2. 新疆农业大学动物医学学院, 乌鲁木齐 830052
, Huercha1,2, ZHAI Xuejie2, FAN Xinli2, LI Min2, ZHANG Mengyuan2, SONG Jingjing2, HAIRE Arman1
, KAMALI Wulijiang2, GAILIKE Bayinchahan2
2. College of Veterinary Medicine, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China
半胱氨酸蛋白酶(cystein protease，CP)是广泛存在于动、植物和寄生虫的一类含有半胱氨酸残基的生物蛋白水解酶[1]。半胱氨酸蛋白酶在寄生虫的生长发育中起着重要作用[2]，如在疟原虫侵入过程中释放[3]参与血红蛋白水解[4-5]，旋毛虫幼虫中可能参与在肌肉组织的入侵和移行[6]，弓形虫中参与调控凋亡和虫体分裂繁殖[7]。半胱氨酸蛋白酶不仅是寄生虫入侵组织的因子之一，另外在寄生虫的营养代谢、免疫逃避、毒力入侵、脱囊/成囊、出鞘和细胞、组织入侵和蜕皮等方面起重要作用[8-9]。此外，半胱氨酸蛋白酶还可作为血清学诊断的标记物、化学疗法和疫苗的候选分子[10-12]。
马梨形虫病是由马泰勒虫(Theileria equi)和/或驽巴贝斯虫(Babesia caballi)引起的蜱传血液原虫病[13]。目前，对马梨形虫CP的具体机制并不清楚，是否还具有其他功能也不清楚。由于CP全基因的表达存在一定困难，因此，本研究采用截短表达的策略，并选取CP抗原决定簇表位相对密集和包含半胱氨酸活性位点的片段进行截短表达。从T. equi和B. caballi 中克隆出CP截短基因，分别命名为T. equi-CP及B. caballi-CP，构建重组原核表达质粒、诱导表达蛋白和纯化，并测定其抗原性；以T. equi-CP和B. caballi-CP氨基酸序列为研究对象，采用生物信息学方法，对CP蛋白的理化特性、跨膜区、抗原性、信号肽、B细胞表位、T细胞表位和三级结构进行预测分析，旨在为CP蛋白的结构、功能研究和T. equi 及B. caballi 的入侵机制研究方面提供理论依据。期望为马梨形虫病的免疫诊断、疫苗研制和药物筛选提供潜在靶点，同时为其他寄生虫病的防治提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料马泰勒虫和马驽巴贝斯虫新疆流行虫株阳性DNA均由新疆农业大学动医学院寄生虫实验室提供。组织/全血DNA提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自美国OMEGA公司；限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、BL21(DE3)感受态细胞、pEASY-T1和T4连接酶购自日本TaKaRa公司；1 kb DNA Marker I(500-6000 bp)购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，Blue Plus®Ⅳ Protein Marker(10~180 ku)和ProteinRuler®Ⅱ(12~120 ku)购自北京全式金生物技术有限公司；DAB显色液(DA1010)购自北京索莱宝科技有限公司；pGEX-4T-1载体本实验室保存；其他常规试剂均为国产分析纯；所用水为超纯水。
1.2 引物设计与合成基于马泰勒虫(GenBank登录号XM_004832355.1)和马驽巴贝斯虫(GenBank登录号AF401283.1)半胱氨酸蛋白酶基因序列，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.24(绿色版英文)软件设计特异性PCR引物，引物序列信息如表 1。
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表 1 表达载体构建引物 Table 1 Primers used to construct expression vectors |
以马泰勒虫和马驽巴贝斯虫阳性全血DNA为模板，通过PCR技术对半胱氨酸蛋白酶基因进行扩增，扩增的PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳验证，并用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收。
1.4 表达载体的构建与鉴定将回收产物分别连接到pEASY-T1载体中，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落接种至含100 μg·mL-1氨苄青霉素的LB液体培养基，收集菌液进行测序。对重组质粒和pGEX-4T-1载体双酶切(BamHⅠ和EcoRⅠ)回收目的片段和空载体，用T4 DNA ligase于16 ℃过夜连接，测序和酶切验证正确的重组质粒pGEX-4T-1/T. equi-CP和pGEX-4T-1/B. caballi-CP转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
1.5 重组GST-T. equi-CP和GST-B. caballi-CP蛋白的诱导条件筛选及鉴定在含100 μg·mL-1氨苄青霉素的LB培养基(50 mL)小体积诱导，测定重组蛋白的表达情况。于37 ℃ 200 r·min-1下进行诱导时间(0、1、2、3、4、5、6和7 h)和诱导剂IPTG浓度(0.2、0.4、0.6、0.8和1.2 mmol·L-1)的最佳条件筛选，通过12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白质表达情况。
1.6 重组蛋白的纯化及其抗原性测定1.6.1 蛋白的纯化 根据尿素透析法[14]稍作改进，收集最佳诱导条件下菌体，沉淀经8 mol·L-1尿素(1/10 LB培养基体积)超声破碎(On 5 s，Off 8 s，Power 30%)变性后装入透析袋，置于不同尿素浓度(4、2、0 mol·L-1)的PBS缓冲液逐步透析复性。SDS-PAGE分析，用单滴分光计测定蛋白浓度，置于-80 ℃保存备用。
1.6.2 Dot blot分析 取5 μL重组蛋白样品(约5 μg蛋白含量)滴加于NC膜上，封闭液(5%脱脂奶，含0.5% Tween的PBS稀释)封闭1 h；分别加相应的马泰勒虫和驽巴贝斯虫阳性/阴性血清(1:100)于37 ℃反应1.5 h；加二抗(IgG-HRP山羊抗马)(1:1 000) 37 ℃孵育1 h。最后，向膜上均匀滴加DAB显色液，避光常温反应5 min，双蒸水终止反应，观察拍照。
1.7 系统进化树分析将克隆测序获得的T. equi和B. caballi半胱氨酸蛋白酶基因序列，应用GeneRuner软件将核苷酸序列翻译为对应的氨基酸序列，将氨基酸序列在NCBI中的Protein BLAST在线比对分析。筛选与CP同源基因或同物种CP基因整理并构建系统进化树，采用MEGA 6.0软件系统，基本参数：邻接法(Neighbor joining), Bootstrap值为1 000，伽马分布值设置为0.84，UPGMA和节点支持的统计方法[15]。
1.8 生物信息学分析运用生物信息学软件分析马泰勒虫和驽巴贝斯半胱氨酸蛋白酶的功能和结构：Prot Param软件(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白的理化性质、分子量及等电点等；软件TMHMM(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)预测蛋白的跨膜结构域；SignalP-5.0 Server软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析信号肽；利用在线分析软件Antibody Epitope Prediction(http://tools.immuneepitope.org/bcell/)分析B细胞表位；利用在线分析软件SYFPEITHII(http://www.syfpeithi.de/0-Home.htm)和ProPred(http://crdd.osdd.net/raghava/propred/)分析T细胞表位；利用在线分析软件EzMol2.1(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~ezmol/)构建蛋白的3D模型。
2 结果 2.1 GST-T. equi-CP和GST-B. caballi-CP重组质粒的构建对构建的重组质粒进行双酶切(BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ)验证，T. equi-CP和B. caballi-CP靶基因分别约为807和399 bp，结果如图 1所示。
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A.pGEX-4T-1/T. equi-CP重组质粒；B.pGEX-4T-1/B. caballi-CP重组质粒；M.DNA相对分子质量标准；1.酶切前；2.酶切后 A.pGEX-4T-1/T. equiCPrecombinant plasmid; B.pGEX-4T-1/B. caballi-CP recombinant plasmid; M.DNA marker; 1.Before enzyme cleavage; 2.After enzyme cleavage 图 1 GST-T. equi-CP (A)和GST-B. caballi-CP (B)重组表达质粒构建的酶切鉴定 Fig. 1 Identification of enzyme digestion of GST-T. equi-CP (A) and GST-B. caballi-CP (B) recombinant plasmids |
最佳诱导条件：GST-T. equi-CP蛋白(约55.59 ku)为加入终浓度1.0 mmol·L-1 IPTG在37 ℃ 200 r·min-1下诱导6 h，获得最佳重组蛋白，GST-B. caballi-CP蛋白(约40.63 ku)为加入终浓度1.0 mmol·L-1 IPTG在37 ℃ 180 r·min-1下诱导4 h获得最佳重组蛋白；通过12%的SDS-PAGE分析蛋白质表达情况(图 2、图 3)。
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M.蛋白质相对分子质量标准；1~8.诱导时间(0、1、2、3、4、5、6、7 h)；9~14.IPTG诱导浓度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 mmol·L-1) M. Protein marker; 1-8. Induction time (0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 h); 9-14. Induction concentration with IPTG at 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.2 mmol·L-1 图 2 诱导时间及IPTG浓度对GST-T. equi-CP蛋白表达的影响 Fig. 2 Effect of induction time and IPTG concentration on the GST-T. equi-CP protein expression |
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M.蛋白质相对分子质量标准；1~8.诱导时间(0、1、2、3、4、5、6、7 h)；9~14. IPTG诱导浓度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 mmol·L-1) M. Protein marker; 1-8.Induction time (0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 h); 9-14.Induction concentration with IPTG at 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.2 mmol·L-1 图 3 诱导时间及IPTG浓度对GST-B. caballi-CP蛋白表达的影响 Fig. 3 Effect of induction time and IPTG concentration on the GST-B. caballi-CP protein expression |
单滴分光计测定纯化后蛋白浓度在1.9~2.3 mg·mL-1。各取10 μL纯化前和纯化后的GST-T. equi-CP和GST-B. caballi-CP重组蛋白，分别与等体积2×SDS上样缓冲液混匀，100 ℃热处理10 min。取10 μL处理后样品加入上样孔内进行SDS-PAGE电泳验证(图 4)。
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M.蛋白质相对分子质量标准；1~2. GST-B. caballi-CP纯化前和纯化后；3~4. GST-T. equi-CP纯化前和纯化后 M. Prestained protein Marker; 1-2.Purification of GST-B. caballi-CP protein (1) before, (2) after; 3-4. Purification of GST-T. equi-CP protein (3) before, (4) after 图 4 纯化的重组蛋白的SDS-PAGE验证结果 Fig. 4 The SDS-PAGE analysis of purification of recombinant protein |
GST-T. equi-CP和GST-B. caballi-CP重组蛋白能分别与感染马泰勒虫和驽巴贝斯虫的马血清特异性反应，出现明显斑点印迹，与健康马匹血清不发生反应，未见斑点印迹。
2.5 系统进化树分析2.5.1 马泰勒虫半胱氨酸蛋白酶 通过T. equi-CP基因同源物种氨基酸序列进化分析，结果如图 6所示，本文所研究的T. equi-CP与马泰勒虫在同一分支上属于马泰勒虫半胱氨酸蛋白酶，与其遗传距离最近的为Theileria equi strain WA(XP_004832412.1)；马泰勒虫半胱氨酸蛋白酶与牛环形泰勒虫进化关系最近，其次分别为尤氏泰勒虫、东方泰勒虫和小泰勒虫，而巴贝斯虫属自成一支。
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A. GST-T. equi-CP蛋白；B. GST-B. caballi-CP蛋白 A. GST-T. equi-CP protein; B. GST-B. caballi-CP protein 图 5 斑点印迹结果 Fig. 5 Results of dot blot |
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●.本研究的新疆马泰勒虫株 ●. This is the T. equi of Xinjiang strain 图 6 基于部分T. equi-CP基因的马泰勒虫系统进化树 Fig. 6 A phylogenetic tree of T. equi-CP |
2.5.2 马驽巴贝斯虫半胱氨酸蛋白酶 通过B. caballi-CP基因同源物种氨基酸序列进化分析，结果如图 7所示，本文所研究的B. caballi-CP与马驽巴贝斯虫在同一分支上属于马驽巴贝斯虫半胱氨酸蛋白酶，与其遗传距离最近的为Babesia caballi(AAL73384.1)；马驽巴贝斯虫半胱氨酸蛋白酶与双芽巴贝斯虫和卵形巴贝斯虫进化关系最近，其次分别为分歧巴贝斯虫和田鼠巴贝斯虫，而泰勒虫属和疟原虫属各自成一支。
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●.本研究的的新疆马驽巴贝斯虫株 ●. This is the B. caballi of Xinjiang strain 图 7 基于部分B. caballi-CP基因的马驽巴贝斯虫系统进化树 Fig. 7 A phylogenetic tree of B. caballi-CP |
Prot Param软件分析蛋白的理化性质、相对分子质量及等电点等，其中T. equi-CP蛋白的相对分子质量=29 948.60，等电点=5.53，不稳定指数=22.50；B.caballi-CP蛋白的相对分子质量=14 603.62，等电点=8.54，不稳定指数=47.69。通过在线分析软件TMHMM对CP蛋白跨膜区预测，可知T. equi-CP蛋白1—807位氨基酸位于细胞膜外(胞外区)，B. caballi-CP蛋白1—399位氨基酸位于细胞膜外(胞外区)，2个蛋白氨基酸全部位于细胞膜外；通过在线分析软件SignalP对2个蛋白信号肽预测，可知T. equi-CP蛋白无信号肽，B.caballi-CP的1—20位氨基酸是信号肽；通过DNA Star中的Protean软件对氨基酸序列进行分析, 2个蛋白均有较高的抗原性(图 8)和亲水性；通过在线分析软件B细胞表位预测结果如图 9；T细胞表位预测结果显示未预测出MHC-Ⅱ结合肽段；利用在线分析软件EzMol2.1构建T. equi-CP蛋白和B. caballi-CP的3D模型，3D模型构建结果如图 10。对T. equi-CP蛋白预测，可知红色区域是T. equi-CP蛋白的酶活性位点，对B. caballi-CP蛋白预测，可知红色区域是B. caballi-CP蛋白的信号肽。
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图 8 抗原性预测结果 Fig. 8 Forecast result of antigenic index |
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图 9 B细胞表位预测 Fig. 9 Forecast result of B cell epitope |
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A. T. equi-CP蛋白3D模型：酶活性位点保守域(红色区域)；B. B. caballi-CP蛋白3D模型：信号肽区域(红色区域)。因黑白印刷，图中细节未能很好地展示，彩图见OSID服务的开放科学数据与内容 A. 3D-model of T. equi-CP:conserved sites of enzyme activity(red region); B. 3D-model of B. caballi-CP:signal peptide region(red region). The details of the pictures can′t be displayed well due to black-and-white printing. The color pictures can be found in open scientific data and contents of the OSID service 图 10 T. equi-CP和B. caballi-CP蛋白的3D模型构建 Fig. 10 Construction of 3D-Model of T. equi-CP and B. caballi-CP |
亚细胞定位预测结果表明，T. equi-CP蛋白质主要存在于细胞质(34.8%)、线粒体(30.4%)、细胞核(26.1%)、分泌系统的囊泡(8.7%)中也有少量分布；B. caballi-CP蛋白质主要存在于线粒体(47.8%)、细胞核(26.1%)、细胞质(21.7%)、过氧化物酶体(4.3%)中也有少量分布。
3 讨论目前，国内外未见关于马梨形虫病免疫疫苗的研究报道，本研究所选的半胱氨酸蛋白酶是在马梨形虫的基因基础上，结合其他寄生虫的免疫防治候选基因研究，筛选出的一种应用于疫苗和药物靶点的候选基因。本试验首次对新疆马梨形虫地方流行虫株CP基因进行克隆，并成功构建了重组质粒pEGEX-4T-1/T. equi-CP和pEGEX-4T-1/B. caballi-CP，经诱导时间和IPTG浓度等条件优化后，2个蛋白均以包涵体的形式高效表达，使用尿素溶液变性方法纯化出蛋白。Dot blot分析证明，表达的目的蛋白可与相应抗体反应，说明具有良好的反应原性。
系统发育分析结果表明，T. equi-CP和B. caballi-CP基因编码产物均为半胱氨酸蛋白酶，本研究对16种不同原虫CP基因编码蛋白序列构建系统发育树，T. equi-CP与牛环形泰勒虫遗传距离最近，B. caballi-CP与双芽巴贝斯虫和卵形巴贝斯虫进化关系较近，该结果符合原虫动物分类[20]。提示CP基因在遗传进化中具有较高的保守性。
生物信息学分析表明，T. equi-CP和B. caballi-CP两者在稳定性方面，T. equi-CP较稳定，而B. caballi-CP不稳定；蛋白跨膜区预测和蛋白亚细胞定位分析表明，两个蛋白属非跨膜蛋白，主要位于胞外，这两种预测结果充分说明，两个蛋白被运输到膜外发挥作用[16]，其中B. caballi-CP是一种具有信号肽序列的分泌蛋白；T. equi-CP抗原性和B细胞表位预测结果表明具有较强的抗原性和较多的抗原表位，说明能产生较强的免疫应答反应，而B. caballi-CP蛋白较弱；使用在线软件SYFPEITHI和ProPred预测CP蛋白的MHC-Ⅱ结合肽段[16]，未预测出MHC-Ⅱ结合肽段，结果表明CP蛋白可能不含Th细胞表位，说明该蛋白可能在马梨形虫抵御宿主免疫反应的持续攻击过程中发挥了作用[16]，因而使得马梨形虫在终末宿主体内长时间存活而不会被彻底清除[17]；EzMol2.1是基于同源建模的方法构建蛋白质三级结构，具有很高的准确性，通过模型显示，T. equi-CP的酶活性位点保守域[18]和B. caballi-CP的信号肽区域均暴露在表面，说明能较好的被识别和发挥功能；马泰勒虫和驽巴贝斯虫CP蛋白质在细胞质、线粒体和细胞核中定位较多，说明可能CP在2种虫体中参与增殖、分化及程序性细胞死亡等[19]。
国内有关寄生虫半胱氨酸蛋白酶的研究主要集中在蠕虫方面；国外方向大多为原虫和蠕虫，研究方法主要是分子生物学方法，国内在原虫方面研究不足。动物感染寄生虫后有的寄生虫可产生免疫逃避，主要是由于抗原变异、寄生虫体表披被了宿主的抗原、寄生虫释放的可溶性抗原阻断了特异性抗体的免疫反应或与抗体形成免疫复合物，从而抑制了免疫反应；多种寄生虫尚处于进化状态，能在相对短的时间内发生明显的遗传和抗原变异[20]，各个过程基本都有半胱氨酸蛋白酶的参与，使得寄生虫半胱氨酸蛋白酶的研究具有很大的发展潜力。本文针对马泰勒虫和驽巴贝斯虫半胱氨酸蛋白酶的研究在研制寄生虫疫苗、筛选免疫抗原诊断分子和筛选药物靶点方面有重要的意义。
4 结论通过本研究，T. equi-CP和B. caballi-CP两个基因符合寄生虫免疫学诊断和免疫防控候选基因的特点，为后续在该蛋白功能和马泰勒虫、马驽巴贝斯虫的致病相关机制研究方面提供了理论依据。
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