, XIE Zhixun
, ZENG Tingting, LIU Jiabo, XIE Liji, DENG Xianwen, XIE Zhiqin, LUO Sisi, HUANG Jiaoling, WANG Sheng
近年来，由食源性菌引起食品中毒事件在世界各地频繁发生，严重危害人类健康，是许多国家面临的公共卫生问题。大肠杆菌O157:H7、沙门菌、空肠弯曲菌、单核细胞增生李斯特菌(下文简称单增李斯特菌)、霍乱弧菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌是7种常见的食源性致病菌。这些致病菌能引起肠道细菌性感染和细菌性食物中毒，是影响食品安全的重要病原体。一系列血清型的大肠杆菌均与人类疾病有关[1]，其中，大肠杆菌O157:H7(E. coli O157:H7)最为致命，能产生强烈的毒素，并引发严重的疾病[2-3]，夏季尤为高发[4]，感染者可引起腹泻、出血，严重者还可并发溶血性尿毒症[5]；沙门菌(Salmonella)是世界范围内重要的食源性致病菌，主要通过未经处理的食物和饮用水传播，并且在畜禽肉类、肉类制品和蛋制品的检出率最高，感染后可引起胃肠炎和败血症等[6-7]；霍乱弧菌(V. cholera)是国际进出口检疫A类传染病之一，具有发病急、传播快、流行范围广等特征，感染可导致严重呕吐腹泻、脱水等[8-9]；副溶血弧菌(V. Parahemolyticus)是一种嗜盐细菌，常见于世界各地的水环境，常从浮游生物、沿海鱼类和贝类等水产品中分离到，致病菌株可引起腹泻呕吐、腹部痉挛等，有可能导致有基础病、免疫力低下的人出现危及生命的症状，如败血症、免疫紊乱等，甚至死亡[10-11]；单增李斯特菌(L. monocytogenes)可引起李斯特菌病，老年人及免疫力低下的人较易感，死亡率20%~30%[12]，主要污染未经加工的肉类、鱼和海鲜等，或是在奶酪、冰激凌和肉类加工处理过程中容易被污染，感染后主要表现为单核细胞增多、败血症和脑膜炎[13]；空肠弯曲菌(C. jejuni)感染人的情况时有发生[14]，主要传播途径是食用受污染的生肉或未煮熟的肉类、水和蔬菜，或是接触受感染的人和动物的粪便，家禽被认为是空肠弯曲菌的主要宿主，感染后可引起腹泻[15]；金黄色葡萄球菌(S. aureus)广泛存在于自然界中，人和动物被感染的机会很大，是引起人类多种疾病的重要原因，人感染后，可引起呕吐、腹泻、肺炎等[16-17]。以上7种食源性致病菌不仅给养殖业和食品行业带来巨大的经济损失，还严重威胁人类健康，建立一种既快速又准确的检测方法意义重大。
常规检测食源性致病菌的方法操作步骤繁琐，费时费力，而PCR技术特异性好，敏感性高，反应快，成本低，已被广泛应用于食源性致病菌的检测。单重PCR一次只能检测一种病原体，为了提高效率，可检测多个基因的多重PCR技术已被广泛应用于混合感染的检测中[18-23]，而随着检测目的基因的增多，一是随之增多的引物二聚体大大降低了多重PCR的扩增效率，二是目的条带要有一定间隔才可区分。目前，常用的实时荧光定量有6个荧光检测通道[24-26]，敏感性比普通PCR高，一次也只能检不超过7种的病原体，如果标记太多的荧光基团，荧光基团之间相互竞争干扰使得多重荧光PCR检测和分析受影响，对于多个病菌混合感染的鉴别诊断尤为困难，难以达到高通量的检测。
GeXP多重PCR技术是基于GenomeLab GeXP遗传分析系统，将荧光标记通用引物和特异性嵌合引物相结合而引发多个基因的同时扩增，可同时在一个反应体系中对多达30个目的基因进行有效分析[27]。为了更好地解决以上问题，基于GeXP多重PCR技术，本研究建立一种能同时鉴别7种常见食源性致病菌的分子诊断技术，为流行病学监测和有效防止病原体的传播提供技术支持。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 试剂和仪器 GeXP启动试剂盒、配套的分离胶和分离缓冲液、GenomeLab GeXP遗传分析系统均购自美国Beckman公司；JumpStart Taq DNA Polymerase和25 μmol·L-1 MgCl2购自美国SIGMA公司；EX Taq Mix和pMD 18-T vector均购自日本TaKaRa公司；细菌总DNA抽提试剂盒、胶回收试剂盒和质粒抽提试剂盒均购自北京全式金(TransGen)公司；PCR仪购自美国BIO-RAD公司；NanDrop ND-2000微量核酸检测仪购自美国Thermo Fisher公司。
1.1.2 样品的准备 本研究所有样品来源见表 1。按照细菌总DNA抽提试剂盒说明书，抽提表 1中所有菌株的DNA，保存于-30 ℃冰箱。
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表 1 菌株来源 Table 1 The source of the strains |
1.2.1 引物设计和筛选 选择各菌株保守基因，NCBI下载各菌株的基因序列，根据引物设计原则通过DNASTAR软件和Primer premier5.0软件选择特异且保守的区域进行引物设计和筛选，每对的正、反向引物5′端分别连接GeXP通用引物序列(表 1)，由北京六合华大基因科技有限公司(深圳)合成。细菌名称和各GeXP引物信息见表 2。
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表 2 GeXP引物信息 Table 2 Primer information of the GeXP |
1.2.2 反应体系和程序 反应体系：5×PCR Buffer 4 μL，MgCl2 4 μL，工作浓度为0.2 μmol·L-1的引物2 μL，JumpStart Taq DNA Polymerase 1.4 μL，模板DNA 0.5 pg~0.5 μg，超纯水补足至20 μL。PCR反应程序：95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10个循环；95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10个循环；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，20个循环；12 ℃结束反应。
GeXP系统的毛细管电泳检测：上样缓冲液(甲酰胺)与DNA size standard Kit-400 Base Pairs按体积比80:1充分混匀，38 μL混匀好的液体加入1 μLPCR产物，混匀，最后滴入1滴石蜡油进行封闭。在缓冲液板上每孔加入4/5孔的缓冲液，上机进行毛细管电泳。利用GeXP系统分析检测，并使用仪器自带软件分析结果。以动物源性肉制品的DNA和超纯水作为阴性对照，按上述反应，进行单一引物和对应细菌DNA反应，验证和筛选引物。
1.2.3 特异性试验 等量混匀工作浓度均为0.2 μmol·L-1的7对GeXP引物。参照“1.2.2”反应体系和程序，以表 1中阳性菌株DNA为模板，分别进行单模板多引物试验，验证各引物的特异性。
1.2.4 准确性试验 随机选取几种以任意比例进行组合的细菌DNA并混匀，本研究进行了3个不同组合的试验，A组：E. coli O157:H7+V. cholera+C. jejuni+V. Parahemolyticus 4种不同细菌的DNA混合作为模板；B组：V. cholera+L. monocytogenes+C. jejuni+V. Parahemolyticus+ S. aureus 5种细菌的DNA混合作为模板；C组：将7种菌的DNA以任意比例混合作为模板，模拟临床混合感染，验证所建立的GeXP方法的准确性。
1.2.5 敏感性试验 以7种菌DNA为模板，运用去掉嵌合引物的GeXP引物分别进行普通PCR扩增，将产物连接到pMD 18-T载体，获得7种重组克隆质粒，并进行测序验证。利用NanDrop ND-2000测核酸浓度，根据已知分子量和浓度计算各重组克隆质粒拷贝数[28]。将7种重组克隆质粒，即阳性标准品分别梯度稀释为106~101拷贝·μL-1，参照“1.1.2样品的准备”和“1.2.2反应体系和程序”，验证所建立的方法对单一模板和多模板混合进行GeXP多重PCR的敏感性。每次试验做3个平行，间隔2 d再检1遍，重复3次。
1.2.6 干扰性试验 随机选取103拷贝·μL-1的克隆质粒S. aureus，107拷贝·μL-1的E. coli O157:H7和105拷贝·μL-1的Salmonella作为组合，参照“1.1.2”样品的准备和“1.2.2”反应体系和程序进行GeXP-PCR干扰性试验，每次试验做3个平行，间隔2 d再检1遍，重复3次，并比较不同拷贝数模板混合的GeXP多重PCR结果。
1.2.7 临床样品检测 于2014年12月—2016年12月的120份自广西南宁、北海、防城港、崇左和河池5个地区采集超市和自由市场采集的鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉、羊肉、淡水产品、海水产品等动物源性肉制品。样品研磨处理后，分别按E. coli O157:H7、Salmonella、V. cholera、L. monocytogenes、C. jejuni、V. Parahemolyticus和S. aureus的国标方法进行增菌培养，抽提DNA，用本研究建立的GeXP多重PCR分别对单一模板和混合模板进行检测，同时使用单重PCR方法(单重引物参考文献[2, 21, 29-33])进行检测。最后经参考食品安全国家标准方法确认，比较检测结果。阳性结果均送至北京六合华大基因科技有限公司(深圳)进行测序。
2 结果 2.1 引物验证GeXP多重PCR的单引物单模板毛细管电泳结果显示的峰值大小与预期相符，均出现单一清晰峰，7对引物扩增7种菌的靶基因峰值大小分别为大肠杆菌O157:H7：138~140 bp，沙门菌：158~160 bp，霍乱弧菌：203~205 bp，单增李斯特菌：235~237 bp，空肠弯曲菌：250~252 bp, 副溶血弧菌：271-273 bp，金黄色葡萄球菌：316~318 bp。
2.2 GeXP多重PCR方法的建立和特异性试验应用GeXP多重PCR方法对表 1中所有菌株分别进行特异性试验，均能扩增出与预期相符的单一特异峰。如图 1，大肠杆菌O157:H7、沙门菌、霍乱弧菌、单增李斯特菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌分别出现139.25、158.15、202.46、235.63、252.47、271.85和316.40 bp特异信号峰。
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A~G.大肠杆菌O157:H7、沙门菌、霍乱弧菌、单增李斯特菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌的GeXP特异性扩增结果。H.阴性对照，各峰是DNA分子量标准信号峰 A-G. E. coli O157:H7, Salmonella, V. cholera, L. monocytogenes, C. jejuni, V. Parahemolyticus and S. aureus, respectively.H. The negative control. The peaks indicate the DNA size standard 图 1 GeXP多重PCR的特异性检测 Fig. 1 Specificity analyses of the GeXP-PCR assay |
如图 2，GeXP多重PCR准确性验证试验结果显示，A组检出4个信号峰，139.16、203.13、250.60和271.58 bp分别为大肠杆菌157:H7、霍乱弧菌、空肠弯曲菌和副溶血弧菌的特异峰。B组可检出5个目的峰，203.96、235.93、251.09、272.10和316.80 bp分别为霍乱弧菌、单增李斯特菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌的特异峰。C组7种致病菌混合模板可检出7个目的峰，139.45、158.79、203.70、235.96、251.23、271.82和316.44 bp分别为大肠杆菌O157:H7、沙门菌、霍乱弧菌、单增李斯特菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌的特异峰。
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A.大肠杆菌157:H7、霍乱弧菌、空肠弯曲菌和副溶血弧菌的组合；B.霍乱弧菌、单增李斯特菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌的组合；C.大肠杆菌O157:H7、沙门菌、霍乱弧菌、单增李斯特菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌的GeXP组合扩增结果 A. E. coli O157:H7, V. cholera, C. jejuni and V. Parahemolyticus; B. V. cholera, L. monocytogenes, C. jejuni, V. Parahemolyticus and S. aureus; C. E. coli O157:H7, Salmonella, C. V. cholera, L. monocytogenes, C. jejuni, V. Parahemolyticus and S. aureus 图 2 GeXP多重PCR检测混合模板 Fig. 2 GeXP-multiplex PCR detect the mixed templates |
应用所建立的GeXP多重PCR分别检测7种不同拷贝数的单一质粒，结果显示，大肠杆菌 O157:H7、沙门菌和霍乱弧菌的敏感性均为10拷贝·μL-1，单增李斯特菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌检测的敏感性均为100拷贝·μL-1。
2.5 GeXP多重PCR同时检测7种菌模板的敏感性GeXP多重PCR同时检测出7种致病菌，灵敏度为103拷贝·μL-1(图 3)，信号值以2 000为判断点，峰值低于2 000，认为是阴性[34]。
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A. 106拷贝·μL-1; B. 105拷贝·μL-1; C. 104拷贝·μL-1; D. 103拷贝·μL-1; 目的峰顺序依次为大肠杆菌O157:H7、沙门菌、霍乱弧菌、单增李斯特菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌 A. 106 copies·μL-1; B. 105 copies·μL-1; C. 104 copies·μL-1; D. 103 copies·μL-1. The targets from left to right are as follow: E. coli O157:H7, Salmonella, V. cholera, L. monocytogenes, C. jejuni, V. Parahemolyticus and S. aureus 图 3 GeXP多重PCR的敏感性检测 Fig. 3 Sensitivity of the GeXP-PCR assay |
随机选取几种不同浓度的质粒为混合模板进行GeXP多重PCR试验，分别为107拷贝·μL-1的大肠杆菌 O157:H7和105拷贝·μL-1的沙门菌和103拷贝·μL-1金黄色葡萄球菌的克隆质粒，结果显示，当拷贝数差异较大的不同模板组合时，本试验所建立的方法依然可同时检测到大肠杆菌 O157:H7、沙门菌和金黄色葡萄球菌。相比同一浓度的大肠杆菌 O157:H7、沙门菌和金黄色葡萄球菌的两两组合模板的GeXP多重PCR，峰值差异不大(图 4)。
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A.大肠杆菌O157:H7 107拷贝·μL-1、沙门菌105拷贝·μL-1和金黄色葡萄球菌103拷贝·μL-1组合; B.大肠杆菌 O157:H7 107拷贝·μL-1和沙门菌105拷贝·μL-1组合; C.沙门菌105拷贝·μL-1和金黄色葡萄球菌103拷贝·μL-1组合; D.大肠杆菌O157:H7 107拷贝·μL-1和金黄色葡萄球菌 103拷贝·μL-1组合 A. E. coli O157:H7 107copies·μL-1, Salmonella 105copies·μL-1 and S. aureus 103copies·μL-1; B. E. coli O157:H7 107copies·μL-1, and Salmonella 105copies·μL-1; C. Salmonella 105copies·μL-1 and S. aureus 103copies·μL-1; D. E. coli O157:H7 107copies·μL-1 and S. aureus 103copies·μL-1 图 4 GeXP多重PCR干扰性试验 Fig. 4 GeXP-multiplex PCR interference assay |
如表 3所示，GeXP多重PCR检出率为58.33%(70/120)，普通PCR检出率51.67%(62/120)，检测120份动物源性样品中，GeXP多重PCR检测出2~4重混合感染共15份，混合感染率4.17%，单一模板和混合模板的GeXP多重PCR检测结果与经参考食源性致病菌国家标准方法检测结果一致，测序结果均为阳性。表明GeXP多重PCR更为准确、敏感。
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表 3 GeXP多重PCR与单重PCR对临床样品的检测结果 Table 3 Analysis of clinical samples using the GeXP assay and conventional PCR methods |
动物源性食品与人类生活息息相关，任何食品在生产、加工、储存及运输等环节都有可能被微生物污染。食源性致病菌在自然界中广泛存在，大肠杆菌O157:H7、沙门菌、霍乱弧菌、单增李斯特菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌都是危害人类健康和食品安全的重要因素，这些致病菌可引起肠道细菌性感染和细菌性食物中毒。这些致病菌一旦接触食品，一定条件下极易大量繁殖，增殖的细菌及其产生的毒素存在于食品中，严重威胁食用者的健康[25]。传统细菌培养方法样品消耗量大，有些细菌难以分离培养，检测周期长，难以判定细菌混合感染[10]。美国食品药品管理局先后批准了多个多重核酸检测试剂盒，我国尚处于起步阶段，国家食品药品监督管理局目前仅批准了1个[35]。为此，本研究旨在建立1种可同时诊断这7种食源性致病菌的高通量GeXP检测方法，为细菌多重核酸检测提供参考。目前，已使用GeXP技术成功建立了可同时检测与人类健康密切相关的11种亚型人乳头瘤病毒、9种手足口病的人肠道病毒、8种脑炎相关虫媒病毒和7种人肠道菌耐药基因等检测方法[36-39]。在动物病毒方面本实验室已先后成功建立了9种鸡呼吸道病毒、8种猪呼吸道和繁殖障碍病毒、9种鸭病毒、8种牛病原体和禽流感不同亚型等GeXP方法[40-45]。
GeXP多重PCR技术，将嵌合特异性引物和荧光标记通用引物相结合，由多对引物的扩增变成1对通用引物的扩增，起主导作用的通用引物在PCR扩增中，既确保了7对引物之间互不干扰的特异性，又能使每种模板扩增效率趋于一致。PCR产物经毛细管电泳后，可在关联的电脑上根据片段大小和荧光峰值直接判断检测结果，不仅省去了制备凝胶电泳步骤，还有效避免接触有毒性的核酸染料。本研究依据多重PCR引物设计原则，设计了大肠杆菌O157:H7、沙门菌、霍乱弧菌、单增李斯特菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌的特异性引物共7对，每对引物目的片段大小两两间隔有16~45个碱基，避免信号峰交叉或重叠, 并利于观察结果。表 1中所使用到的阳性菌株均显示出了单一清晰的峰值，阴性对照没有干扰。该检测技术对7种致病菌的最低检测下限为103拷贝·μL-1，能够有效地从不同食品源微生物中扩增出7种目标细菌，可由传统国标方法检测时间5~7 d缩短至16~24 h，表明所建立的多重GeXP检测方法特异性好, 灵敏度高，可用于7种非定向食源性致病菌的快速检测，对食品安全检查和及时采取措施有重要意义。
本研究通过在广西不同城市的超市和自由市场出售的鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉、羊肉、淡水产品、海水产品等7种主要鲜肉食品以及熟肉制品的动物源性食品采集的120份样品作为临床检测样本，GeXP多重PCR检测7种细菌共计检出70份阳性，阳性率为2.50%(3/120)~15.83%(19/120)；普通PCR检出7种细菌共计62份阳性，阳性率为2.50%(3/120)~15.00%(18/120)；GeXP多重PCR检出2~4重混合感染共15份，混合感染率为4.17%，GeXP多重PCR检测结果均与经参考食源性致病菌国家标准方法检测结果一致，表明GeXP多重PCR更为准确、敏感、快速。
4 结论本研究建立了一种能同时鉴别多种食源性致病菌的GeXP检测方法，GeXP特异性强，敏感性高，一次可检测96份样品，同时满足了高通量检测的目的。该方法对动物源性食品的食源性致病菌污染情况的快速检测，是一种高通量新型分子检测方法，适用于食源性常见致病菌感染或混合感染的鉴别监测，具有实际应用价值。
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