2. 江苏农牧科技职业学院动物医学院, 泰州 225300
2. Department of Animal Medicine, Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College, Taizhou 225300, China
慢性肾衰竭(chronic renal failure，CRF)是犬猫最常见的肾疾病，是犬的第三大致死因素，北美兽医研究集团NAVRG调查数据显示，每年有5.2%的犬因慢性肾衰竭到宠物医院就诊[1]。近年来，该病发病率呈逐年上升趋势，且治疗成本高、并发症众多，严重者甚至可危及生命，已成为当今全球宠物行业关注的问题之一，对宠物诊疗业产生了严峻的挑战。如何进一步延缓疾病进展，延长患病宠物的寿命，提高患病宠物的生活质量以及减轻饲养者经济负担仍是亟待解决的问题。
动物胃肠道中大约有1013~1014个微生物，这些微生物与宿主相互作用并维持机体健康[2]。大量研究表明，人和鼠等动物的肠道菌群失衡与CRF的发生发展密切相关[3-4]，但在宠物犬中关于肠道菌群与CRF的相互作用机制尚不清楚，与CRF相关肠道微生物标记物的筛选以及重建肠道菌群平衡对CRF的治疗价值等方面研究亦较少。因此，本研究以肾动脉结扎法制作宠物犬CRF模型，通过高通量测序研究犬CRF不同时期肠道菌群的变化，分析CRF与健康对照犬肠道的差异菌群，筛选出CRF的肠道微生物标记物，并对差异菌群进行基因功能预测，旨在为宠物犬慢性肾衰竭的发生发展及诊断治疗提供新的思路。
1 材料与方法 1.1 试验动物试验动物为30只2岁左右的健康雄性贵宾犬(泰迪型)，体重为(7±1) kg，由江苏农牧科技职业学院宠物科技学院试验犬房提供，于温度、湿度恒定的动物房中适应饲养1个月，期间不使用任何抗生素。
1.2 试验设计按随机数字表将30只犬随机等分为慢性肾衰竭模型组(CRF)、假手术对照组(Sham)和健康对照组(HCG)，每组10只，CRF组动物均采取肾动脉结扎法制作慢性肾衰竭模型[5]，方法为：各试验动物按0.05 mL·kg-1肌肉注射846合剂进行麻醉后，常规打开腹腔，显露左肾，游离肾动脉分支，逐一结扎，只保留1/4~1/6的动脉供血，第二周切除右肾。假手术对照组动物只做腹腔打开手术，健康对照组不做任何处理。第4周末，检测CRF组每只犬血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)水平，二者升高提示造模成功，然后继续饲喂4周。整个试验过程所有犬进水及饮食均不受限制。
1.3 肾功能指标测定分别于试验前(记为第0天)、试验后第14、28、42和56天的早晨8点，空腹经头静脉采集各组试验犬的血液并制备血清，用M149928-全自动干式生化分析仪测定BUN和Scr含量。同时使用采尿杯收集尿液，用改良双缩脲法测定尿蛋白(UP)，用威特曼生物科技(南京)有限公司的试剂盒测定尿肌酐(UCr)，计算尿蛋白/肌酐(UP/C)比值。
1.4 肠道菌群16S rDNA高通量测序1.4.1 粪便采集 CRF组动物分别于试验前(第0天)、试验后第28天和试验末(第56天)的早晨，用无菌直肠棉拭子经生理盐水湿润后旋转插入肛门，于肛门隐窝处收集粪便，然后插入无菌管，-80 ℃保存，并在24 h内进行测序。采取相同方法于试验末(第56天)收集HCG和Sham组犬粪便。
1.4.2 粪便总DNA提取与PCR分析 称取无菌采集的粪便样100 mg，采用Qiagen DNA试剂盒按说明书提取总DNA，再以获得的细菌DNA为模板进行细菌16S rDNA的V3-V4可变区PCR扩增，上游引物F为5′-ACTCCTACGGGAGGCA-GCAG-3′，下游引物R为5′-GGACTACHVGGGT-WTCTAAT-3′。扩增程序为：95 ℃预变性10 min，92 ℃变性45 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，6个循环；92 ℃变性45 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；然后72 ℃扩展延伸10 min，4 ℃保存。采用生工生物工程(上海)股份有限公司的PCR产物纯化试剂盒对所得PCR产物进行纯化后，用于后续操作。
1.4.3 高通量测序及处理 使用NEB Next® UltraTM DNA Library Prep Kit for Illumina建库试剂盒进行文库构建, 构建好的文库经过Qubit定量和文库检测合格后, 使用Illumina Miseq PE 300平台进行Paired-end测序。测序数据经QIIME(version 1.9.1)进行去除接头序列、低复杂度序列和低质量序列的处理，得到高通量原始碱基序列，用RDF分类器将相似性大于97%的序列划分为一个分类操作单元(OTUs)，与GreenGene数据库进行比对，得到注释结果。
1.5 生物信息学分析用QIIME1.9.1[6]分析菌群α多样性(Chao1、Shannon)，β多样性运用Canoco5[7]进行主成分分析(PCA)，组间差异菌群用LEfSe分析[8]，根据菌种间相关性运用Cytoscape[9]进行菌群间互作网络分析。运用PICRUSt[10]预测菌群基因组功能，与KEGG数据库比对，计算KEGG通路后进行STAMP差异分析。用R语言分析菌差异群与Scr、BUN的相关性并绘制热图，利用差异菌群丰度进行主成分Logistic回归分析计算各样本菌群标志物综合指数(FMI)并绘制ROC曲线。
1.6 数据处理肾功能指标数据结果用“平均值±标准差”表示, 采用SPSS 22.0统计软件ANOVA程序单因素方差分析进行组间比较，组内比较采用重复测量资料方差分析。肠道菌群丰度比较采用Kruskal-Wallis检验，用Spearman分析相关性。P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 犬肾功能指标的变化通过图 1可以发现，CRF组Scr、BUN和UP/C(图 1a、b、c)逐渐升高，从试验后第28天开始明显升高，显著高于试验前(第0天)、HCG组和Sham组(P < 0.05)，随后继续升高，说明从第28天开始，CRF组宠物犬发生了慢性肾衰竭。根据CRF组第28天时Scr、BUN和UP/C值，参考国际肾病研究协会(IRIS)犬猫慢性肾病分级标准[11]，将CRF组10只犬分别归为慢性肾衰Ⅰ级(CRFⅠ)、慢性肾衰Ⅱ级(CRFⅡ)、慢性肾衰Ⅲ级(CRFⅢ)，分别为1只、6只和3只(图 1d)。
|
a.血清肌酐；b.血尿素氮；c.尿蛋白/肌酐比值；d.慢性肾衰分级。“#”表示CRF组内与试验前(0 d)相比P < 0.05;“*”表示与HCG和Sham组相比P < 0.05 a. Serum creatinine; b. Blood urea nitrogen; c. Urinary protein / creatinine ratio; d. Classification of chronic renal failure. "#" Means compared with pre-test (0 d) in CRF group P < 0.05. "*" Means compared with HCG and Sham groups P < 0.05 图 1 CRF、HCG和Sham组犬肾功能指标变化 Fig. 1 Changes of renal function indexes in CRF, HCG and Sham groups |
肠道菌群α多样性分析显示：与慢性肾衰竭发生前(CRF-0 d，CRF-28 d)、HCG和Sham组比较，慢性肾衰竭时(CRF-56 d)出现了Chao 1指数(P < 0.05，图 2a)、Shannon指数(P < 0.05，图 2b)显著降低现象。PCA分析发现，在肠道菌群各样本中，HCG和Sham组个体间离散程度较小，但与CRF组(56 d)个体间离散程度较大；CRF组不同时间段个体间的离散程度较容易区分，从0到28 d，再到56 d，样本个体有沿PCA1轴右移趋势(图 2c)。
|
a.Chao1指数；b.Shannon指数；c.PCA分析。*.P < 0.05 a.Chao 1 diversity; b.Shannon diversity; c. Principal component analysis. *.P < 0.05 图 2 肠道菌群多样性比较 Fig. 2 Comparison of intestinal flora diversity |
在门水平上(图 3a)，CRF组不同时期(CRF-0 d、CRF-28 d和CRF-56 d)与HCG组、Sham组的肠道菌群主要以拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)为主，但在不同组间有显著差异，主要表现为慢性肾衰时(CRF-56 d)拟杆菌门(P < 0.05)、变形杆菌门(P < 0.01)和放线菌门(P < 0.01)的相对丰度增加，厚壁菌门数量减少(P < 0.05)。在属水平上(图 3b)，各组丰度前20位菌属无显著变化，主要有普氏菌属(Prevotella)、拟杆菌属(Bacteroides)、梭杆菌属(Fusibacterium)和芽胞杆菌属(Bacillus)等。
|
a.门水平; b.属水平 a. Phylum level; b. Genus level 图 3 肠道菌群的构成 Fig. 3 Taxonomic summary of the gut microbiota |
对第56天CRF、HCG和Sham组肠道菌群进行LEfSe分析(LDA>2，图 4)发现，从菌群结构上看，CRF、HCG和Sham组之间存在明显差异。在CRF组中富集了20个物种，主要有变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、芽胞杆菌科(Bacteroidaceae)、放线杆菌科(Actinomycetaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、变形杆菌属(Proteus)、肠杆菌属(Enterobacter)、芽胞杆菌属(Bacillus)和涅斯捷连科氏菌属(Nesterenkonia)等。
|
图 4 LEfSe分析比较各组间差异菌群 Fig. 4 Differential gut bacterial determined by LEfSe analysis |
利用R语言对结果2.4中的差异菌群与Scr和BUN进行相关性分析，结果显示，这些菌群均与Scr呈正相关，大部分与BUN呈正相关(图 5a)。根据CRF发生与否，对这些菌群进一步进行主成分Logistic回归分析后，得到各样本的菌群标志物综合指数(FMI)并与Scr和BUN进行相关性分析。发现，FMI与Scr、BUN呈正相关，Spearman系数分别为0.788、0.657(图 5b、c)。在用ROC曲线建立的CRF预测模型中，可以看出，FMI作为CRF预测因子，其曲线下面积(AUC)显著高于假单胞菌属(Pseudomonas)、拟杆菌属(Bacteroides)和放线杆菌目(Actinomycetales)等以单一菌群作为微生物标志物的预测模型(图 5d、e)。
|
a.菌群与Scr、BUN相关性热图，+ P < 0.01, * P < 0.05；b.FMI与Scr相关性图；c.FMI与BUN相关性图；d.ROC曲线图；e.ROC曲线AUC图, *P < 0.05，**P < 0.01 a. Heatmap of correlation between microflora and Scr, BUN. +P < 0.01, *P < 0.05;b. Chart of correlation between FMI and Scr; c. Chart of correlation between FMI and BUN; d. ROC diagram; e.AUC of ROC diagram, *P < 0.05, **P < 0.01 图 5 差异菌群与CRF间的关系 Fig. 5 The relationship between differential microflora and CRF |
将第56天时CRF和HCG组的不同菌属间分别进行Cytoscape网络分析，可以发现，CRF组富集的菌属与其他菌属间呈负相关关系，且呈正相关关系菌属间网络密度较少(图 6a)，HCG组菌属间呈正相关关系网络密度较多，呈负相关的较少(图 6b)。表明，CRF组富集的菌属可以抑制其他菌属生长繁殖，HCG组菌属之间有更好地协作作用。
|
a.CRF-56d组；b.HCG组 a. CRF-56d group; b. HCG group 图 6 肠道菌群间互作网络关系图 Fig. 6 Interaction network diagram of intestinal microflora |
通过PICRUSt分析发现，试验后第56天时在KEGG L2水平，CRF与HCG组在代谢途径上存在明显差异(图 7)。CRF组菌群在氨基酸代谢、外源生物降解与代谢、运输和分解代谢、DNA转录、糖生物合成和代谢、细胞群落-原核生物和碳水化合物代谢等功能基因丰度表达显著高于HCG组(P < 0.01)，而在辅助因子和维生素代谢、萜类化合物和聚酮类化合物代谢、脂代谢、核苷酸代谢以及遗传信息处理过程中蛋白质翻译、折叠、分类、降解、复制与修复等方面参与度较低(P < 0.01)。
|
图 7 CRF-56d组与HCG组肠道菌群在KEGG L2水平代谢途径差异分析图 Fig. 7 Analysis chart of metabolic pathway difference between CRF-56d group and HCG group at KEGG L2 level |
在宠物临床上，由于不能同时间段收集到大量的犬CRF病例资料，导致粪便采样时间、粪便保存与运输条件等方面可能有所不同，会给肠道菌群16S rDNA测序结果带来偏差进而影响试验结果。为了保证测序结果的准确性，本研究采取了肾动脉结扎法制作犬CRF模型，在建模第28天时，CRF组Scr、BUN和UP/C等生化指标急剧升高，表明试验犬发生了慢性肾衰竭，且随后由于残留肾组织的代偿修复，这些指标上升幅度有所减缓，并且无试验动物死亡。与相关报道该法是一种简单、安全、有效和死亡率低的方法相一致[12]，可用于犬CRF的实验研究。
16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中，具有9个高变区域(V1-V9)和10个保守区域，高变区反映了物种间的特异性[13]。由于大小适中(约1.5 Kb左右)，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，而几乎所有已知细菌的16S rDNA碱基序列已被检测鉴定并且存入基因库，所以可以准确分析个体细菌与菌群[14]。因此，16S rDNA测序已经广泛应用于肠道微生物的多样性、物种组成、物种间相互作用关系以及细菌基因功能预测等方面的定性与定量研究[15]。
本研究发现，CRF患犬肠道菌群α多样性显著低于CRF初期与建模前，PCA分析将不同时间段样本明显区分开来，拟杆菌门、变形杆菌门和放线菌门细菌丰度增加。这些结果表明，宠物犬在CRF发生发展过程中，伴随着肠道菌群多样性变化。研究表明，在CRF时，血液中大量的肌酐和尿素可通过肠黏膜进入肠腔，改变肠道微生态环境，这种变化可能不利于大部分肠道微生物生长繁殖，但含有肌酐水解酶或脲酶的细菌，可以利用肌酐或尿素为它们生长繁殖提供便利条件[16]。而且这些菌群在水解尿素时，增加了肠内pH，可进一步抑制专性厌氧菌生长[17]。LEfSe分析发现，CRF组富集了20个物种，大部分含肌酐水解酶或脲酶，物种丰度与Scr、BUN呈正相关，与其他肠道菌群呈负相关关系，也支持了上述观点。因此，可以推测，肠道微环境变化可能是导致CRF宠物犬肠道菌群多样性发生变化的主要原因。而且，CRF犬肠道菌群在氨基酸代谢、糖生物合成和代谢及碳水化合物代谢等方面表现更为活跃，这可能会导致营养物质利用异常、尿毒症毒素产物增加等，加剧CRF进程。
目前，寻找疾病的肠道微生物标志物已成为热点并取得显著成果[18-20]，Clos-Garcia等[21]发现，肠道微生物标志物对纤维肌痛疾病的预测能力好于其它生物标志物。而本研究显示，CRF组富集的20种差异菌群丰度与CRF有良好的正相关关系，但鉴于多种因素与肠道微生物有关，单一或几个菌群作为标记物可能会产生偏差。本研究将这20种菌群通过主成分Logistic回归分析建立了每个样本的FMI并将其视为标记物后，发现FMI与Scr、BUN的相关性高于单个菌群，其ROC曲线的AUC较大。表明，FMI可以更好地用于CRF的预测。
本研究尚有局限性：微生物标记物仅在犬试验性CRF病例中得出，在现实病例中的可靠性有待进一步验证，今后将进行大规模前瞻性研究，以探索这些细菌作为犬CRF微生物标记物的可靠性和实用性。另外，仅对CRF患犬肠道菌群基因功能进行了预测，这些差异菌群基因所表达的代谢产物是否可影响CRF的发生发展以及作用机制，也将是一个值得期待的研究。
4 结论慢性肾衰竭可以导致宠物犬肠道菌群的多样性、组成、菌群间相互作用关系以及基因功能的改变，且与健康犬有差异的菌群可用来预测CRF疾病。
| [1] | POLZIN D J. Chronic kidney disease in small animals[J]. Vet Clin North Am Small Anim Pract, 2011, 41(1): 15–30. DOI: 10.1016/j.cvsm.2010.09.004 |
| [2] |
陈双双, 司华哲, 李光玉, 等. 动物肠道菌群与营养物质代谢的研究进展[J]. 饲料工业, 2018, 39(2): 33–36.
CHEN S S, SI H Z, LI G Y, et al. Research progress of animal gut microbiota and nutrient metabolism[J]. Feed Industry, 2018, 39(2): 33–36. (in Chinese) |
| [3] | YANG T, RICHARDS E M, PEPINE C J, et al. The gut microbiota and the brain-gut-kidney axis in hypertension and chronic kidney disease[J]. Nat Rev Nephrol, 2018, 14(7): 442–456. DOI: 10.1038/s41581-018-0018-2 |
| [4] | NISHIYAMA K, AONO K, FUJIMOTO Y, et al. Chronic kidney disease after 5/6 nephrectomy disturbs the intestinal microbiota and alters intestinal motility[J]. J Cell Physiol, 2019, 234(5): 6667–6678. DOI: 10.1002/jcp.27408 |
| [5] |
王宁, 李宁, 陈洋. 肾动脉结扎法制作慢性肾功能衰竭犬模型方法的探索[J]. 中国医科大学学报, 2016, 35(2): 221.
WANG N, LI N, CHEN Y. Chronic renal failure model in canines by ligation of the renal artery branches[J]. Journal of China Medical University, 2016, 35(2): 221. (in Chinese) |
| [6] | CAPORASO J G, KUCZYNSKI J, STOMBAUGH J, et al. QⅡME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J]. Nat Methods, 2010, 7(5): 335–336. DOI: 10.1038/nmeth.f.303 |
| [7] | MORRIS C. Multivariate analysis of ecological data Using Canoco 5, 2nd edition[J]. Afr J Range For Sci, 2015, 32(4): 289–290. DOI: 10.2989/10220119.2015.1015053 |
| [8] | SEGATA N, IZARD J, WALDRON L, et al. Metagenomic biomarker discovery and explanation[J]. Genome Biol, 2011, 12(6): R60. DOI: 10.1186/gb-2011-12-6-r60 |
| [9] | OTASEK D, MORRIS J H, BOUÇAS J, et al. Cytoscape Automation:empowering workflow-based network analysis[J]. Genome Biol, 2019, 20(1): 185. DOI: 10.1186/s13059-019-1758-4 |
| [10] |
徐帅, 林奕岑, 周梦佳, 等. 基于高通量测定肉鸡回肠微生物多样性及PICRUSt基因预测分析[J]. 动物营养学报, 2016, 28(8): 2581–2588.
XU S, LIN Y C, ZHOU M J, et al. Analyzing of ileum microbial diversity of chickens by high-throughput sequencing and PICRUSt predicted[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(8): 2581–2588. (in Chinese) |
| [11] | BOYD L M, LANGSTON C, THOMPSON K, et al. Survival in cats with naturally occurring chronic kidney disease (2000-2002)[J]. J Vet Intern Med, 2008, 22(5): 1111–1117. DOI: 10.1111/j.1939-1676.2008.0163.x |
| [12] |
肖炜, 马云, 傅江南. 慢性肾衰动物模型方法学研究现状[J]. 中国实验动物学杂志, 2002, 12(3): 176–179.
XIAO W, MA Y, FU J N. Present study condition of the methodology on CRF animal model[J]. Chinese Journal of Laboratory Animal Science, 2002, 12(3): 176–179. (in Chinese) |
| [13] |
孙翠丽, 张阁, 程汝佳, 等. 16S rRNA高通量测序方法检测羊圈空气微生物群落结构及多样性[J]. 畜牧兽医学报, 2017, 48(7): 1314–1322.
SUN C L, ZHANG G, CHENG R J, et al. Microbial community structure and diversity of sheepfold atmosphere by 16S rRNA high-throughput sequencing[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2017, 48(7): 1314–1322. (in Chinese) |
| [14] | ARCHER S D J, MCDONALD I R, HERBOLD C W, et al. Benthic microbial communities of coastal terrestrial and ice shelf Antarctic meltwater ponds[J]. Front Microbiol, 2015, 6: 485. |
| [15] | CHEN Y F, YANG F L, LU H F, et al. Characterization of fecal microbial communities in patients with liver cirrhosis[J]. Hepatology, 2011, 54(2): 562–572. DOI: 10.1002/hep.24423 |
| [16] | VAZIRI N D, ZHAO Y Y, PAHL M V. Altered intestinal microbial flora and impaired epithelial barrier structure and function in CKD:the nature, mechanisms, consequences and potential treatment[J]. Nephrol Dial Transplant, 2016, 31(5): 737–746. DOI: 10.1093/ndt/gfv095 |
| [17] |
蒋哲峰, 蒋云生, 林霞, 等. 肾衰状态下肠道细菌对肌酐和尿素清除的影响[J]. 中国医师杂志, 2017, 9(10): 1345–1347.
JIANG Z F, JIANG Y S, LIN X, et al. Effects of urea and creatinine clearing with intestinal bacteria in renal failure[J]. Journal of Chinese Physician, 2017, 9(10): 1345–1347. (in Chinese) |
| [18] | SITKIN S I, TKACHENKO E I, VAKHITOV T Y. Metabolic dysbiosis of the gut microbiota and its biomarkers[J]. Eksp Klin Gastroenterol, 2016, 12(12): 6–29. |
| [19] | LUN H Z, YANG W H, ZHAO S P, et al. Altered gut microbiota and microbial biomarkers associated with chronic kidney disease[J]. Microbiologyopen, 2019, 8(4): e00678. DOI: 10.1002/mbo3.678 |
| [20] | REN Z G, LI A, JIANG J W, et al. Gut microbiome analysis as a tool towards targeted non-invasive biomarkers for early hepatocellular carcinoma[J]. Gut, 2019, 68(6): 1014–1023. DOI: 10.1136/gutjnl-2017-315084 |
| [21] | CLOS-GARCIA M, ANDRÉS-MARIN N, FERNÁNDEZ-EULATE G, et al. Gut microbiome and serum metabolome analyses identify molecular biomarkers and altered glutamate metabolism in fibromyalgia[J]. EBioMedicine, 2019, 46: 499–511. DOI: 10.1016/j.ebiom.2019.07.031 |