牛饲喂叶酸后发现，补饲叶酸能显著降低隐性乳房炎奶牛的SCC。Bae等[24]对奶牛乳腺上皮细胞(Mac-T)进行叶酸处理后发现，叶酸能促进Mac-T细胞的增殖，且减少细胞凋亡，这与本研究结果一致。但停止饲喂1个月后，叶酸补饲组奶牛的SCC又出现了升高的现象，这可能与补饲时间不够有关，日后将延长补饲时间进行试验。
研究发现，叶酸除了可以缓解炎症反应，提高机体免疫力[14]外，还可以提高产奶量[25-26]及乳品质[27-28](乳脂率、乳蛋白率等)。本研究中，产奶量及乳脂率出现了下降，这可能由于试验时正值夏季，热应激(引起产奶量降低等)会对试验结果造成不利的影响[29]，但补饲组下降的趋势低于对照组，从另一层面来说，叶酸补饲可以缓解热应激带来的产奶量下降等问题。叶酸是蛋白质合成的重要物质，对于荷斯坦奶牛，在日粮中补饲叶酸可以提高乳蛋白率[27, 30]，这与本研究结果一致，也符合乳蛋白率与产奶量呈负相关的规律。
许多研究表明，叶酸对免疫及泌乳性能有显著的影响[16, 25-28, 30-37]，但其机制尚不清楚。Graulet等[25]的研究结果表明，对荷斯坦奶牛补饲叶酸能促进蛋氨酸合成，所以叶酸可能通过促进蛋氨酸的合成来对泌乳性能产生影响。其次，由于叶酸在机体内参与多种氨基酸的代谢，因此，叶酸可能通过促进有关蛋白质的合成，使乳腺组织可以从血液中吸收更多的蛋白质用于乳腺的生长发育和乳蛋白的形成。La等[38]发现，叶酸能上调奶牛肝中与蛋白质合成相关的基因表达。其他研究也发现，叶酸参与乳蛋白合成，并能上调泌乳奶牛乳腺中与蛋白合成相关的基因表达[39]。Murney等[40]研究人员发现，乳腺上皮细胞的凋亡导致的乳腺上皮细胞的减少与泌乳量的下降高度相关。因此，叶酸可能通过改变细胞增殖和凋亡来维持或增加乳腺组织的细胞数量，从而影响泌乳性能。
本研究中，通过比较补饲组和对照组的转录组数据，共发现了277个差异基因，这些基因主要富集在包括炎症反应、免疫反应、细胞因子生成调控、细胞分化、白细胞趋化和迁移、调节免疫系统过程等免疫相关的功能GO条目，以及先天免疫和细胞免疫应答相关的重要通路。这与Feng等[36]的研究结果一致，其发现叶酸通过调控MAPKs和NF-κB通路来抑制大鼠巨噬细胞对LPS的炎症反应，说明了叶酸对免疫维持和炎症抑制的作用，其中的通路MAPKs(P < 0.05)与NF-κB(P < 0.01)在本研究中也有发现。Samblas等[37]发现，叶酸可以降低人巨噬细胞白细胞介素1β(IL1B)和肿瘤坏死因子(TNF)的表达，从而抑制炎症相关疾病的发生。IL1B基因为白细胞介素β1，由该基因编码的蛋白质是白细胞介素1细胞因子家族的成员。该细胞因子由活化的巨噬细胞产生前蛋白，其通过半胱天冬酶1(CASP1/ICE)蛋白水解加工成活性形式，是炎症反应的重要介质，参与多种细胞活动，包括细胞增殖、分化和凋亡。在本研究中也发现，IL1B基因(P < 0.01, log2|Fold change|>2)和TNF(P < 0.05, log2|Fold change|>2)显著下调，说明叶酸有缓解炎症发生的作用。本研究通过关联分析发现，BCL2、KIR3DS1、CHML这3个基因与奶牛SCC呈显著相关。KIR3DS1基因编码的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIRs)是由自然杀伤细胞和T细胞亚群表达的跨膜糖蛋白，许多研究表明它在调节免疫应答中起重要作用[41]。BCL2基因编码一种线粒体外膜蛋白，可以调控某些细胞(如淋巴细胞)的凋亡[42]，此外还有研究表明，CHML基因可以降低NF-κB受体的表达[43]。以上结果说明, 叶酸可能通过调控上述基因及通路来提高机体的免疫力。综上分析结果说明，补饲叶酸对隐性乳房炎奶牛的免疫力有积极作用。本研究为今后开展隐性乳房炎牛免疫应答机制研究奠定了良好基础。
4 结论本研究中，对隐性乳房炎奶牛补饲叶酸可显著降低SCC，对产奶相关性状(产奶量、乳蛋白率)等有积极影响，但差异不显著。通过对转录组数据的分析，共检测到277个差异表达基因，这些基因主要富集在包括炎症反应、免疫反应、细胞因子生成调控、细胞分化、白细胞趋化和迁移、调节免疫系统过程等免疫相关的功能GO条目，以及与细胞免疫应答和炎症免疫应答相关的重要通路。说明补饲叶酸对机体免疫力的积极作用可能是通过调控免疫相关基因达到的。而叶酸对奶牛泌乳性能的分子调控机制尚不清楚，仍需进一步的研究。
| [1] | GUÉANT J L, NAMOUR F, GUÉANT-RODRIGUEZ R M, et al. Folate and fetal programming:a play in epigenomics?[J]. Trends Endocrinol Metab, 2013, 24(6): 279–289. DOI: 10.1016/j.tem.2013.01.010 |
| [2] | CAWLEY S, MULLANEY L, MCKEATING A, et al. A review of European guidelines on periconceptional folic acid supplementation[J]. Eur J Clin Nutr, 2016, 70(2): 143–154. |
| [3] | LY A, ISHIGURO L, KIM D, et al. Maternal folic acid supplementation modulates DNA methylation and gene expression in the rat offspring in a gestation period-dependent and organ-specific manner[J]. J Nutr Biochem, 2016, 33: 103–110. DOI: 10.1016/j.jnutbio.2016.03.018 |
| [4] | WANG Y, JIN Y, WANG Y, et al. The effect of folic acid in patients with cardiovascular disease:A systematic review and meta-analysis[J]. Medicine (Baltimore), 2019, 98(37): e17095. DOI: 10.1097/MD.0000000000017095 |
| [5] | SAHAKYAN V, DUELEN R, TAM W L, et al. Folic acid exposure rescues spina bifida aperta phenotypes in human induced pluripotent stem cell model[J]. Sci Rep, 2018, 8(1): 2942. |
| [6] | YADAV M K, MANOLI N M, MADHUNAPANTULA S R V. Comparative assessment of vitamin-b12, folic acid and homocysteine levels in relation to p53 expression in megaloblastic anemia[J]. PLoS One, 2016, 11(10): e164559. |
| [7] | REYNOLDS E H. The neurology of folic acid deficiency[J]. Handb Clin Neurol, 2014, 120: 927–943. DOI: 10.1016/B978-0-7020-4087-0.00061-9 |
| [8] | GOMES S, LOPES C, PINTO E. Folate and folic acid in the periconceptional period:recommendations from official health organizations in thirty-six countries worldwide and WHO[J]. Public Health Nutr, 2016, 19(1): 176–189. DOI: 10.1017/S1368980015000555 |
| [9] | TOIVONEN K I, LACROIX E, FLYNN M, et al. Folic acid supplementation during the preconception period:A systematic review and meta-analysis[J]. Prev Med, 2018, 114: 1–17. DOI: 10.1016/j.ypmed.2018.05.023 |
| [10] | ZHENG J S, GUAN Y H, ZHAO Y M, et al. Pre-conceptional intake of folic acid supplements is inversely associated with risk of preterm birth and small-for-gestational-age birth:a prospective cohort study[J]. Br J Nutr, 2016, 115(3): 509–516. DOI: 10.1017/S0007114515004663 |
| [11] | WANG S P, YIN Y L, YIN Q, et al. Effects of folic acid on the performance of suckling piglets and sows during lactation[J]. J Sci Food Agric, 2011, 91(13): 2371–2377. DOI: 10.1002/jsfa.4469 |
| [12] | MUNYAKA P M, TACTACAN G, JING M, et al. Immunomodulation in young laying hens by dietary folic acid and acute immune responses after challenge with Escherichia coli lipopolysaccharide[J]. Poult Sci, 2012, 91(10): 2454–2463. DOI: 10.3382/ps.2012-02381 |
| [13] | JANIST N, SRICHANA P, ASAWAKARN T, et al. Effect of supplementing the laying hen diets with choline, folic acid, and vitamin B12 on production performance, egg quality, and yolk phospholipid[J]. Livest Sci, 2019, 223: 24–31. DOI: 10.1016/j.livsci.2019.02.019 |
| [14] | NOURI S, GHALEHKANDI J G, HASSANPOUR S, et al. Effect of in ovo feeding of folic acid on subsequent growth performance and blood constituents levels in broilers[J]. Int J Pept Res Ther, 2018, 24(3): 463–470. DOI: 10.1007/s10989-017-9629-x |
| [15] | BAGHERI S, JANMOHAMMADI H, MALEKI R, et al. Laying hen performance, egg quality improved and yolk 5-methyltetrahydrofolate content increased by dietary supplementation of folic acid[J]. Anim Nutr, 2019, 5(2): 130–133. DOI: 10.1016/j.aninu.2018.05.008 |
| [16] | SCHWAB E C, SCHWAB C G, SHAVER R D, et al. Dietary forage and nonfiber carbohydrate contents influence B-vitamin intake, duodenal flow, and apparent ruminal synthesis in lactating dairy cows[J]. J Dairy Sci, 2006, 89(1): 174–187. DOI: 10.3168/jds.S0022-0302(06)72082-3 |
| [17] | GONÇALVES J L, KAMPHUIS C, MARTINS C M M R, et al. Bovine subclinical mastitis reduces milk yield and economic return[J]. Livest Sci, 2018, 210: 25–32. DOI: 10.1016/j.livsci.2018.01.016 |
| [18] |
马裴裴, 俞英, 张沅, 等. 中国荷斯坦牛SCC变化规律及其与产奶性状之间的关系[J]. 畜牧兽医学报, 2010, 41(12): 1529–1535.
MA P P, YU Y, ZHANG Y, et al. The distribution of SCC and its correlation with milk production traits in Chinese Holsteins[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2010, 41(12): 1529–1535. (in Chinese) |
| [19] | BOBBO T, RUEGG P L, STOCCO G, et al. Associations between pathogen-specific cases of subclinical mastitis and milk yield, quality, protein composition, and cheese-making traits in dairy cows[J]. J Dairy Sci, 2017, 100(6): 4868–4883. |
| [20] |
张志超, 陈思倩, 刘刚, 等. 围产期奶牛饲喂包被叶酸对早期产奶性能的影响[J]. 中国奶牛, 2019(5): 11–14.
ZHANG Z C, CHEN S Q, LIU G, et al. Effects of feeding folic acid on the early milk production performance of cows during perinatal period[J]. China Dairy Cattle, 2019(5): 11–14. (in Chinese) |
| [21] | KHAN M Z, ZHANG Z C, LIU L, et al. Folic acid supplementation regulates key immunity-associated genes and pathways during the periparturient period in dairy cows[J]. Asian-Australas J Anim Sci, 2020, 33(9): 1507–1519. DOI: 10.5713/ajas.18.0852 |
| [22] |
宋敏艳.奶牛金葡菌乳房炎抗性的全基因组DNA甲基化表达调控及候选基因功能验证[D].北京: 中国农业大学, 2017.
SONG M Y.The regulation of Genome-wide DNA methylation and functional verification of candidate genes for bovine Staphylococcus aureus mastitis resistance[D].Beijing: China Agricultural University, 2017.(in Chinese) http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10019-1017168388.htm |
| [23] |
张志超.包被叶酸提高围产期荷斯坦牛免疫力的分子基础研究[D].北京: 中国农业大学, 2016.
ZHANG Z C.Study on molecular mechanisms of folic acid to improve the immunity of transition Holstein cow[D].Beijing: China Agricultural University, 2016.(in Chinese) |
| [24] | BAE D, CHON J W, KIM D H, et al. Effect of folic acid supplementation on proliferation and apoptosis in bovine mammary epithelial (MAC-T) cells[J]. Anim Biotechnol, 2020: 1–9. |
| [25] | GRAULET B, MATTE J J, DESROCHERS A, et al. Effects of dietary supplements of folic acid and vitamin B12 on metabolism of dairy cows in early lactation[J]. J Dairy Sci, 2007, 90(7): 3442–3455. DOI: 10.3168/jds.2006-718 |
| [26] | LI H Q, LIU Q, WANG C, et al. Effects of dietary supplements of rumen-protected folic acid on lactation performance, energy balance, blood parameters and reproductive performance in dairy cows[J]. Anim Feed Sci Technol, 2016, 213: 55–63. DOI: 10.1016/j.anifeedsci.2016.01.005 |
| [27] | PREYNAT A, LAPIERRE H, THIVIERGE M C, et al. Effects of supplementary folic acid and vitamin B12 on hepatic metabolism of dairy cows according to methionine supply[J]. J Dairy Sci, 2010, 93(5): 2130–2142. DOI: 10.3168/jds.2009-2796 |
| [28] | GIRARD C L, LAPIERRE H, MATTE J J, et al. Effects of dietary supplements of folic acid and rumen-protected methionine on lactational performance and folate metabolism of dairy cows[J]. J Dairy Sci, 2005, 88(2): 660–670. DOI: 10.3168/jds.S0022-0302(05)72730-2 |
| [29] | SRIKANDAKUMAR A, JOHNSON E H. Effect of heat stress on milk production, rectal temperature, respiratory rate and blood chemistry in holstein, jersey and australian milking zebu cows[J]. Trop Anim Health Prod, 2004, 36(7): 685–692. DOI: 10.1023/B:TROP.0000042868.76914.a9 |
| [30] | WANG C, LIU Q, GUO G, et al. Effects of rumen-protected folic acid and branched-chain volatile fatty acids supplementation on lactation performance, ruminal fermentation, nutrient digestion and blood metabolites in dairy cows[J]. Anim Feed Sci Technol, 2019, 247: 157–165. DOI: 10.1016/j.anifeedsci.2018.11.015 |
| [31] | DU H S, WANG C, WU Z Z, et al. Effects of rumen-protected folic acid and rumen-protected sodium selenite supplementation on lactation performance, nutrient digestion, ruminal fermentation and blood metabolites in dairy cows[J]. J Sci Food Agric, 2019, 99(130): 5826–5833. |
| [32] | ZHANG Z, LA S K, ZHANG G W, et al. Diet supplementation of palm fat powder and coated folic acid on performance, energy balance, nutrient digestion, ruminal fermentation and blood metabolites of early lactation dairy cows[J]. Anim Feed Sci Technol, 2020, 265: 114520. DOI: 10.1016/j.anifeedsci.2020.114520 |
| [33] | DUPLESSIS M, LAPIERRE H, PELLERIN D, et al. Effects of intramuscular injections of folic acid, vitamin B12, or both, on lactational performance and energy status of multiparous dairy cows[J]. J Dairy Sci, 2017, 100(5): 4051–4064. DOI: 10.3168/jds.2016-12381 |
| [34] | VANACKER N, GIRARD C L, BLOUIN R, et al. Effects of feed restriction and supplementary folic acid and vitamin B12 on immune cell functions and blood cell populations in dairy cows[J]. Animal, 2020, 14(2): 339–345. DOI: 10.1017/S1751731119002301 |
| [35] | LI S Z, ZHI L H, LIU Y L, et al. Effect of in ovo feeding of folic acid on the folate metabolism, immune function and epigenetic modification of immune effector molecules of broiler[J]. Br J Nutr, 2016, 115(3): 411–421. DOI: 10.1017/S0007114515004511 |
| [36] | FENG D, ZHOU Y, XIA M, et al. Folic acid inhibits lipopolysaccharide-induced inflammatory response in RAW264.7 macrophages by suppressing MAPKs and NF-κB activation[J]. Inflamm Res, 2011, 60(9): 817–822. DOI: 10.1007/s00011-011-0337-2 |
| [37] | SAMBLAS M, MARTÍNEZ J A, MILAGRO F. Folic acid improves the inflammatory response in LPS-activated THP-1 macrophages[J]. Mediators Inflamm, 2018, 2018: 1312626. |
| [38] | LA S K, LI H, WANG C, et al. Effects of rumen-protected folic acid and dietary protein level on growth performance, ruminal fermentation, nutrient digestibility and hepatic gene expression of dairy calves[J]. J Anim Physiol Anim Nutr, 2019, 103(4): 1006–1014. |
| [39] | OUATTARA B, BISSONNETTE N, DUPLESSIS M, et al. Supplements of vitamins B9 and B12 affect hepatic and mammary gland gene expression profiles in lactating dairy cows[J]. BMC Genomics, 2016, 17(1): 640. DOI: 10.1186/s12864-016-2872-2 |
| [40] | MURNEY R, STELWAGEN K, WHEELER T T, et al. The effects of milking frequency in early lactation on milk yield, mammary cell turnover, and secretory activity in grazing dairy cows[J]. J Dairy Sci, 2015, 98(1): 305–311. DOI: 10.3168/jds.2014-8745 |
| [41] | CAMPBELL K S, PURDY A K. Structure/function of human killer cell immunoglobulin-like receptors:lessons from polymorphisms, evolution, crystal structures and mutations[J]. Immunology, 2011, 132(3): 315–325. DOI: 10.1111/j.1365-2567.2010.03398.x |
| [42] | CORY S, ADAMS J M. The Bcl2 family:regulators of the cellular life-or-death switch[J]. Nat Rev Cancer, 2002, 2(9): 647–656. DOI: 10.1038/nrc883 |
| [43] | WARNER N, BURBERRY A, FRANCHI L, et al. A Genome-wide siRNA screen reveals positive and negative regulators of the NOD2 and NF-kB signaling pathways[J]. Sci Signal, 2013, 6(258): rs3. |