2. 宁夏大学生命科学学院, 银川 750021
2. School of Life Science, Ningxia University, Yinchuan 750021, China
结核病(tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis, Mtb)感染引起的人畜共患传染病，目前已成为全球十大死因之一[1]。随着耐多药结核病(multidrug-resistant TB, MDR-TB)以及结核分枝杆菌与人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)共感染形势的加剧，结核病的全球感染状况日益严峻。结核病复杂的致病机制给结核病的预防和治疗工作带来巨大的挑战[2]。因此深入探究结核病的致病机制与机体抵抗结核病的免疫机制，对预防和治疗结核病具有十分积极的意义。
结核分枝杆菌抗原复杂多样，这是TB发病机制复杂难解的重要原因之一，因此选择合适的结核分枝杆菌抗原进而探究其在TB发病机制中的作用，对于进一步阐明结核分枝杆菌的致病机制和开发新的治疗靶点具有十分重要的意义。10 ku培养滤液蛋白(culture filtrate protein 10, CFP10)是结核分枝杆菌的优势抗原之一，也是结核分枝杆菌重要的毒力蛋白。CFP10只存在于结核分枝杆菌和牛分枝杆菌毒株中，其在减毒牛分枝杆菌(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)中早已丢失[3]。有研究认为CFP10的缺失是BCG减毒的重要原因[3-4]。因此，结核分枝杆菌CFP10蛋白在抗结核免疫中受到广泛关注。已有研究证实，CFP10是有效的CD8+T细胞抗原，并且能够显著的刺激T细胞分泌IFN-γ[5]。利用CFP10和另外一种结核分枝杆菌分泌的免疫显性蛋白抗原TB10.4缀合后形成的融合蛋白可以显著的刺激小鼠脾细胞增殖并激发Th1型和Th2型细胞因子的分泌[6]。Namvarpour等[7]和Wang等[8]的研究也显示，CFP10具有成为新型结核亚单位疫苗的潜力，其组成的融合蛋白分子如ESAT6 -CFP10或AEC / Al / poly-IC均能够有效刺激机体的免疫应答。CFP10缺失菌株的感染性和致病性明显降低[9-10]，这说明CFP10在结核分枝杆菌感染宿主的过程中发挥着重要的作用，但CFP10在结核分枝杆菌侵染过程中发挥的作用至今尚未完全阐明。
肺泡巨噬细胞在抵抗结核分枝杆菌感染过程中发挥着重要作用，也因此结核分枝杆菌与巨噬细胞的相互作用一直是结核病发病机制研究的重点[11-14]。而近年来的研究发现，肺泡上皮细胞也是结核分枝杆菌侵染的靶细胞之一[15-17]。已有研究证明，结核分枝杆菌同样能够侵染肺泡上皮细胞，在其中分裂增殖然并向周围组织细胞蔓延，在结核分枝杆菌感染过程中发挥重要作用。并且，有研究发现肺泡上皮细胞可以通过Toll样受体家族(toll like receptors，TLRs)来调控宿主的先天免疫，产生促炎症因子、趋化因子等，募集和活化吞噬细胞到感染部位来清除病原菌[18]。Toll样受体是最重要的病原体识别受体之一，被认为是宿主细胞识别病原体产生免疫反应的关键分子，在机体天然免疫中发挥着重要的作用。当Toll样受体识别抗原后，能够将信号在细胞内进行传递，启动核转录因子促进下游炎症因子的释放，进而协助宿主细胞清除病原体，所以TLR途径被认为是天然免疫的重要途径[19]。虽然肺泡上皮细胞在结核病发病过程中的作用研究已经有了很大进展，但肺泡上皮细胞在结核分枝杆菌感染过程中的相互作用机制仍未被彻底揭示，CFP10在结核分枝杆菌侵染肺泡上皮细胞过程中发挥作用的相关研究也鲜有报道。
本研究选择原核表达系统纯化结核分枝杆菌优势抗原CFP10蛋白，以A549细胞系作为细胞模型，使用重组CFP10蛋白(rCFP10)处理A549细胞，并设置相应对照组，探究rCFP10对A549细胞中TLR信号途径介导的炎症反应的影响，以期为进一步阐明肺泡上皮细胞抗结核分枝杆菌感染的免疫调节机制提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 细胞系、质粒及菌株人肺腺癌A549细胞系、结核分枝杆菌毒株H37Rv基因组DNA均由宁夏大学西部特色资源保护与利用教育部重点实验室保存；pCzn1质粒购自南京钟鼎生物科技公司；大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购自北京全式金生物科技公司。
1.2 主要试剂PCR试剂盒购自天根生化生物公司；蛋白质相对分子质量Marker购自碧云天生物公司；蛋白镍磁珠纯化试剂盒购自苏州海狸物生物公司；DMEM液体培养基和胎牛血清购自Gibco；ToxinEraserTM内毒素去除试剂盒和ToxinSensorTM Single Tests Kit购自金斯瑞生物科技有限公司；胎牛血清购自全式金生物科技有限公司；CFP10兔抗单克隆抗体购自Abcam公司；TLR4一抗购自圣克鲁斯公司，TLR2、MyD88、TRAF6、NF-κBp65一抗以及HRP标记二抗购自Proteintech公司；RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公；RT-PCR相关试剂盒均为塔克拉产品，相关引物由上海生工生物工程有限公司合成；人TNF-α、IL-6 ELISA检测试剂盒购自深圳欣博盛生物公司；MTT检测试剂盒、蛋白提取及定量试剂盒购自江苏凯基生物科技有限公司；Western Bright ECL化学发光显色液购自赛默飞公司；其他生化试剂为进口分装或国产分析纯。
1.3 cfp10基因的扩增及重组质粒的构建根据GenBank中公布的结核分枝杆菌cfp10基因序列的信息，设计引物:上游引物(5′→3′)CCCGGGCTAGCGCCATGGCAGAGATG(酶切位点NheⅠ)；下游引物(5′→3′)CTGCTCTAGACTAGAAGCCCATTTG(酶切位点XbaⅠ)。
使用引物，以实验室保存的毒株H37Rv基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后使用琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化。构建重组质粒pCzn1-CFP10，并进行酶切鉴定。
1.4 重组CFP10蛋白的表达鉴定与纯化将阳性克隆子转接含有50 μg·mL-1氨苄青霉素的LB培养基中，37 ℃，200 r·min-1恒温震荡培养至菌液生长A600 nm值为0.4~0.6时加入IPTG至终浓度为1 mmol·L-1，于37 ℃继续诱导4 h，离心收集菌体，冰浴状态下超声破碎，收集粗蛋白液，进行SDS-PAGE及Western blot分析。使用蛋白镍磁珠纯化试剂盒，按照说明书纯化蛋白，纯化后进行SDS-PAGE电泳分析。
1.5 细胞的培养与处理将A549细胞以每孔2×105个接种于6孔板，加入含有10%胎牛血清的DMEM细胞培养基，将细胞置于37 ℃，5% CO2恒温培养箱培养至细胞贴壁。使用rCFP10处理A549细胞进行处理(rCFP10组)并设置空白对照组(Control组)。
1.6 MTT法检测细胞存活率调整细胞浓度大约5×104·mL-1，按每孔100 μL悬液接种96孔细胞板，设置4个复孔，分别使用浓度为0.1、1、10、100 μg·mL-1的rCFP10处理A549细胞6、12、24、36 h并设置空白对照组(Control组)。处理结束按照每孔20 μL加入MTT溶液，读取细胞板OD450 nm数值，记录数据。
1.7 实时荧光定量PCR检测RNA提取及RT-PCR取各处理组细胞按照总RNA提取试剂盒说明书提取细胞RNA检测RNA浓度及纯度。按照塔克拉反转录试剂盒说明书进行逆转录获取cDNA应用SYBR Green荧光染料进行qPCR检测相关因子在转录水平的变化(引物信息见表 1)。
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表 1 qRT-PCR引物表 Table 1 The primers for qRT-PCR |
按照凯基全蛋白提取试剂盒说明提取各组A549细胞全蛋白，按BCA蛋白定量检测试剂盒说明对其进行定量，然后进行SDS-PAGE电泳，湿转至PVDF膜，5%脱脂乳室温封闭2 h，加入一抗，4 ℃过夜孵育，次日平衡到室温，TBST漂洗3次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的相应二抗，室温孵育1 h，TBST漂洗3次，每次10 min，然后用ECL底物显色，蛋白成像系统曝光。
1.9 ELISA测定炎症因子按照人TNF-α、IL-6 ELISA检测试剂盒说明书检测收集到的细胞培养上清液中的TNF-α和IL-6，读取OD450 nm值。数据处理时，以空白对照组为参照，计算rCFP10组TNF-α、IL-6的相对表达量。
1.10 统计学处理所有数据均采用SPSS 17.0软件Analyze选项Compare Means中的One-Way ANOVA进行统计分析，应用Graph Pad Prism 5软件作图。数据以均数±标准差(x±s)表示，以P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 cfp10基因的PCR扩增在GenBank中查到已公布的cfp10的基因序列, 并设计合成引物，以实验室保存的结核分枝杆菌H37Rv毒株基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，大小约为303 bp，与预期相符(图 1)。
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M.DNA相对分子质量标准；1.阴性对照；2. cfp10 M. DNA marker; 1. Control; 2. cfp10 图 1 cfp10基因PCR扩增产物1%琼脂糖凝胶检测 Fig. 1 PCR amplification cfp10 gene |
构建重组表达质粒pCzn1-CFP10，转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞中，挑选单克隆扩大培养。提取质粒，进行NheⅠ和XbaⅠ双酶切，结果表明获得与预期大小(303 bp左右)相同的目的片段(图 2)；对重组质粒测序，结果与GenBank中一致，说明重组质粒pCzn1-CFP10构建成功。
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1.pCzn1-CFP10质粒酶切前；2. pCzn1-CFP10质粒酶切，酶切位点NheⅠ和XbaⅠ；M. DNA相对分子质量标准 1. pCzn1-CFP10 plasmid; 2. PCzn1-CFP10 plasmid digested with NheⅠand XbaⅠ; M. DNA marker 图 2 pCzn-CFP10质粒双酶切鉴定 Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of the recombiant plasmid pCzn1-CFP10 by restriction endonuclease digestion |
将pCzn1-CFP10质粒转化至大肠杆菌感受态BL21(DE3)中，在平板上挑取单克隆到20 mL无菌LB液体培养基中，加入终质量浓度为50 μg·mL-1的氨苄青霉素，置于恒温振荡培养箱37 ℃，200 r·min-1振荡培养，OD600 nm值在0.4~0.6时加入终浓度为1 mmol·L-1的IPTG诱导4 h。诱导结束后检测细菌总蛋白，SDS-PAGE电泳结果显示在预期约11 ku的位置出现极为明显的蛋白条带(图 3A)。使用蛋白镍磁珠纯化试剂盒，按照说明书纯化蛋白，纯化结束后，SDS-PAGE结果显示，成功纯化出了rCFP10(图 3B)。
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A. pCzn1-CFP10表达产物SDS-PAGE分析(M.蛋白质相对分子质量标准；1.空载体pCzn1诱导全菌液；2. pCzn1-CFP10诱导全菌液)B. rCFP10纯化产物SDS-PAGE分析(M.蛋白质相对分子质量标准；3. pCzn1-CFP10诱导全菌液；4.流穿液；5.洗脱液) A. Confirmation of pCzn1-CFP10 expression with SDS-PAGE(M. Protein marker; 1. pCzn1 plasmid vectors E. coli lysate; 2. pCzn1-CFP10. coli lysate; )B. Confirmation of purification rCFP10 with SDS-PAGE(M. Protein marker; 3. pCzn1 plasmid vectors E. coli lysate; 4. Effluent; 5. Eluent) 图 3 rCFP10蛋白的表达与纯化 Fig. 3 rCFP10 protein expression and purification |
使用CFP10抗体对纯化所得蛋白进行Western blot检测，结果显示，在大约11 ku位置出现单一明显的印迹(图 4)，这说明成功获得rCFP10。使用内毒素去除试剂盒去除重组蛋白中的内毒素，再经透析去盐，最终使用BCA法对蛋白定量，留取备后续使用。
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M.蛋白质相对分子质量标准：1.空载体pCzn1诱导全菌液；2. pCzn1-CFP10诱导全菌液 M. Protein marker; 1. pCzn1 plasmid vectors E. coli lysate; 2. pCzn1-CFP10. coli lysate 图 4 rCFP10蛋白的Western blot鉴定 Fig. 4 rCFP10 protein identification by Western blot |
为检测重组rCFP10对A549细胞活力的影响并筛选rCFP10处理A549细胞的条件，本研究分别使用浓度为0.1、1、10、100 μg·mL-1 rCFP10处理A549细胞，分别处理6、12、24、36 h，并设置空白对照组。处理结束，使用MTT试剂盒对A549细胞的存活率进行检测。
与Control组相比，rCFP10处理后A549细胞的存活率显著或极显著下降(P < 0.05或P < 0.01)，且随着rCFP10浓度增加、处理时间延长，细胞的存活率出现降低趋势，呈现出一定的时间、浓度依赖性。最终选用终质量浓度为4 μg·mL-1rCFP10处理A549细胞24 h进行后续试验(图 5)。
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*.P < 0.05；**.P < 0.01 图 5 rCFP10刺激A549细胞后的细胞存活率检测 Fig. 5 Impacts of rCFP10 on cell viability of A549 cells |
为了探究rCFP10对A549细胞中TLR信号通路关键分子表达是否有影响，分别从转录和翻译水平对A549细胞TLR信号通路几种主要分子进行检测。
结果发现与Control组相比，rCFP10组中包括TLR2、TLR4、TLR6、MyD88、TRAF6以及核转录因子NF-κB在内的几种关键分子在mRNA水平上，均发生显著或极显著上调(P < 0.05或P < 0.01)(图 6 A)。为进一步证实rCFP10对A549细胞TLR信号通路的影响，本研究利用Western blot技术对A549细胞TLR信号途径中的几种关键蛋白进行检测。结果显示，与Control组相比，rCFP10组TLR2、TLR4、MyD88、TRAF6以及NF-κB p65蛋白出现与mRNA水平相似的显著或极显著上调趋势(P < 0.05或P < 0.01)(如图 6 B、C)。
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A. rCFP10处理后A549细胞中TLR2、TLR4、TLR6、MyD88、TRAF6、NF-κB的mRNA表达分析；B、C. rCFP10处理后A549细胞中TLR2、TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κBp65的蛋白表达分析；*. P < 0.05；**. P < 0.01 A. The expression of TLR2, TLR4, TLR6, MyD88, TRAF6, NF-κB mRNA in A549 cells treated with rCFP10; B, C. The expression of TLR2, TLR4, MyD88, TRAF6, NF-κB p65 protein in A549 cells treated with rCFP10; *. P < 0.05; **. P < 0.01 图 6 rCFP10处理后A549细胞TLR信号途径关键分子的变化 Fig. 6 rCFP10 stimulation induces the molecules expression of TLRs in A549 cells |
当宿主细胞TLR信号途径被抗原激活时，宿主细胞能够分泌多种炎症因子进而协助宿主清除病原体。为了探究rCFP10蛋白是否影响了A549细胞中TLR信号途径下游的炎症因子的分泌，分别从转录和翻译水平对A549细胞中的部分炎症因子进行检测。
结果发现，与Control组相比，rCFP10组中IL-1β、IL-6、IL-12α及TNF-α几种炎症因子在mRNA水平上，均发生显著或极显著上调(P < 0.05或P < 0.01)(图 7A )。进一步通过ELISA技术检测A549细胞培养上清中炎症因子的分泌情况。结果显示，与Control组相比，rCFP10组IL-6和TNF-α蛋白表达同样显著或极显著上调(P < 0.05或P < 0.01)(图 7B)。
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A. rCFP10处理后A549细胞中IL-1β、IL-6、IL-12α、TNF-α的mRNA表达分析；B、C. rCFP10处理后A549细胞中IL-6、TNF-α的蛋白表达分析；*. P < 0.05；**. P < 0.01 A. The expression of IL-1β, IL-6, IL-12α, TNF-α mRNA in A549 cells treated with rCFP10; B. The expression of IL-6, TNF-α protein in A549 cells treated with rCFP10; *. P < 0.05; **. P < 0.01 图 7 rCFP10处理后A549细胞炎症因子的变化 Fig. 7 rCFP10 stimulation induces the inflammatory cytokines expression in A549 cells |
结核病至今仍是危及世界的重要传染病之一，耐多药结核病和HIV共感染情况的出现加剧了结核病的传播。人类探索结核病的解决方法经历了漫长的时期，但至今结核病仍未被有效遏制。肺泡上皮细胞是结核分枝杆菌侵染的重要靶细胞，在宿主抵抗结核分枝杆菌感染的过程中发挥着重要的作用，其可以通过分泌多种细胞因子和趋化因子，募集单核细胞、淋巴细胞等免疫细胞协助宿主清除病原菌[20]。有研究证明肺泡上皮细胞可以通过Toll样信号通路介导炎症因子如IL-6、TNF-α等分泌进而抵抗结核分枝杆菌的侵袭[18, 21]，但目前Mtb与肺泡上皮细胞的具体相互作用机制尚不明确。
结核分枝杆菌抗原的多样性导致结核病致病机制复杂难解，这也是结核病肆虐的重要原因。选取具有代表性的结核分枝杆菌抗原，研究其在结核病致病机制中的作用是具有积极意义的，CFP10便是结核分枝杆菌的优势抗原之一。CFP10仅存在于结核分枝杆菌毒株中，它是结核分枝杆菌重要的毒力因子。在长期的培养过程中，BCG中早已丢失了CFP10这种毒力因子，这也被认为是BCG减毒的重要原因之一[3, 22]，因此CFP10受到了广泛的关注。在目前的研究中，研究者们获取CFP10的方法主要有：(1)构建原核质粒表达载体，利用大肠杆菌表达系统诱导表达纯化目的蛋白[23]。(2)构建真核表达质粒载体，将质粒转染目标细胞，直接在目的细胞中表达目的蛋白或纯化真核细胞表达的蛋白[24]。(3)构建带有目的基因的重组BCG[25-26]。本研究中，笔者采用原核表达系统，通过构建携带目的基因cfp10的原核表达载体，利用大肠杆菌表达系统，成功纯化出了可溶性的重组目的蛋白CFP10，并且所得重组蛋白纯度较高，经过脱盐和内毒素去除等处理步骤后用于后续的研究。
已有的研究表明CFP10在结核分枝杆菌致病过程中发挥着重要的作用[27]。从牛分枝杆菌株中将编码CFP10的基因删除，导致细菌毒力下降[9]，而且缺失了CFP10的海分枝杆菌突变体在细胞内的生长速度和在细胞间的传播速度大大降低，对巨噬细胞的细胞毒性也大大下降[28]。CFP10还是重要的T细胞抗原，能够刺激宿主细胞产生免疫应答。Trajkovic等[29]发现CFP10可以刺激小鼠J774.1巨噬细胞分泌TNF-α，并且CFP10还与γ干扰素(IFN-γ)协同诱导J774.1细胞产生NO[30]。Chen等[23]使用重组CFP10蛋白免疫小鼠，结果显示CFP10显著上调了小鼠IFN-γ和IL-12的表达。Khan等[31]证明CFP10蛋白含有能够激活TLR2和诱导自噬的肽基序，将此基序和Ag85B共表达构建重组疫苗BCG85C5，重组BCG85C5增强了APC的MHC-Ⅱ依赖性抗原呈递能力，TLR2和MyD88都参与了此过程，并且重组BCG85C5在小鼠体内诱导了Th1细胞因子(IL-12、IL-1β和TNF-α)的分泌。这说明CFP10在结核分枝杆菌感染宿主期间对宿主细胞的炎症反应确实存在影响，可以促进细胞分泌炎症因子。本研究结果显示，rCFP10促进了A549细胞中TLR信号途径中关键分子TLR2、TLR4、MyD88、TRAF6以及核转录因子NF-κB的表达，同时诱导A549细胞分泌IL-6、TNF-α等炎症因子。这提示在结核分枝杆菌侵染上皮细胞时，作为早期分泌的抗原，CFP10可能通过TLR信号途径促进肺泡上皮细胞分泌炎性因子。然而，有研究发现CFP10能抑制RAW264.7细胞中ROS的产生，并且通过下调细菌脂多糖(LPS)诱导的ROS进而下调NF-κB依赖性基因表达[10]。Seghatoleslam等[32]的研究也发现CFP10可以通过减少人单核细胞系(THP-1)中NO和ROS的产生从而抑制巨噬细胞的免疫应答。除此之外，CFP10还可以通过调节多种microRNA(miRNA)充当宿主免疫反应的调节剂。Zuo等[33]使用海洋分枝杆菌感染小鼠RAW264.7巨噬细胞，发现CFP10和ESAT6的敲除菌株显著上调了miR-147的水平，miR-147的上调抑制Toll样受体4 /NF-κB通路并抑制了IL-6和IL-10的分泌，显着降低了海藻分枝杆菌的细胞内存活。这样的结果有可能是因为细胞系的不同所导致的，同时，这也可以体现出结核病发病机制复杂性。总而言之，笔者的结果证明rCFP10蛋白可以促进A549细胞TLR信号途径中关键分子TLR2、TLR4、MyD88、TRAF6以及核转录因子NF-κB的表达，同时诱导IL-6、TNF-α等炎症因子的分泌，但具体的作用机制则需要进一步的试验来探究。
4 结论利用原核表达系统等成功表达并纯化出rCFP10，且rCFP10对A549细胞具有毒性；rCFP10可促进A549细胞TLR信号途径中关键分子的表达，同时促进炎症因子的分泌，说明结核分枝杆菌CFP10蛋白在感染肺泡上皮细胞过程中具有重要作用。
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