, LI Mengwei, TANG Zhenhua, PENG Lijuan, PENG Kaiping, LIANG Xin, XIE Fang, YANG Chengjian
反刍动物瘤胃甲烷的排放会导致日粮能量损失，通过改善瘤胃发酵状况来减少甲烷排放对提高反刍动物生产性能具有重要意义。反刍动物所产生的甲烷主要来自瘤胃产甲烷菌利用CO2和H2生成，如果瘤胃内有其它物质可以与CO2竞争H2，则既能有效抑制瘤胃甲烷的产量，又能降低瘤胃H2分压，对维持瘤胃的正常发酵具有重要意义。有报道称，硝酸盐可作为电子受体与甲烷菌竞争氢，抑制甲烷生成，还可抑制瘤胃微生物活性[1]。但是硝酸盐使用不当，尤其是高剂量或长时间添加可能导致亚硝酸盐中毒，这限制了其在实际生产中的应用。延胡索酸是生物体三羧酸循环的中间代谢产物，它在瘤胃中可还原成琥珀酸，进一步形成丙酸，这个过程也消耗H2[2]，可以与产甲烷菌竞争氢和甲酸，减少瘤胃甲烷的产生[3]，并能促进纤维素分解菌增殖及对纤维素的消化[4]。但也有研究表明，延胡索酸盐不能有效减少甲烷产量[5]。Iwamoto等[6]采用体外法研究发现，延胡索酸可以降低硝酸盐还原过程中亚硝酸盐在瘤胃的积累，从而避免亚硝酸盐中毒。姜宇晨[7]发现，在体外添加0.5%硝酸钾和2%延胡索酸二钠组合可显著降低绵羊甲烷产量，对瘤胃发酵影响较小。目前，有关硝酸钠和延胡索酸二钠联合使用抑制水牛瘤胃甲烷方面的报道国内外未见。因此，本试验将通过体外法探讨不同比例硝酸钠和延胡索酸二钠对水牛瘤胃甲烷产量、体外发酵、脂肪酸组成和瘤胃微生物数量的影响，筛选合适的硝酸钠和延胡索酸二钠添加比例，以达到既能抑制甲烷，又避免亚硝酸盐中毒，同时改善瘤胃发酵状况的目的，为其在反刍动物生产中的应用提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验所用豆粕、玉米、象草均采自广西水牛研究所，经65 ℃烘干制成风干样后，粉碎过40目筛用于体外发酵。
硝酸钠(分析纯)购于天津市百世化工有限公司；延胡索酸二钠(分析纯)购于上海源叶生物科技有限公司；α-亚麻酸标准品(纯度≥99%)购于美国Sigma公司。
瘤胃液供体试验动物是3头体重约为(650±50) kg安装有永久性瘤胃瘘管的母水牛。瘘管牛的饲粮水平参照广西水牛研究所的日常饲料配方配制，精粗比40:60。在早饲前抽取3只瘘管牛的瘤胃液，混合后经两层纱布过滤至预热处理过的收集瓶，39 ℃下连续通入CO2气体。
1.2 试验设计采用单因素试验设计，试验共设4个组，每组5个重复。每组各添加0.25 mg·mL-1的α-亚麻酸(为了更好观察脂肪酸生物氢化过程)，试验组添加硝酸钠和延胡索酸二钠混合物，浓度为1 mg·mL-1，硝酸钠和延胡索酸二钠的添加比例分别为2:1、1:1和1:2，对照组不添加任何两者混合物。
1.3 体外发酵试验采用体外批次培养法，体外发酵底物的精粗比为40:60(风干基础)，底物饲料分为精饲料(豆粕25%，玉米15%)和粗饲料(象草60%)，其营养成分见表 1。根据试验设计，准确称取500 mg发酵底物(300 mg象草粉+125 mg豆粕粉+75 mg玉米粉)置入180 mL厌氧培养瓶中，分别添加相应剂量硝酸钠、延胡索酸二钠和乳化后的α-亚麻酸液。持续通入CO2气体保持厌氧环境，加入人工瘤胃缓冲液40 mL，然后用橡胶塞和铝盖密闭，置于39 ℃水浴锅预热，人工瘤胃缓冲液的配制参照Menke等[8]的方法。在早饲前抽取3只瘘管水牛的瘤胃液，混合后经二层纱布过滤，加入至预热处理过和有充足CO2气体的保温瓶中，密封带回实验室。在发酵瓶盖子上插入两只注射器针头，用注射器抽取瘤胃液20 mL通过一只针头注入到已升温至39 ℃的培养瓶中，另一只针头用来放气，维持瓶内外气压平衡，混匀。置于恒温水浴摇床中，水浴温度(39.0±0.5) ℃，振荡频率50 r·min-1。
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表 1 底物组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the substrate (air-dry basis) |
1.4.1 总产气量和甲烷产量的测定 产气量测定方法参考文献[9]，培养3、6、9、12、24 h时，取一注射器针头，用一软细短管将100 mL润滑的玻璃注射器与针头连接，将针头插入发酵瓶橡胶塞，读取注射器上的刻度并记录。培养瓶净产气量(mL)=时间段产气量(mL)-对应时间段空白均产气量(mL)，24 h累积总产气量即各时间段培养瓶净产气量相加之和。每个时间点测完产气量的同时利用气相色谱仪(Agilent 7890A，美国安捷伦科技公司)测定甲烷含量，用手动进样针从发酵瓶抽取10 μL气体，直接进样至气相色谱仪，色谱柱为HP- INNOWax (19091 N-133)毛细管柱，规格为30 m× 0.25 mm×0.25 μm，测定条件参照胡伟莲等[10]的测定方法，24 h累积甲烷产量即各时间段培养瓶甲烷实际产量相加之和。
1.4.2 体外发酵参数的测定 在瘤胃培养液培养24 h结束后，将发酵瓶取出马上放进冰水混合物中，冷却15 min终止发酵。开瓶取10 mL培养液，用pH测定仪(HANNA HI 8424，上海何亦仪器仪表有限公司)测定培养液pH，测定前，pH计先用缓冲液进行校正；氨态氮(NH3-N)含量的测定参照鲁秋英[11]的方法，吸取4 mL培养液，加入4 mL 0.2 mol·L-1 HCl进行酸化，采用苯酚-次氯酸钠比色法，用紫外可见分光光度计(PE Lambda 35，上海普迪生物技术有限公司)在630 nm波长条件下比色，根据吸光度和标准曲线换算出NH3-N的浓度；吸取8 mL培养液于离心管中，采用考马斯亮蓝G250染色法测定微生物蛋白(MCP)含量；VFA浓度的测定：吸取1 mL培养液，加入0.5 mL 8.2%的偏磷酸，4 ℃，20 000×g离心10 min，取离心后的上清液920 μL，加入内标物巴豆酸(1 mol·L-1)80 μL。采用气相色谱仪(Agilent 7890A，美国安捷伦科技公司)测定，色谱柱为HP-INNOWax (19091 N-133)毛细管柱，规格为30 m×0.25 mm×0.25 μm，测定条件参照Li等[12]的方法。
1.4.3 瘤胃液中长链脂肪酸含量的测定 瘤胃液中长链脂肪酸的提取、甲酯化和测定方法参照Xu等[13]的方法，利用气相色谱仪(Agilent 7890B，美国安捷伦科技公司)，应用毛细管气相色谱-氢火焰离子化检测器(GC-FID)，自动进样器(Agilent G4513A，美国安捷伦科技公司)，HP-88脂肪酸甲酯测定专用毛细管柱，C17:0内标法检测中长链脂肪酸含量。
1.4.4 瘤胃微生物数量的测定 参照Denman和Mcsweeney[14]的方法提取瘤胃液微生物总DNA，采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取DNA。用超微量分光光度计(NanoDrop ND-2000，北京欣兴强森生物科技有限公司)测定DNA的纯度和浓度。
瘤胃液微生物数量的测定采用实时定量荧光PCR(Real-time PCR)方法测定，仪器是高通量实时荧光定量PCR仪(LightCycler 480，美国)，具体参照Shingfield等[15]的方法。瘤胃液微生物的引物序列见表 2，引物由上海生工生物工程公司合成。
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表 2 Real-time PCR引物序列 Table 2 PCP primers for real-time PCR assay |
采用Excel软件整理统计试验数据，用SPSS 18.0统计软件进行单因子方差(one-way ANOVA)分析，Duncan氏法进行多重比较，差异显著性以P < 0.05为判断标准，试验结果以“平均数±标准差(M±SD)”表示。
2 结果 2.1 总产气量、甲烷产量和体外发酵参数添加不同比例硝酸钠和延胡索酸二钠对体外发酵24 h累积总产气量、甲烷产量及体外发酵参数的影响见表 3，由表 3可得，与对照组相比，添加硝酸钠和延胡索酸二钠混合物显著降低了瘤胃培养液24 h累积总产气量和甲烷含量(P < 0.05)，甲烷含量分别降低了90.32%、90.95%、90.62%。硝酸钠和延胡索酸二钠添加比例为2:1、1:1的瘤胃培养液24 h累积总产气量显著低于其他组(P < 0.05)。添加硝酸钠和延胡索酸二钠混合物培养液的pH显著升高(P < 0.05)，丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸浓度显著降低(P < 0.05)；硝酸钠和延胡索酸二钠添加比例为2:1、1:1的丙酸和TVFA含量显著低于其他组(P < 0.05)，乙酸、乙酸/丙酸显著高于其他组(P < 0.05)。
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表 3 添加硝酸钠和延胡索酸二钠混合物对总产气量、甲烷产量和体外发酵参数的影响 Table 3 Effects of sodium nitrate and disodium fumarate mixture on total gas production, methane production and fermentation parameters in vitro |
添加不同比例硝酸钠和延胡索酸二钠对瘤胃液脂肪酸浓度的影响见表 4。由表 4可知，硝酸钠和延胡索酸二钠添加比例为2:1时C10:0含量显著高于其他组(P < 0.05)，C22:1n9含量显著高于硝酸钠：延胡索酸二钠1:1组(P < 0.05)，C18:2 trans-10, cis-12和C19:0含量显著高于对照组和硝酸钠：延胡索酸二钠1:2组(P < 0.05)；硝酸钠：延胡索酸二钠1:1组C6:0和C24:0含量显著高于硝酸钠：延胡索酸二钠1:2组(P < 0.05)；硝酸钠和延胡索酸二钠添加比例为2:1、1:1组C18:2 cis-9, trans-11和C20:5n3(EPA)含量高于其他组(P < 0.05)；随着硝酸钠比例的增加，UFA/SFA逐渐升高，且硝酸钠和延胡索酸二钠添加比例为2:1、1:1组UFA/SFA显著高于对照组(P < 0.05)。
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表 4 添加硝酸钠和延胡索酸二钠混合物对瘤胃液脂肪酸浓度的影响 Table 4 Effects of sodium nitrate and disodium fumarate mixture on rumen fatty acid composition |
添加不同比例硝酸钠和延胡索酸二钠对瘤胃微生物数量的影响见表 5。由表 5可知，硝酸钠和延胡索酸二钠添加比例为2:1时，总细菌、真菌、产甲烷菌数量显著低于对照组(P < 0.05)，原虫数量显著低于对照组和硝酸钠和延胡索酸二钠1:2组(P < 0.05)；硝酸钠和延胡索酸二钠添加比例为2:1、1:1时，溶纤维丁酸弧菌和蛋白分解丁酸弧菌数量显著低于其他组(P < 0.05)；硝酸钠和延胡索酸二钠添加比例为1:1时，非典型丁酸弧菌数量显著低于对照组(P < 0.05)；硝酸钠和延胡索酸二钠添加比例为1:2时，瘤胃微生物数量与对照组差异不显著(P>0.05)。
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表 5 添加硝酸钠和延胡索酸二钠混合物对瘤胃微生物数量的影响 Table 5 Effects of sodium nitrate and disodium fumarate mixture on the number of rumen microorganisms |
体外产气量是衡量瘤胃发酵体系中饲料发酵程度的一个重要指标，能够反映出饲料在瘤胃中的降解特性和瘤胃微生物的降解活性[19]。已有研究表明，硝酸盐具有抑菌功能，可能通过抑制瘤胃微生物活性[20]，从而降低瘤胃产气量。硝酸盐亦可作为电子受体与甲烷菌竞争氢，抑制甲烷生成[21]。而延胡索酸还原成琥珀酸时也需要氢的参与，有助于减少产甲烷菌代谢分支中的氢含量，从而减少瘤胃中甲烷的产生。Nguyen等[22]在体外发酵中接种婆罗门小母牛瘤胃液，发现添加2%硝酸钠可使体外发酵总产气量显著降低(P < 0.05)，甲烷产量降低86%。Zhou等[23]在奶牛饲粮中添加2%的延胡索酸可以减少23%的甲烷产量。毛胜勇等[24]发现，在不同日粮中添加4、7 mmol·L-1延胡索酸二钠能显著提高24 h累积产气量，降低甲烷产量。姜宇晨[7]也发现，硝酸钾和延胡索酸二钠组合互作在抑制甲烷效应上更佳。本试验体外添加硝酸钠和延胡索酸二钠混合物显著降低了瘤胃培养液24 h的总产气量和甲烷含量，甲烷含量下降约90.63%，与前人研究结果基本一致。本研究表明，体外添加硝酸钠和延胡索酸二钠混合物1 mg·mL-1表现出良好的甲烷抑制效果。
瘤胃VFA作为反刍动物的重要能量来源，其组成和比例的改变可反映瘤胃发酵模式和发酵程度的变化。在本试验中添加硝酸钠和延胡索酸二钠混合物显著降低了丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸浓度，显著升高了发酵液的pH，硝酸钠和延胡索酸二钠添加比例为2:1、1:1时丙酸和TVFA含量显著低于其他组。试验组的pH在6.73~6.88之间，均在瘤胃pH正常范围内(6.0~7.5)。已有体外研究表明，添加2 mmol·L-1硝酸钠能显著升高培养液pH[25]。Zhou等[9]研究发现，添加硝酸盐能降低48 h瘤胃体外发酵液中TVFA产量，提高了pH和乙酸/丙酸，发酵类型趋向于乙酸型。添加硝酸钠瘤胃液pH升高的原因主要是氨浓度的升高[25]和瘤胃液中VFA含量的降低[26]。另外延胡索酸二钠具有一定的缓冲作用，也可使瘤胃pH显著升高[27]。Jin等[28]研究发现，体外添加延胡索酸二钠增加了丙酸、戊酸和TVFA浓度，降低乙酸/丙酸，使发酵类型向丙酸方向转化。本试验中，随着硝酸钠和延胡索酸二钠添加比例的变化，发酵模式也随之变化，与以上他人研究结果趋势相同，两者各自对发酵类型的影响互相中和，但是硝酸钠对瘤胃VFA的影响要大于延胡索酸二钠，当硝酸钠和延胡索酸二钠添加比例为1:2时，TVFA产量和乙酸/丙酸与对照组没有显著性差异。
反刍动物瘤胃是一个大的微生物发酵系统，在经过长久的进化后，瘤胃微生物与反刍动物已成为互利共生的关系，而且瘤胃微生物能代谢脂肪酸从而影响反刍动物乳肉中的脂肪酸组成。脂肪酸生物氢化是在瘤胃中微生物影响下，不饱和脂肪酸通过加氢形成饱和脂肪酸。此过程主要是利用(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)NADH途径进行氢转移。硝酸盐在反刍动物瘤胃中以异化还原作用为主[29]，消耗氢和电子。之前有报道认为，硝酸盐作为氢电子受体被还原成氨的过程与甲烷菌利用氢电子生成甲烷的过程产生竞争，抑制了甲烷的产生[30]。延胡索酸是机体三羧酸循环中的重要中间产物，还原成琥珀酸的过程中能够提供电子接受外界的氢，所以延胡索酸可能会通过干扰电子的转移来影响甲烷产量和脂肪酸生物氢化。瘤胃中有多种细菌会影响脂肪酸生物氢化作用，其中丁酸弧菌属细菌起重要作用，溶纤维丁酸弧菌能氢化亚油酸和亚麻酸至CLA的中间产物TVA[31]，蛋白分解丁酸弧菌和亨氏丁酸弧菌可以实现TVA向C18:0的转化[32-33]。有研究者却认为，丁酸弧菌不影响脂肪酸生物氢化反应的进行[34]。在本试验中，体外添加硝酸钠和延胡索酸二钠混合物，甲烷产量显著降低，高剂量硝酸钠与低剂量延胡索酸二钠(2:1)混合添加时，瘤胃产甲烷菌和原虫数量显著降低，总细菌、真菌、溶纤维丁酸弧菌和蛋白分解丁酸弧菌数量也显著降低，硝酸钠和延胡索酸二钠比例为2:1和1:1时，CLA、EPA含量和UFA/SFA显著升高。也证实了硝酸钠通过抑制甲烷菌和原虫减少了甲烷生成，抑制大部分瘤胃微生物数量降低了总产气量，硝酸钠和延胡索酸二钠可能干扰氢转移促进了不饱和脂肪酸的形成。丁酸弧菌属细菌在脂肪酸生物氢化过程中起了重要作用，不过并非所有氢化细菌都参与了每一步反应，丁酸弧菌的不同菌株氢化不饱和脂肪酸的产物不同[35]。目前，关于添加硝酸盐和延胡索酸二钠对瘤胃发酵和微生物的影响结果并不一致，且体内和体外研究的结论也存在差异[36-37]。这可能是因为瘤胃发酵受较多因素影响，包括饲料类型、精粗比、底物形式、添加水平以及动物种类等[38]。本试验结果显示随着硝酸钠添加比例的增加，减少了VFA含量和瘤胃微生物数量，表明硝酸钠可能会抑制瘤胃发酵功能。王荣等[39]报道，硝酸钠能显著降低TVFA含量，可以通过中间体亚硝酸盐毒性参与抑制甲烷生成。硝酸钠还具有抑菌功能，可能抑制瘤胃微生物活性[20]。随着体外延胡索酸二钠添加比例的增加，可以缓解硝酸钠对VFA和瘤胃微生物的抑制作用，硝酸钠和延胡索酸二钠添加比例为2:1时对TVFA含量和瘤胃微生物数量无显著影响，使瘤胃处于一个相对较好的发酵状态，但是甲烷的抑制效果没有减弱。因为体内和体外试验存在一定差异，今后有必要进行动物饲养试验，以获取更实用的定量参数。
4 结论体外法添加不同比例硝酸钠和延胡索酸二钠混合物均可显著降低水牛甲烷产量，降幅平均90.63%，硝酸钠和延胡索酸二钠添加比例为2:1和1:1时，虽然能显著升高EPA、CLA含量和UFA/SFA，优化脂肪酸组成，但减少了VFA含量和瘤胃微生物数量，硝酸钠和延胡索酸二钠添加比例为1:2时，对TVFA含量和瘤胃微生物数量无显著影响，表明延胡索酸二钠可以缓解硝酸钠对瘤胃发酵的不利影响。
| [1] |
王荣, 王敏, 邓近平, 等.硝酸钠对奶牛瘤胃氢气、发酵模式和甲烷排放量的影响[C]//中国畜牧兽医学会动物营养学分会第十二次动物营养学术研讨会论文集.武汉: 中国畜牧兽医学会动物营养学分会, 2016: 1.
WANG R, WANG M, DENG J P, et al.Effects of sodium nitrate on rumen hydrogen, fermentation mode and methane emission of dairy cows[C]//Proceedings of the 12th Animal Nutrition Academic Seminar of Animal Nutrition Branch of China Society of Animal Husbandry and Veterinary Medicine.Wuhan: Animal Nutrition Branch of China Society of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2016: 1.(in Chinese) |
| [2] | ENGEL C A R, STRAATHOF A J J, ZIJLMANS T W, et al. Fumaric acid production by fermentation[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 78(3): 379–389. |
| [3] |
周亚文, 张玉杰, 林波, 等. 瘤胃甲烷生成过程中微生物之间的相互关系[J]. 动物营养学报, 2011, 23(4): 556–562.
ZHOU Y W, ZHANG Y J, LIN B, et al. Microbial interactions in ruminal methanogenesis[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2011, 23(4): 556–562. (in Chinese) |
| [4] | YU C W, CHEN Y S, CHENG Y H, et al. Effects of fumarate on ruminal ammonia accumulation and fiber digestion in vitro and nutrient utilization in dairy does[J]. J Dairy Sci, 2010, 93(2): 701–710. DOI: 10.3168/jds.2009-2494 |
| [5] | BEAUCHEMIN K A, MCGINN S M. Methane emissions from beef cattle:effects of fumaric acid, essential oil, and canola oil[J]. J Anim Sci, 2006, 84(6): 1489–1496. DOI: 10.2527/2006.8461489x |
| [6] | IWAMOTO M, ASANUMA N, HINO T, et al. Effects of nitrate combined with fumarate on methanogenesis, fermentation, and cellulose digestion by mixed ruminal microbes in vitro[J]. Nihon Chikusan Gakkaiho, 1999, 70(6): 471–478. DOI: 10.2508/chikusan.70.471 |
| [7] |
姜宇晨.硝酸钾和延胡索酸二钠联合使用对绵羊瘤胃发酵、甲烷生成和免疫功能的影响[D].呼和浩特: 内蒙古农业大学, 2019.
JIANG Y C.Effects of combination of potassium nitrate and disodium fumarate on rumen fermentation, methane production and immune function in sheep[D].Hohhot: Inner Mongolia Agricultural University, 2019.(in Chinese) |
| [8] | MENKE K H, RAAB L, SALEWSKI A, et al. The estimation of the digestibility and metabolizable energy content of ruminant feeding stuffs from the gas production when they are incubated with rumen liquor in vitro[J]. J Agric Sci, 1979, 93(1): 217–222. DOI: 10.1017/S0021859600086305 |
| [9] | ZHOU Z M, MENG Q X, YU Z T. Effects of methanogenic inhibitors on methane production and abundances of methanogens and cellulolytic bacteria in in vitro ruminal cultures[J]. Appl Environ Microbiol, 2011, 77(8): 2634–2639. DOI: 10.1128/AEM.02779-10 |
| [10] |
胡伟莲, 王佳堃, 吕建敏, 等. 瘤胃体外发酵产物中的甲烷和有机酸含量的快速测定[J]. 浙江大学学报:农业与生命科学版, 2006, 32(2): 217–221.
HU W L, WANG J K, LÜ J M, et al. Rapid gas chromatogram determination of methane, organic acid in in vitro ruminal fermentation products[J]. Journal of Zhejiang University:Agriculture & Life Sciences, 2006, 32(2): 217–221. (in Chinese) |
| [11] |
鲁秋英.日粮淀粉/FNDF比例对高产奶牛瘤胃液、血液、乳液和粪便相关代谢指标影响的调查研究[D].呼和浩特: 内蒙古农业大学, 2014.
LU Q Y.Effects of different ratios of dietary starch to neutral detergent fiber on Rumen blood, milk and feces metabolism status in high producing lactating cows[D].Hohhot: Inner Mongolia Agricultural University, 2014.(in Chinese) |
| [12] | LI X Z, YAN C G, CHOI S H, et al. Effects of addition level and chemical type of propionate precursors in dicarboxylic acid pathway on fermentation characteristics and methane production by rumen microbes in vitro[J]. Asian-Australas J Anim Sci, 2009, 22(1): 82–89. DOI: 10.5713/ajas.2009.80413 |
| [13] | XU T L, TAO H, CHANG G J, et al. Lipopolysaccharide derived from the rumen down-regulates stearoyl-CoA desaturase 1 expression and alters fatty acid composition in the liver of dairy cows fed a high-concentrate diet[J]. BMC Vet Res, 2015, 11(1): 52. DOI: 10.1186/s12917-015-0360-6 |
| [14] | DENMAN S E, MCSWEENEY C S. Development of a real-time PCR assay for monitoring anaerobic fungal and cellulolytic bacterial populations within the rumen[J]. FEMS Microbiol Ecol, 2006, 58(3): 572–582. |
| [15] | SHINGFIELD K J, KAIRENIUS P, ÄRÖLÄ A, et al. Dietary fish oil supplements modify ruminal biohydrogenation, alter the flow of fatty acids at the omasum, and induce changes in the ruminal Butyrivibrio population in lactating cows[J]. J Nutr, 2012, 142(8): 1437–1448. DOI: 10.3945/jn.112.158576 |
| [16] | ZOETENDAL E G, AKKERMANS A D L, DE VOS W M. Temperature gradient gel electrophoresis analysis of 16S rRNA from human fecal samples reveals stable and host-specific communities of active bacteria[J]. Appl Environ Microbiol, 1998, 64(10): 3854–3859. DOI: 10.1128/AEM.64.10.3854-3859.1998 |
| [17] | DEMAN S E, TOMKINS N W, DEMAN S E, et al. Quantitation and diversity analysis of ruminal methanogenic populations in response to the antimethanogenic compound bromochloromethane[J]. FEMS Microbiol Ecol, 2007, 62(3): 313–322. DOI: 10.1111/j.1574-6941.2007.00394.x |
| [18] | STEVENSON D M, WEIMER P J. Dominance of Prevotella and low abundance of classical ruminal bacterial species in the bovine rumen revealed by relative quantification real-time PCR[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 75(1): 165–174. |
| [19] |
刘丽英.饲草型全混日粮的评价及配方筛选[D].呼和浩特: 内蒙古农业大学, 2011.
LIU L Y.Evaluation and formulation screening of forage type total mixed rations[D].Hohhot: Inner Mongolia Agricultural University, 2011.(in Chinese) |
| [20] | PATRA A K, YU Z T. Combinations of nitrate, saponin, and sulfate additively reduce methane production by rumen cultures in vitro while not adversely affecting feed digestion, fermentation or microbial communities[J]. Bioresour Technol, 2014, 155: 129–135. DOI: 10.1016/j.biortech.2013.12.099 |
| [21] | PATRA A K, YU Z T. Effective reduction of enteric methane production by a combination of nitrate and saponin without adverse effect on feed degradability, fermentation, or bacterial and archaeal communities of the rumen[J]. Bioresour Technol, 2013, 148: 352–360. DOI: 10.1016/j.biortech.2013.08.140 |
| [22] | NGUYEN S H, LI L, HEGARTY R S. Effects of rumen protozoa of Brahman heifers and nitrate on fermentation and in vitro methane production[J]. Asian-Australas J Anim Sci, 2016, 29(6): 807–813. |
| [23] | ZHOU Z M, YU Z T, MENG Q X. Effects of nitrate on methane production, fermentation, and microbial populations in in vitro ruminal cultures[J]. Bioresour Technol, 2012, 103(1): 173–179. DOI: 10.1016/j.biortech.2011.10.013 |
| [24] |
毛胜勇, 王新峰, 朱伟云. 体外法研究延胡索酸二钠对瘤胃微生物发酵活力及甲烷产量的影响[J]. 草业学报, 2010, 19(2): 69–75.
MAO S Y, WANG X F, ZHU W Y. Effects of disodium fumarate on in vitro methane production and fermentation of rumen microbial[J]. Acta Prataculturae Sinica, 2010, 19(2): 69–75. (in Chinese) |
| [25] |
刘丽慧, 刘宝龙, 崔宏晓, 等. 梯度添加硝酸盐或硫酸盐对瘤胃体外发酵和总菌数量的影响[J]. 家畜生态学报, 2017, 38(8): 29–34.
LIU L H, LIU B L, CUI H X, et al. Effects of gradient addition of nitrate and sulfate on rumen fermentation and total bacteria count in vitro[J]. Acta Ecologiae Animalis Domastici, 2017, 38(8): 29–34. (in Chinese) |
| [26] |
孙雨坤, 闫晓刚, 班志彬, 等. 硝酸盐对肉牛甲烷产量和生长性能的影响[J]. 中国农业大学学报, 2017, 22(7): 54–60.
SUN Y K, YAN X G, BAN Z B, et al. Effect of nitrate on the methane production and productivity of cattle[J]. Journal of China Agricultural University, 2017, 22(7): 54–60. (in Chinese) |
| [27] |
赖瀚卿, 刘云芳, 雷晓萍, 等. 延胡索酸二钠对断奶羔羊瘤胃发育及瘤胃发酵功能的影响[J]. 畜牧与兽医, 2016, 48(2): 36–40.
LAI H Q, LIU Y F, LEI X P, et al. Effects of dietary disodium fumarate on rumen development and rumen fermentation function in weaning lambs[J]. Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2016, 48(2): 36–40. (in Chinese) |
| [28] | JIN W, XUE C X, LIU J H, et al. Effects of disodium fumarate on in vitro rumen fermentation, the production of lipopolysaccharide and biogenic amines, and the rumen bacterial community[J]. Curr Microbiol, 2017, 74(11): 1337–1342. DOI: 10.1007/s00284-017-1322-y |
| [29] |
赵丽萍.硝酸盐对肉牛瘤胃发酵、微生物多样性、血液生化及抗氧化性能的影响[D].北京: 中国农业大学, 2015.
ZHAO L P.Effects of nitrate on rumen fermentation, microbe diversity, blood biochemical and antioxidative ability[D].Beijing: China Agricultural University, 2015.(in Chinese) |
| [30] | GUYADER J, TAVENDALE M, MARTIN C, et al. Dose-response effect of nitrate on hydrogen distribution between rumen fermentation end products:an in vitro approach[J]. Anim Prod Sci, 2016, 56(3): 224–230. DOI: 10.1071/AN15526 |
| [31] | KEPLER C R, HIRONS K P, MCNEILL J J, et al. Intermediates and products of the biohydrogenation of linoleic acid by Butyrinvibrio fibrisolvens[J]. J Biol Chem, 1966, 241(6): 1350–1354. |
| [32] | VAN DE VOSSENBERG J L C M, JOBLIN K N. Biohydrogenation of C18 unsaturated fatty acids to stearic acid by a strain of Butyrivibrio hungatei from the bovine rumen[J]. Lett Appl Microbiol, 2003, 37(5): 424–428. DOI: 10.1046/j.1472-765X.2003.01421.x |
| [33] | LI D, WANG J Q, BU D P. Ruminal microbe of biohydrogenation of trans-vaccenic acid to stearic acid in vitro[J]. BMC Res Notes, 2012, 5(1): 97. DOI: 10.1186/1756-0500-5-97 |
| [34] | YANG C J, MCKAIN N, MCCARTNEY C A, et al. Consequences of inhibiting methanogenesis on the biohydrogenation of fatty acids in bovine ruminal digesta[J]. Anim Feed Sci Technol, 2019, 254: 114189. DOI: 10.1016/j.anifeedsci.2019.05.012 |
| [35] | HALMEMIES-BEAUCHET-FILLEAU A, KAIRENIUS P, AHVENJRVI S, et al. Effect of forage conservation method on ruminal lipid metabolism and microbial ecology in lactating cows fed diets containing a 60:40 forage-to-concentrate ratio[J]. J Dairy Sci, 2013, 96(4): 2428–2447. DOI: 10.3168/jds.2012-6043 |
| [36] | MBIRIRI D T, CHO S, MAMVURA C I, et al. Effects of a blend of garlic oil, nitrate and fumarate on in vitro ruminal fermentation and microbial population[J]. J Anim Physiol Anim Nutr (Berl), 2017, 101(4): 713–722. DOI: 10.1111/jpn.12508 |
| [37] | ARIF M, SARWAR M, HAYAT Z, et al. Effect of supplementary sodium nitrate and sulphur on methane production and growth rates in sheep and goats fed forage based diet low in true protein[J]. J Anim Plant Sci, 2016, 26(1): 69–78. |
| [38] | LATHAM E A, ANDERSON R C, PINCHAK W E, et al. Insights on alterations to the rumen ecosystem by nitrate and nitrocompounds[J]. Front Microbiol, 2016, 7: 228. |
| [39] |
王荣, 谭利伟, 王敏, 等. 硝酸钠和2-溴乙烷磺酸钠对山羊体外瘤胃发酵甲烷、氢气和挥发性脂肪酸生成的影响[J]. 动物营养学报, 2015, 27(5): 1586–1595.
WANG R, TAN L W, WANG M, et al. Effect of sodium nitrate and 2-bromoethanesulphonate on Methane, hydrogen and volatile fatty acids production of in vitro ruminal fermentation[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2015, 27(5): 1586–1595. (in Chinese) |