犬瘟热病毒(canine distemper virus, CDV)为副黏病毒科麻疹病毒成员，与牛瘟病毒和麻疹病毒同属，三者在病毒结构和超微形态上几乎完全相同，亲缘关系较近[1-3]，可使易感动物如犬、狐狸、貂等患病，造成大量死亡，且有报道说明宿主范围在不断扩大[4]。CDV是单股负链RNA病毒，基因全长15 690 bp，顺序依次为3′端前导序列→核衣壳蛋白基因→磷蛋白基因(P基因)→基质膜蛋白基因(M基因)→融合蛋白基因(F基因)→血凝素蛋白基因(H基因)→大蛋白基因(L基因)→5′尾随序列[5-7]。目前，CDV只有1个血清型，尚未发现新血清型的相关报道[8-9]。CDV可根据H基因碱基序列的差异和地理位置差异进行分型：亚洲Ⅰ型(Asia-Ⅰ)、亚洲Ⅱ型(Asia-Ⅱ)、美洲Ⅰ型(America-Ⅰ)、美洲Ⅱ型(America-Ⅱ)、欧洲型(European)以及非洲型(Africa)等[10-11]。其中，美洲Ⅰ型(America-Ⅰ)常被称为疫苗型[12]。
等位基因特异PCR(AS-PCR)技术主要基于耐热Taq DNA聚合酶缺乏3′→5′外切校正活性的特点，能直接检测基因点突变[13]。引物3′端的特异碱基分别配对于野毒株和疫苗株的等位基因的相应碱基，当此碱基对形成错配时，延伸反应就会因3′和5′磷酸二酯键形成受阻，因此，“疫苗”株模板阻碍“野毒”株引物放大[14]。目前，犬瘟热主要采用弱毒疫苗免疫的方法进行预防控制，而常用的胶体金检查法不能有效区分疫苗免疫与动物自然感染[15-16]，能够检测并加以区分的实时荧光定量PCR对试验仪器的要求很高，临床检测具有一定局限性。本研究旨在利用引物与模板之间的基因错配对模板进行筛选，建立一种可以快速区分CDV野毒株和弱毒疫苗株的AS-PCR检测方法[17-20]，并结合传统胶体金免疫层析技术，在保证灵敏性的同时缩短检测时间[21-24]。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 主要毒株及样品 CDV野毒株(由6只确诊患犬的肺等组织分离所得)、包含CDV弱毒疫苗株的进口多联疫苗(Y1、Y2)、国产多联疫苗(Y3)、待测血清及口鼻分泌物样品均收集于武汉某动物医院，于-80 ℃保存。
1.1.2 主要试剂与仪器 犬瘟热胶体金快速检测试纸购于上海快灵生物科技有限公司；cDNA合成试剂盒购于Thermo Fisher Scientific公司；RNAiso plus购于TaKaRa公司；Golden Star T6 Super PCR MIX(1.1X)、DL-2000 DNA Marker和DL-5000 DNA Marker均购于北京擎科新业生物技术有限公司。高速冷冻离心机购于Eppendorf公司；PCR仪、凝胶成像系统均购于BioRad公司。TrionX-100；链霉亲和素(SA)购自博奥森生物技术有限公司；牛血清蛋白(BSA)、磷酸缓冲盐溶液(PBS)购自上海生工生物有限公司；生物素化BSA购自BioVision公司；Anti-Fluorescein抗体购自Abcam有限公司；柠檬酸钠溶液、氯金酸溶液、样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫、PVC底板均由华大瑞尔有限公司提供。
1.2 方法1.2.1 病毒RNA提取与反转录 使用犬瘟热胶体金快速检测试纸对野毒株与疫苗株进行检测后按照RNAiso Plus说明书对其提取病毒总RNA，按照cDNA合成试剂盒进行反转录，所得产物用作模板。
1.2.2 PCR扩增与测序 以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系50 μL：1× Golden Star T6 Super PCR MIX 45 μL，正、反向引物(10 mmol·L-1)各2 μL，cDNA 1 μL。反应条件：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，51 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s·kb-1，共30个循环；72 ℃延伸1 min。PCR产物送北京擎科新业生物技术有限公司进行全基因测序。
1.2.3 AS-PCR引物设计 利用DNAMAN软件对6株野毒株、2株进口疫苗株和1株国产疫苗株的全基因组序列进行碱基水平和氨基酸水平分析，确定AS-PCR引物靶基因。并从NCBI筛选出与6株野毒株相同基因型的靶基因序列，比较野毒株与疫苗株的碱基和氨基酸差异，根据AS-PCR引物3′端错配规律[A/G(引物/模板)，G/A，C/C，A/A是有效阻止链延伸反应的错配类型]通过Primer Premier 5.0软件设计AS-PCR引物，筛选能够区分犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的特异性引物。引物均由北京擎科新业生物技术有限公司进行合成。引物信息见表 1。
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表 1 AS-PCR用特异性引物序列 Table 1 Specific primer sequences for PCR |
1.2.4 灵敏性与特异性试验 提取野毒株CDV病毒基因组RNA，反转录得到cDNA后进行2倍梯度稀释，每个浓度的cDNA为模板在梯度温度条件下与筛选出的AS-PCR特异性产物进行扩增，比较扩增效果。
1.2.5 临床样品检测 利用筛选得到的特异性引物进行AS-PCR核酸试纸条组装，将武汉地区采集的患犬口鼻分泌物或血清样本进行RNA提取及反转录以获得cDNA模板，进行AS-PCR扩增后进行AS-PCR核算试纸条检测。AS-PCR的上游特异引物DI2F-157标记生物素和下游通用引物DIR15标记FAM，均标记在引物5′端，由北京擎科生物有限公司合成标记。
2 结果 2.1 基因碱基水平的同源性分析比较对收集得到的6株野毒株和2株疫苗株进行全基因组测序，结合已知疫苗株Y3(CDV/R-20/8株)全基因组序列，分别进行6个基因氨基酸序列与碱基序列的比对以及同源性分析。发现武汉地区6株犬瘟热病毒野毒株和3株疫苗株中各基因碱基水平的相似性：N 92.8%~98.1%，P 93.3%~97.0%，M 94.0%~ 98.4%，F 90.5%~95.5%，H 90.7%~ 95.7%，L 93.3%~ 96.7%；氨基酸水平的相似性：N 97.0%~ 99.6%，P 92.1%~97.2%，M 97.6%~99.4%，F 88.6%~94.6%，H 90.3%~95.9%，L 97.3%~98.6%。根据各基因碱基水平和氨基酸水平的相似性结果，初步确定H基因为AS-PCR引物设计的靶基因。
2.2 野毒株和疫苗株的分型结果对测序的6株野毒株和3株疫苗株进行分型，结果如图 1所示：6株野毒株均为Asia-Ⅰ型，Y1、Y3为America-Ⅰ型，Y2为America-Ⅱ型。
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图 1 H基因分型 Fig. 1 Type results of H gene |
在NCBI上筛选出同为Asia-Ⅰ的H基因序列共173条，结合已测序的6株野毒株与3株疫苗株进行碱基和氨基酸差异比对，比对结果如表 2所示。
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表 2 Asia-Ⅰ型犬瘟热病毒H基因氨基酸和碱基序列差异 Table 2 Differences in amino acid and base sequences of H gene of CDV Asia-Ⅰ strains |
由以上9个较为规律的碱基变异位点结合3′端引物错配规律，得出47、157、178、277和359号氨基酸位点可设计AS-PCR上游引物，如表 3所示。共设计5个上游特异引物和17个下游通用引物，按照扩增片段小于1 000 bp的原则进行组合，共得到71对AS-PCR引物。
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表 3 AS-PCR特异性引物设计位点 Table 3 AS-PCR specific primer design site |
结果发现H基因第469位碱基上G(Asia-Ⅰ型)→A(疫苗株)导致第157位氨基酸上V(Asia-Ⅰ型)→I(疫苗株)，在此差异位点设计的上游特异引物DI2F-157和H基因较保守区设计下游通用引物DIR15的PCR扩增结果可以区分犬瘟热Aisa-Ⅰ型野毒株和疫苗株。图 2为动物免疫疫苗株的阴性样本和犬瘟热野毒株阳性样本的扩增结果，在野毒株阳性样本的扩增结果中出现1个890 bp左右的片段。
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1~4.分别为退火温度在51、54、57、60 ℃下引物2-15(DI2F-157和DIR15)扩增阴性动物免疫疫苗株样本；5.空白对照；6~9.分别为退火温度在51、54、57、60 ℃下引物2-15(DI2F-157和DIR15)扩增犬瘟热野毒株阳性样本；10. DNA相对分子质量标准 1-4. Amplification of negative animal immune vaccine samples primers 2-15 (DI2F-157 and DIR15) at 51, 54, 57, 60 ℃, respectively; 5. Blank control; 6-9. Amplification of positive samples of canine distemper wild virus with primers 2-15 (DI2F-157 and DIR15) at 51, 54, 57, 60 ℃, respectively; 10. DNA marker 图 2 第157位氨基酸引物特异性 Fig. 2 Primer specificity of amino acid 157 |
根据表 4对引物2-15(DI2F-157和DIR15)可进一步优化，综合179株Asia-Ⅰ型的CDV-H基因与引物对应位置碱基的差异统计，确定最后的引物如图 3所示。
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表 4 179株Asia-Ⅰ CDV H基因对应位置的AS-PCR引物 Table 4 AS-PCR primers correspond to the corresponding position of H gene in 179 strains of Asia-Ⅰ CDV |
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图 3 Asia-Ⅰ型CDV H基因AS-PCR特异性引物 Fig. 3 AS-PCR specific primers for H gene of Asia-Ⅰ CDV |
AS-PCR引物灵敏度检测：将浓度为2 ng·μL-1的cDNA模板以2的倍数进行等体积梯度稀释，分别在51、54、57、60 ℃的温度梯度下进行PCR扩增。结果显示，当cDNA模板稀释128倍，即浓度为0.016 ng·μL-1时扩增仍有条带，可用于检测。
AS-PCR引物特异性检测：9株犬瘟热确诊阳性样本中有6株成功扩增，Y1、Y2、Y3疫苗株均未被检出，CDV野毒株阳性的检测正确率约为67%。同时对犬细小病毒阳性样本进行扩增，未被检测出。综上，该引物能够区分野毒株和疫苗株且对犬瘟热野毒株具有一定特异性。
2.6 临床样本检测对疫苗株进行普通胶体金试纸条检测与核酸试纸条检测，结果如图 4所示：发现疫苗株胶体金试纸条检测为阳性，而核酸试纸条检测为阴性。结合6株野毒株均为胶体金确诊阳性病例，说明普通胶体金试纸条无法有效区分野毒株与疫苗株。
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a、b为Y1、Y2疫苗的普通胶体金检测试纸条；c、d为已完成疫苗免疫的健康犬血清样本的AS-PCR扩增产物的核酸试纸条 a and b are common colloidal gold test strips of Y1 and Y2 vaccines; c and d are the nucleic acid test strips of AS-PCR amplification products of healthy dog serum samples immunized with vaccine 图 4 CDV疫苗株胶体金试纸条与核酸试纸条检测结果 Fig. 4 Detection results of colloidal gold strips and nucleic acid test strips to CDV vaccine strains |
对临床收集的16只犬瘟热确诊患犬的肺组织或者血清样本进行RNA提取和cDNA合成，然后进行AS-PCR扩增，再通过CDV核酸试纸条进行检测。结果发现，有12个样本均显示双线，其中T线较不明显，检测结果为弱阳性(图 5)。
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图 5 CDV野毒株核酸试纸条检测结果 Fig. 5 Detection results of nucleic acid test strips of CDV wild strains |
通过对由武汉地区的犬瘟热患犬分离所得的6株样品野毒株和3株疫苗株的分析，发现在碱基水平和氨基酸水平上，野毒株和疫苗株的F基因同源性都是最低，H基因略高于F基因, 且二者差异不大，所以把H基因和F基因作为AS-PCR引物的备选基因。比对野毒株和疫苗株的F基因和H基因上的差异位点，笔者发现在F基因上关于样品野毒株和疫苗株共有19个较为规律的碱基差异位点，6株或大部分的样品野毒株在该位点上碱基种类相同，但与至少2株以上的疫苗株不同，这些差异位点集中在第8—122位氨基酸有14个，剩下的1个在208位氨基酸，4个在400—600位氨基酸；同样，H基因上共有12个较为规律的碱基差异位点，且均匀分布。对比样品野毒株和疫苗株，F基因碱基水平和氨基酸水平的相似性分别是90.5%~95.5%和88.6%~94.6%，H基因碱基水平和氨基酸水平相似性分别是90.7%~95.7%和90.3%~95.9%，Iwatsuki等[25]研究发现，H蛋白基因相似性最低；比较野毒株和疫苗株，H基因碱基水平和氨基酸水平相似性分别是90%~93%和89%~92%，F基因碱基水平和氨基酸水平相似性分别是90.1%和95.7%，以上数据与本试验存在部分差异，可能与本试验所收集的犬瘟热病毒均来自武汉地区有关。野毒株和疫苗株在F基因上氨基酸水平明显低于碱基水平，分析发现F基因由于碱基差异引起氨基酸差异明显高于H基因，即F基因上可能存在更多没有明显规律的变异，更无序，尤其是在前140个氨基酸是变异集中区，与已有研究发现F基因在前1~135个氨基酸差异达到27.5%结果一致[26]。
犬瘟热病毒的分型是根据H基因进行，America-Ⅱ又常被称为疫苗型；在对野毒株的驯化过程中H基因的变异最大，H蛋白的糖基化位点的减少与病毒毒力相关；犬瘟热病毒通过H蛋白识别并吸附到细胞受体启动犬瘟热病毒感染过程，说明H蛋白决定了宿主和病毒的组织嗜性，且不同毒株对宿主的融合能力主要取决于H蛋白；综上多种因素，最终确定在H基因上设计AS-PCR引物[27-30]。对H基因分析发现6株野毒株都是Asia-Ⅰ，疫苗-1和疫苗-3是America-Ⅰ，疫苗-2是America-Ⅱ。在NCBI上筛选出同为Asia-Ⅰ的犬瘟热病毒H基因序列共173条，结合6株已测序的野毒株和3株疫苗株，即共179株Asia-Ⅰ的H基因碱基序列和3株疫苗株H基因序列有9个较为规律的碱基(氨基酸)变异位点中，受体SLAM结合位点有4个(1：502，503；2：526，529，548，550；3：187~191；4：520，537，539，548)，以上4个位点均没有发现存在野毒株和疫苗株之间氨基酸的明显变异，这与Ohishi等[31]的研究一致。
本研究发现，Asia-Ⅰ毒株与疫苗株比较，第277位苏氨酸/异亮氨酸突变为天冬酰胺，但此前相关研究中并未发现H基因第277位氨基酸变异的相关信息，而H基因上为天冬酰胺的数量增加会导致潜在的N-糖基化位点增加，蛋白上的氨基酸疏水性和N-糖基化位点会对免疫原性产生影响，H蛋白上的N-糖基化能掩盖抗原表面，从而妨碍H蛋白与中和抗体结合，也会影响犬瘟热病毒毒力，关于第277位氨基酸是否会影响犬瘟热病毒毒力需进一步研究[32-33]。
4 结论通过病例收集确定武汉地区流行的CDV是Asia-1型，比较武汉地区6株野毒株和3株弱毒疫苗株碱基序列后确定在H基因上设计AS-PCR特异性引物，综合179株Asia-1型CDV-H序列发现H基因上有9个较稳定的碱基变异位点，H基因第469位碱基上G→A，导致第157位氨基酸上V→I，根据差异位点设计出的AS-PCR上游特异性引物和H基因较保守区的下游通用产物DIR15能够区分野毒株和疫苗株。该检测方法准确度不仅高于一般的胶体金试纸条检测法，同时还能够对疫苗株造成的阳性与野毒株感染进行区分，能够更加有效地辅助诊断。
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