图 1(Fig. 1)
表 1(Table 1)
马链球菌兽疫亚种烯醇化酶对小鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能的影响
引用本文
陈楷文, 华承薇, 袁宸, 潘飞, 蔺辉星, 范红结, 马喆. 马链球菌兽疫亚种烯醇化酶对小鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2020, 51(10): 2576-2583.
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马链球菌兽疫亚种烯醇化酶对小鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能的影响
南京农业大学动物医学院, 南京 210095
摘要：旨在研究马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi ssp.zooepidemicus，SEZ）烯醇化酶（enolase，Eno）对小鼠肺泡巨噬细胞（RAW264.7）吞噬能力的影响。通过构建原核表达质粒获得重组烯醇化酶（rEno），采用台盼蓝活细胞计数法，判定在不同处理浓度和时间下rEno蛋白对RAW264.7细胞的细胞毒性。将rEno蛋白与RAW264.7细胞共孵育后，用SEZ作用于细胞并检测细胞吞菌数量，判断RAW264.7细胞对SEZ的吞噬活性。进一步通过活细胞稳定同位素标记技术（SILAC）和蛋白质谱分析技术（LC-MS/MS），筛选到RAW264.7细胞中可能与SEZ Eno存在相互作用的候选蛋白。结果发现，10 μg·mL-1 rEno蛋白处理对RAW264.7细胞有明显的细胞毒性，且10 μg·mL-1 rEno蛋白处理RAW264.7细胞2和4 h可显著抑制其对SEZ的吞噬作用（P < 0.01、P < 0.05）。初步筛选到RAW264.7细胞中动力蛋白激活蛋白亚单位蛋白（dynactin subunit protein 2，Dctn）、整合素α-M蛋白（integrin alpha-M）等17种可能与Eno发生互作的蛋白。本研究获得了rEno重组表达蛋白，发现rEno可减少RAW264.7细胞对SEZ的吞噬，互作蛋白的初步筛选也为进一步揭示Eno在SEZ抗吞噬中的作用机制奠定了基础。
关键词：马链球菌兽疫亚种 烯醇化酶 RAW264.7细胞 吞噬作用 蛋白互作
Effects of Enolase of Streptococcus equi ssp. zooepidemicus on Phagocytic Functions of Alveolar Macrophages in Mice
College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: To investigate the effect of enolase (Eno) of Streptococcus equi ssp. zooepidemicus (SEZ) on phagocytosis of mouse alveolar macrophages (RAW264.7). Recombinant enolase (rEno) was obtained by constructing prokaryotic expression plasmid, and the cytotoxicity of rEno protein on RAW264.7 cell proliferation was determined by trypan-blue living cell count method. After the rEno protein was incubated with RAW264.7 cells, SEZ was applied to the cells and the quantity of bacteria being phagocytosed was detected to determine the phagocytic activity of RAW264.7 cells. Further, candidate proteins that might interact with SEZ Eno in RAW264.7 cells were screened by live cell stable isotope labeling (SILAC) and protein spectrum analysis (LC-MS/MS). It was found that protein treatment (rEno, 10 μg·mL-1) had significant cytotoxic effects on RAW264.7 cells. Treatment of RAW264.7 cells with 10.0 μg·mL-1 rEno protein for 2 and 4 hours could significantly inhibit the phagocytosis of RAW264.7 cells (P < 0.01, P < 0.05). In RAW264.7 cells, dynactin subunit protein 2 (Dctn), integrin alpha-M and about 17 proteins that might interact with Eno were preliminarily identified as rEno interaction proteins. The rEno recombinant expression protein was obtained in this study, and it could reduce the phagocytosis of RAW264.7 cells to SEZ. Preliminary screening of interacting proteins also laid a foundation for further revealing the mechanism of Eno in the anti-phagocytosis of SEZ.
Key words:
SEZ enolase RAW264.7 cell phagocytosis interactions between protein
马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp. zooepidemicus，SEZ)是引起猪链球菌病的主要病原之一，可感染猪、马等牲畜，引起宿主的败血症、脑膜炎、心内膜炎以及关节炎等，严重感染可导致死亡，人类食用被该菌污染的食物或者与患病动物有密切接触也可能被感染[1-3]。已知SEZ主要毒力因子有类M蛋白、透明质酸及荚膜等[4-6]。这些毒力因子在细菌感染、侵袭以及抵抗机体吞噬的过程中起着重要的作用[7-9]。随着技术的革新，更多原来忽视的SEZ毒力因子被挖掘出来，其中就包括烯醇化酶(enolase, Eno)。
烯醇化酶是一种糖代谢酶，主要参与细胞糖酵解代谢，在原核生物中以八聚体的形式存在[10]，其羧基端赖氨酸残基和氨基端部分区域都是关键的纤溶酶原(plasminogen)结合位点[11]。细菌的Eno在许多生理和病理过程中都发挥着重要作用[12]，可参与病原菌对宿主的定植及侵袭，通过结合纤溶酶原等方式帮助细菌伪装，以逃避免疫系统的清除[13-14]。霍春明等[15]在血液杀菌模型中通过抗体阻断法分析了猪链球菌重组烯醇酶(SsEno)对吞噬作用的影响，发现SsEno可特异性结合人纤维蛋白原(hFg)，与免疫前对照血清相比，SsEno抗血清调理后猪链球菌在血清中的存活率显著降低，初步说明SsEno是猪链球菌潜在的抗吞噬因子。Agarwal等[16]发现，肺炎球菌链烯醇化酶可与纤溶酶原、C4b结合蛋白(C4BP)结合，帮助肺炎链球菌逃避补体识别与攻击。Mori等[17]发现，肺炎链球菌的α-烯醇化酶剂量依赖性地增加了人嗜中性粒细胞的胞外乳酸脱氢酶的释放，有细胞毒性，并通过释放嗜中性粒细胞胞外杀菌网络(neutrophil extracellular traps)诱导嗜中性粒细胞的死亡，且嗜中性粒细胞表面的成肌细胞抗原24.1D5 (myoblast antigen 24.1D5)与肺炎链球菌的α-烯醇酶有结合作用。尚未有研究表明SEZ Eno是否与SEZ抗吞噬有关。本实验室发现，SEZ释放到环境中的Eno可以侵入或黏附宿主细胞，但是后续对宿主细胞表型有何影响尚未可知[18]。推测Eno可能在SEZ抗细胞吞噬功能上发挥一定作用。
本研究前期发现，SEZ Eno对RAW264.7细胞有一定的细胞毒性且可抑制其对SEZ的吞噬功能，为进一步揭示Eno参与SEZ抗吞噬的机制，本研究利用细胞稳定同位素记技术(SILAC)和蛋白质谱分析技术(LC-MS/MS)从RAW264.7细胞中筛选获得一批可能与SEZ Eno之间存在相互作用关系的蛋白，并首次发现SEZ Eno对巨噬细胞有细胞毒性作用，可能通过影响巨噬细胞活性帮助细菌逃逸吞噬细胞的吞噬。
1 材料与方法 1.1 主要材料1.1.1 细胞及菌株 RAW264.7细胞株、SEZ ATCC35246株和HEK293T细胞购自美国国家标准品保藏中心(ATCC)；表达菌株E.coli (DE3)BL21和大肠杆菌DH5α购自唯地生物。
1.1.2 试验试剂 基因组提取试剂盒(MasterPureTM Gram Positive DNA Purification Kit)购自Epicentre公司；质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自Omega公司；DL2000 DNA Marker、荧光定量试剂盒(SYBR Green Mixture)购自VazymeTM公司；HisTrapTMHP (5 mL)镍柱、KTA Pure蛋白质层析纯化系统购自GE Healthcare公司；卡那霉素、青霉素、庆大霉素及IPTG购自都莱生物公司；同位素标记氨基酸培养基(SILAC)、DMEM高糖营养液、Opti-MEM、胎牛血清等购自Gibco公司；哺乳动物细胞裂解液(Mammalian Protein Extraction Reagent)、BCA蛋白定量试剂盒(PierceTM BCA Protein Assay Kit)、Qubit检测试剂盒、去内毒素试剂盒(Pierce Hight-Capacity Endotoxin Removal Resin)和Page RulerTM预染蛋白Marker购自Thermo公司；各种限制性内切酶、DNA polymerase、PrimeSTAR和Taq DNA聚合酶等购自TaKaRa公司；内毒素检测鲎试剂盒购自厦门鲎试剂生物科技股份有限公司；台盼蓝试剂购自Sciencell公司；考马斯亮蓝染色液购自钟鼎生物。
1.2 rEno融合蛋白的获得1.2.1 pET-28a-Eno原核表达载体的构建 参照NCBI Genbank中SEZ ATCC35246 Eno序列，用Snapgene软件设计一对扩增引物：Eno-28a-F：5′-ATGGGTCGCGGATCCGAATTCCATGTCA-ATTACTGATGTTTACGCT-3′/Eno-28a-R:5′-G-TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTAAGGTT-GTAGAATGATTT-3′，委托金斯瑞公司合成引物。按照基因组提取试剂盒方法提取SEZ ATCC35246基因组作为PCR模板，用上述引物对目的基因Eno片段进行扩增。用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，并用胶回收试剂盒进行回收。回收片段经双酶切(EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ)后与同样酶切处理的pET-28a载体连接过夜。连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，接种含50 μg·mL-1卡那霉素的LB固体培养基，37 ℃倒置培养过夜。次日，挑取单克隆菌落，转接含同样浓度卡那霉素的LB液体培养基，于37 ℃，180 r·min-1振荡培养至对数生长期，进行PCR鉴定、测序(金斯瑞公司)及序列比对。
1.2.2 rEno融合蛋白诱导表达 使用质粒提取试剂盒提取pET-28a-Eno转化至E.coli (DE3)BL21。接种含50 μg·mL-1卡那霉素的LB固体培养基，37 ℃倒置培养过夜。次日，挑取单克隆菌落转接至含同样浓度卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃，180 r·min-1振荡培养至对数生长期(OD= 0.5~0.7)，添加IPTG至终浓度1 mmol·L-1，37 ℃，180 r·min-1避光振荡培养，诱导4 h后，10 000 r·min-1离心10 min，弃去上清，用Binding buffer(含Tris-HCl 10 mmol·L-1、NaCl 100 mmol·L-1、imidazole 20 mmol·L-1；pH=8.0)重悬沉淀，反复冻融3次，超声破碎菌体，10 000 r·min-1离心10 min，分离上清与沉淀。12%SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况。
1.2.3 rEno融合蛋白纯化及鉴定 按照GE Healthcare公司蛋白纯化步骤，利用HisTrapTMHP (5 mL)镍柱与KTA Pure蛋白质层析纯化系统，纯化上清融合蛋白，超滤浓缩，利用分子筛纯化柱再次纯化蛋白样品。使用去内毒素试剂盒去除纯化后蛋白中的内毒素，并用内毒素检测鲎试剂盒检测处理后蛋白内毒素含量。经12 % SDS-PAGE分离及考马斯亮蓝染色检测最终获得的蛋白样品，并用兔Anti-Eno多克隆抗体鉴定目的蛋白。使用Qubit检测试剂盒进行蛋白定量。
1.3 检测rEno对RAW264.7细胞的细胞毒性在24孔板中加入RAW264.7细胞500 μL每孔(约2×104个细胞)，置37 ℃、5% CO2细胞培养箱用含有培养10%胎牛血清的DMEM培养基培养24 h。去除含有血清的培养基，结合前期预试验结果，分别加入含有浓度为0(对照组)、0.1、1.0和10.0 μg·mL-1的rEno的DMEM培养基500 μL，在37 ℃、5% CO2细胞培养箱与RAW264.7细胞共孵育2、6、12、18、24 h。每个处理浓度的不同时间处理组均设5个复孔，达到处理时间后，用DMEM培养基吹散洗脱细胞，将细胞悬液与台盼蓝溶液按体积比1:1混匀，加入血细胞计数板，镜下计数活细胞数，并使用非配对t检验的方法分析显著性。
1.4 检测rEno处理对RAW264.7细胞吞噬SEZ功能的影响按照上述方法用24孔板培养RAW264.7细胞24 h，将含有血清的培养基替换为含有浓度为10 μg·mL-1的rEno蛋白的DMEM培养基与RAW264.7细胞共孵育2、4 h，用DMEM培养基与RAW264.7细胞共孵育4 h作为空白对照组。各处理组及空白对照组均设5个复孔，去除处理液，每组用2个复孔进行台盼蓝活细胞计数，并于37 ℃条件下，以感染复数(multiplicity of infection，MOI)为1:10 SEZ作用于每组另外3个复孔的细胞，800 g离心10 min后，置37 ℃、5% CO2细胞培养箱作用1 h。将细菌处理液去除，使用无菌PBS溶液洗涤3次，使用庆大霉素与青霉素双抗性处理液(终浓度分别为100和5 μg·mL-1)继续置37 ℃、5% CO2细胞培养箱作用于上述细胞1 h，无菌PBS溶液洗涤3次，双蒸水裂解细胞，混匀裂解液，用无菌PBS溶液倍比稀释，涂布THY平板(无抗生素添加)，在37 ℃条件下倒置培养过夜，次日，计数细菌单菌落数量，使用非配对t检验的方法分析显著性，判定蛋白处理对细胞吞噬细菌活力的影响。
1.5 细胞稳定同位素标记技术(SILAC)筛选互作蛋白预先配置SILAC培养基，取等量稳定同位素标记的精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys)各50 mg，添加到500 mL培养基中，加入10%胎牛血清，并使用0.22 μm滤器过滤，于4 ℃备存。分别配制“轻”型(未添加上述等量稳定同位素标记的氨基酸)及“重”型(添加了上述等量稳定同位素标记的氨基酸)两种培养基传代培养RAW264.7细胞5~6代后，收取细胞蛋白质，经BCA蛋白定量试剂盒定量后，将样品等量混合并委托北京蛋白组学研究中心进行同位素标记效率分析。确认细胞中的蛋白质氨基酸已被同位素标记(98%以上)后，用PBS分别洗涤“轻”、“重”标记的RAW264.7细胞，再于冰上用哺乳动物细胞裂解液裂解细胞后，离心，弃去沉淀，收集“轻”、“重”型细胞总蛋白。随后将试验组(“重”型细胞总蛋白)与对照组(“轻”型细胞总蛋白)样品分别与rEno及28a标签蛋白进行互作，过夜，pull-down，洗脱，样品经BCA定量后，等量混合，送至北京蛋白组学研究中心进行质谱鉴定，并对质谱检测结果进行分析。
2 结果 2.1 rEno融合蛋白的获得将所构载体转化至E.coli DH5α感受态细胞后进行PCR鉴定，结果显示，在约2 000 bp处出现大小与预期一致的目的条带。回收产物进行测序，结果显示，插入序列与目的基因SEZ ATCC35246 Eno 100%同源, 表明目的片段完整、正确连接，表达载体构建成功并可用于后续研究。
使用IPTG诱导含有重组质粒的表达菌E.coli (DE3)BL21后，超声碎菌。将各样品分别进行SDS-PAGE检测。结果显示，重组质粒成功表达，分子量约为53 ku，且主要溶解分布在上清液的融合蛋白(图 1A)。超滤浓缩蛋白，通过亲和层析和分子筛纯化融合蛋白并用离心柱法去除内毒素，获得了大小与预期一致、纯度较高、浓度为486.3 μg·mL-1且内毒素含量低于1.0 EU·mL-1的重组Eno蛋白(图 1B)，用家兔Anti-Eno多克隆抗体进行Western blot检测，也可见与预期大小一致的目的条带(图 1C)，可用于进一步试验。
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A.超声破碎重组蛋白的SDS-PAGE分析; B.纯化后重组蛋白Eno；C. Western blot检测重组Eno蛋白结果。M.蛋白maker; 1.pET-28a-Eno诱导前；2. pET-28a-Eno诱导后；3. pET-28a-Eno诱导后上清液；4. pET-28a-Eno诱导后沉淀；5.超滤浓缩后重组Eno蛋白；6.去内毒素后的重组Eno蛋白；7.分子筛纯化重组Eno蛋白8.亲和层析纯化重组Eno蛋白；9~12.分子筛纯化后重组Eno蛋白样品 A. SDS-PAGE analysis of the recombinant protein after ultrasonication; B. The purified recombinant Eno protein; C. Western blot detection result of recombinant Eno protein. M. Protein marker; 1. pET-28a-Eno before induction; 2. pET-28a-Eno after induction; 3. Supernatant after pET-28a-Eno induction; 4. Precipitate after pET-28a-Eno induction; 5. Recombinant Eno protein after ultrafiltration concentration; 6. Recombinant Eno protein after endotoxin removal; 7. Molecular sieve purification of recombinant Eno protein; 8. Affinity chromatography purification of recombinant Eno protein; 9-12: Purification of recombinant Eno protein samples by molecular sieve 图 1 重组蛋白Eno的表达、纯化与鉴定 Fig. 1 Expression, purification and identification of recombinant Eno protein |
以0(对照组)、0.1、1.0、10.0 μg·mL-1浓度rEno蛋白分别处理RAW264.7细胞2、6、12、18和24 h后，进行细胞计数，将相同孵育时间的各处理组与对照组的细胞数相除计算比值，如图 2A、B所示，分析发现，0.1和1.0 μg·mL-1浓度的rEno处理对RAW264.7细胞的细胞毒作用较小。10.0 μg·mL-1浓度rEno处理有显著的细胞毒性作用，作用时间达到18 h时，此处理组的活细胞数不足对照组的一半。3个浓度处理后，镜下观察，细胞均未见明显表型变化。
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A. 0.1 μg·mL-1 rEno处理组; B. 1.0 μg·mL-1 rEno处理组; C. 10.0 μg·mL-1 rEno处理组。与同浓度蛋白处理2 h组比较，*:P < 0.05、**: P < 0.01、***:P < 0.001 A. 0.1 μg·mL-1 rEno treatment group; B. 1.0 μg·mL-1 rEno treatment group; C. 10.0 μg·mL-1 rEno treatment group. Compared with the group treated with the same concentration of protein for 2 h, *:P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001 图 2 不同浓度rEno对RAW264.7细胞的细胞毒性 Fig. 2 Cytotoxicity of rEno to RAW264.7 cells at different concentrations |
测得对照组和各处理组活细胞数及吞噬细菌数后，以每100个巨噬细胞为单位，计算每百个细胞吞噬的SEZ数量，如图 3所示，经统计学分析发现，与对照组相比，10.0 μg·mL-1浓度rEno蛋白处理RAW264.7细胞2、4 h后每100个细胞对SEZ的吞噬率分别表现为极显著降低(P < 0.01)和显著降低(P < 0.05)。其中，对照组的吞菌个数达到了rEno 2 h处理组的近2.5倍。
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Control代表纯DMEM处理细胞4 h空白对照组组；2和4分别代表rEno处理细胞2和4 h试验组。与对照组比较, *: P < 0.05、**:P < 0.01 Control represents a blank control group of cells treated with pure DMEM for 4 h; 2 and 4 represent the cells were treated with rEno at 2 and 4 h, respectively. Compared with the control group, *: P < 0.05, **: P < 0.01 图 3 rEno处理对RAW264.7细胞吞噬SEZ功能的影响 Fig. 3 Effect of rEno treatment on phagocytic SEZ function of RAW264.7 cells |
为了进一步探究Eno在SEZ抗吞噬过程中的机制，使用SILAC技术筛选RAW264.7细胞中可能与SEZ Eno发生互作的蛋白。根据LC-MS/MS原始数据搜索小鼠蛋白数据库，匹配到5 384种肽段，肽段数量长度主要分布在7~18个氨基酸长度之间，肽段长度合理，表明本试验数据质量较高；共匹配到1 334种蛋白，17%的蛋白质相对分子量大于100 ku，其余蛋白相对分子量分布在0~100 ku之间。蛋白序列覆盖率为0~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%、40%~100%的蛋白质分别占59.07%、23.09%、9.82%、4.12%、3.90%。分析结果均可靠可信，可以进行下一步试验。
参考Chen等[19]使用的方法，将“轻”、“重”型细胞裂解物以等量混合作为对照样本，进行LC-MS/MS阈值试验，规定H/L>1.08或 < -1.08视为蛋白差异蛋白，即蛋白与rEno存在相互作用。
通过SILAC技术结合LC-MS/MS质谱分析，共筛选到Dynactin subunit 2、Integrin alpha-M、Galectin-3、Gasdermin-D、Sorting nexin-6等约17种RAW264.7细胞内可能与SEZ Eno发生互作的蛋白(表 1)。
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表 1 SILAC筛选互作蛋白结果 Table 1 Interaction protein screening results by SILAC |
探究细菌蛋白是如何提升细菌抗吞噬细胞的吞噬能力，对于揭示细菌抵抗宿主天然免疫清除病原机制至关重要。本研究发现，rEno对于RAW264.7细胞具有细胞毒性，进一步观察rEno处理RAW264.7细胞对其吞菌能力的影响发现，rEno处理显著降低了RAW264.7对SEZ的吞噬率，同时，结合Eno可参与细胞凋亡、促进病原菌对宿主的侵入等功能推测，其可能参与SEZ抵抗宿主细胞吞噬防御机制，故进一步对巨噬细胞中可能与Eno存在相互作用的蛋白进行筛选。
本试验共筛选到17种RAW264.7细胞内与SEZ Eno蛋白可能存在相互作用的蛋白，并根据功能挑选出可能与Eno参与SEZ抗吞噬机制有关的蛋白。其中，整合素α-M蛋白和巨噬细胞、单核细胞的各种黏附相互作用有关，它还参与介导补体包衣颗粒的摄取[20-21]，当促炎或促刺激因子存在时，整合素α-M可促进中性粒细胞的凋亡[22], 推测SEZ Eno可能会通过与RAW264.7细胞中的整合素α-M蛋白互作，影响细胞的黏附能力或是加速细胞的凋亡进而影响其吞噬功能。由Gsdmdc基因编码的胃泌素D(gasdermin-D)的N末端可响应微生物感染和危险信号，从热凋亡细胞释放到细胞外环境，迅速结合并杀死革兰阴性和革兰阳性细菌[23-24]，SEZ Eno可能会与胃泌素D结合互作，一定程度上阻止了胃泌素D对感染信号的响应或降低对SEZ的杀伤作用，增加了RAW264.7细胞吞噬SEZ的难度。动力蛋白激活蛋白亚单位蛋白(Dctn)会与动力蛋白(Dynein)结合形成一种蛋白质复合物，可以沿微管逆向运输物质，对于细胞维持正常生理状态十分重要，Dctn蛋白还参与将微管锚定到中心体的过程，并在有丝分裂过程中起到前中期染色体排列和纺锤体组织的作用[25]，SEZ Eno可能会与动力蛋白竞争结合Dctn蛋白导致RAW264.7细胞胞内物质运输障碍、正常生理状态遭到破环。此外，本次筛选得到的半乳糖凝集素-3(galectin-3)是结合IgE的半乳糖特异性凝集素，可参与急性炎症反应，包括中性粒细胞活化和黏附、单核细胞巨噬细胞的趋化作用。
结合以上几种可能与SEZ Eno发生互作的真核细胞蛋白各自的功能，推测SEZ Eno蛋白可能是帮助SEZ在吞噬细胞内存活的关键分子，作用机制可能与Eno与RAW264.7细胞中的部分蛋白发生互作后加速了吞噬细胞的凋亡，影响了吞噬细胞的活化、黏附及物质运输等环节有关。根据现有报道，Eno在SEZ抗吞噬中的作用也可能与其纤溶酶原结合活性有关，但本次互作蛋白未筛选到纤溶酶原，可能是因为纤溶酶原主要存在于胞外，而本次筛选主要针对的是RAW264.7细胞的胞内蛋白。
4 结论综上所述，本研究首次发现了SEZ Eno影响巨噬细胞吞噬活性作用，其机制可能与SEZ Eno对RAW264.7细胞的细胞毒性作用有关，通过SILAC筛选出互作蛋白，为进一步揭示SEZ Eno产生细胞毒性作用及参与SEZ抗细胞吞噬的机制提供了试验基础。
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