口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)感染引起的一种急性、热性、高度接触性动物传染病^[1-3]。我国防控FMD的技术路线主要是以分阶段、分区域的免疫净化防控策略，通过强制免疫、降低疫病发生率、逐步净化畜群、最终达到控制和消灭FMD的目的，推广建设免疫无FMD区或非免疫无FMD区，最终实现全国免疫无疫或非免疫无疫^[4-5]。当前，根据不同血清型FMDV的流行状况，采取分区域的疫苗免疫和感染状况监测相结合的防控策略，严格执行国家FMD免疫计划，建立FMD免疫退出和再进入机制，加强免疫抗体监测评估，进一步提升疫苗质量，减少甚至消除疫苗免疫对感染与免疫动物鉴别诊断的干扰，从而为免疫净化防控策略的实施创造条件^[6]。在免疫背景下，感染状况的监测对我国口蹄疫区域净化进程和FMD无疫区建设评估至关重要^[6-8]。国产灭活疫苗抗原的纯净度是否达到国际标准，是否对鉴别诊断产生干扰，迫切需要进行田间应用效果的评价，为口蹄疫的防控和净化提供参考。

灭活疫苗是当前FMD免疫的主要疫苗类型，目前的疫苗生产工艺已进入到悬浮培养与病毒抗原浓缩纯化时代，疫苗的质量已有显著提升^{[4, 9-10]}。非结构蛋白抗体是否产生是免疫背景下进行感染状况评价的主要依据，其前提条件是灭活疫苗免疫后不应该产生非结构蛋白抗体^[11-13]。FMD灭活疫苗在抗原纯化过程中可以将绝大部分的FMDV非结构蛋白去除，多次免疫动物后检测不到非结构蛋白抗体，然而自然感染的动物体内既能产生结构蛋白抗体又能产生非结构蛋白抗体，这样就能够区分疫苗免疫动物和自然感染动物^[[14-15]。但是，纯化不好的灭活疫苗会残留非结构蛋白，多次免疫动物后仍然会产生非结构蛋白抗体^[14]，这会给感染状况评价与免疫无疫区评估带来干扰，严重阻碍我国无疫区的建设与国际认可。

本研究参考国际动物卫生组织(OIE)推荐的FMD疫苗抗原纯净度检验方法^[15]，选择FMD抗体全阴性的健康未成年牛，对我国3个口蹄疫灭活疫苗生产企业的FMD灭活疫苗进行了免疫效果与抗原纯净度检验，通过检测结构蛋白抗体和非结蛋白抗体来评价灭活疫苗的免疫效果及其对感染与免疫鉴别诊断的干扰，为我国FMD免疫净化防控策略的制定和实施，以及FMD免疫无疫区建设评估提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 疫苗

选用3个FMD疫苗生产企业的4组正规灭活疫苗进行试验。

A企业a1组疫苗：口蹄疫O、A型二价灭活疫苗，批号：E170518 J(一免，146S为33 μg·头份^-1)、E170621 J(二免，146S为35 μg·头份^-1)、E170725 J(三免和四免，146S为35 μg·头份^-1)。a2组疫苗：口蹄疫病毒O、A型二价灭活，批号：E171149 J，146S为34 μg·头份^-1，3次免疫使用相同批号疫苗。

B企业b组疫苗：口蹄疫病毒O、A、Asia1型三价灭活疫苗，批号：1612002，146S为19 μg·头份^-1，3次免疫使用相同批号疫苗。

C企业c组疫苗：口蹄疫病毒O、A、Asia1型三价灭活疫苗，批号：17351453，146S为62 μg·头份^-1，3次免疫使用相同批号疫苗。

1.2 试验动物

在甘肃省荷斯坦奶牛繁育中心筛选6~12月龄未免疫过任何疫苗的健康小牛，经检测FMDV抗体均为阴性，a1组148头，a2组107头，b组163头，c组107头。每组试验牛独栏且由专人饲养，饲养条件可以保证试验牛不被FMDV感染。

1.3 主要试剂

FMDV非结构蛋白3ABC阻断ELISA抗体检测试剂盒(3B-Mab)、检测O、A型抗体的液相阻断ELISA(Liquid-phase blocking ELISA，LPBE)试剂盒和Multiplex RT-PCR检测试剂盒均购自中国农业科学院兰州兽医研究所；国际上认可度较高的检测FMDV 3ABC抗体的PrioCHECK NS ELISA试剂盒购自Prionics公司。

1.4 方法

1.4.1 免疫和采血 　　按照疫苗说明书免疫试验牛，免疫程序参照OIE FMD疫苗纯净度检验指南，间隔1个月免疫1次，至少连续免疫3次，每次免疫前和最后1次免疫后1个月采血、分离血清，检测血清中结构蛋白和非结构蛋白3ABC抗体水平。

1.4.2 免疫抗体的分析方法 　　每个试验组均固定抽取60头牛检测免疫前后结构蛋白抗体水平的变化来分析疫苗的免疫效果。首先根据FMD抗体LPBE检测试剂盒说明书中ELISA抗体滴度与免疫动物攻毒保护的关系，抗体滴度 < 1:16不保护，1:(22~90)为50%保护，≥1:128为99%以上保护，以抗体滴度≥1:128判定为免疫抗体合格，计算每次免疫后的抗体合格率；同时结合国家FMD强制免疫计划的要求，群体水平抗体合格率>70%，认为达到了国家规定的免疫合格标准。结合上述两个判定条件来评价疫苗的免疫效果。

1.4.3 对感染与免疫鉴别诊断干扰的分析方法 　　由于试剂盒生产工艺、检测抗原与抗体等的不同，不同厂家试剂盒的检测结果可能会存在一定的差异。因此，使用中国农业科学院兰州兽医研究所和Prionics公司生产的FMDV 3ABC阻断ELISA抗体检测试剂盒对比检测免疫后3ABC抗体的阳转情况，以评价疫苗抗原纯净度和对鉴别诊断的干扰；判定标准均为阻断率(PI)≥50%判定为阳性，两种试剂盒检测结果相互印证，以两种试剂盒检测均为阳性者，判定为3ABC抗体阳转动物。

1.4.4 FMDV非结构蛋白抗体阳性动物病原学检测 　　将1~3次免疫后非结构蛋白3ABC抗体阳性牛进行FMDV病原学监测，使用食道探杯采集牛咽喉分泌物(OP液)，利用本单位研制的FMDV RT-PCR检测试剂盒检测OP液中FMDV基因，具体操作按照试剂盒说明书进行。

2 结果 2.1 首免前血清抗体检测

首免前对每个试验组牛进行FMDV抗体检测，使用两种3ABC抗体检测试剂盒检测了免疫前血清，结果显示阻断率均 < 50%，均为阴性，图 1为a1组首免前牛的FMDV非结构蛋白抗体检测结果；每组随机选60头牛血清检测了结构蛋白抗体，结果显示结构蛋白抗体效价均 < 1:16，均为阴性，图 2为a1组牛的FMDV结构蛋白抗体检测结果。检测结果表明，4个试验组牛均为FMD非免疫健康牛，且未免疫任何疫苗，牛的品种单一，能够满足本研究的要求。

2.2 免疫后结构蛋白抗体检测

O和A型LPBE抗体检测结果显示，A企业的a1组疫苗一免至四免后的O和A型抗体合格率均为100%；a2组疫苗首免合格率O型36.7%、A型15%，二免合格率O型98.3%、A型86.7%，三免合格率均达100%，且抗体滴度均≥1:360；b组疫苗首免合格率O型18.3%、A型1.7%，二免合格率O型97%、A型45%，三免合格率O型100%、A型53.3%；c组疫苗一免合格率O型26.7%、A型21.7%，二免合格率O型96.7%、A型71.7%，三免合格率均达100%，且抗体滴度均≥1:180。4组疫苗免疫抗体合格率比较见图 3。不难看出，首免不能确保达到免疫合格状态，且疫苗抗体水平随免疫次数增加，抗体水平显著升高。

2.3 免疫后非结构蛋白抗体检测

非结构蛋白抗体检测结果显示，a1组疫苗两种方法检测的3ABC抗体阳性率：一免分别为4.7%和3.3%，二免分别为8.6%和4.3%，三免分别为15.5%和10.8%，四免分别为10.25%和8.8%；两种方法复核一致的阳性率：一免0.7%，二免1.4%，三免9.5%，四免4.8%。a2组疫苗两种方法检测的3ABC抗体阳性率：一免均为阴性，二免分别为4.7%和1.9%，三免分别为1.9%和0%，两种方法复核一致的阳性率为零。b2组疫苗两种方法检测的3ABC抗体阳性率：一免均为0.6%，二免分别为0.6%和0%，三免分别为1.3%和0.6%，两种方法复核一致的阳性率仅出现于三免后为0.6%。c组疫苗两种方法检测的3ABC抗体阳性率：一免分别为0%和0.9%，二免分别为1.9%和0%，三免均为阴性，复核检测一致的阳性率为零。检测结果详见表 1~4。

2.4 非结构蛋白抗体阳性牛的FMDV病原学检测

1~3次免疫后，采集了两种FMDV非结构蛋白抗体检测试剂盒检测的阳性牛OP液共69头份，经用口蹄疫病毒RT-PCR检测试剂盒检测均未扩增到FMDV基因，图 4为a1组第3次免疫后3ABC抗体阳性的部分牛OP液检测结果。说明FMDV非结构蛋白抗体阳性牛是疫苗免疫后造成的，而非感染FMDV所致。

3 讨论

近年来，我国FMD灭活疫苗质量有了明显的提升，国家管理部门不断从免疫效力^[16]、总蛋白含量^[16-17]、内毒素的含量^[17]、疫苗的纯度等多个方面制定和实施了疫苗质量检测标准和检测方法，但各生产企业疫苗毒种的差异，抗原浓缩纯化工艺不同，致使疫苗质量参差不齐。根据国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020)，当前是我国FMD控制和净化的关键阶段^[5-6]，所以深入了解我国FMD疫苗产品免疫效果及其对鉴别诊断的干扰情况，为我国FMD疫苗质量监管、疫苗使用选择以及免疫净化方案的制定等方面提供科学依据。

兰州兽医研究所马军武研究员等已经明确了口蹄疫LPBE抗体滴度与攻毒保护的相关性，牛、羊免疫抗体滴度≥1:128、猪≥1:64时99%以上保护，认定为免疫合格^[18]。本试验结果显示仅A企业a1组疫苗首免后免疫合格率达到了国家规定的70%，其他组疫苗首免合格率介于1.7%~36.7%；二次加强免疫后，O型抗体合格率介于96.7%~100%，A型抗体合格率除B企业疫苗未达标，其他两个企业的疫苗均>70%；三免后，O型抗体合格率100%，且大多数抗体滴度在1:720以上，A型抗体合格率除B企业疫苗未达标，其他苗的合格率均为100%。由以上数据可见，目前使用的灭活疫苗，首免1个月的抗体合率普遍达不到70%以上，进一步说明首免后1个月加强免疫的重要性。

非结构蛋白抗体水平是OIE进行口蹄疫免疫无疫区和非免疫无疫区检测评估认证的关键性指标^[15]。我国口蹄疫疫苗的质量标准不断提升和无疫区国际认可的需求，对疫苗抗原纯净度的质量检验也提出了新的要求，但目前还没有正式标准颁布。许多研究人员也调查了不同厂家疫苗免疫后非结构蛋白抗体的阳性率，但由于不同纯化水平的疫苗混用，使得检测结果不能准确地反映当前使用的抗原纯化灭活疫苗的抗原纯净度^{[4, 19-20]}；2018年OIE专家组对我国口蹄疫防控情况进行实地检查时，也提出需要对疫苗进行纯净度检验，否则无法解释动物群体中检测出的非结构蛋白抗体阳性结果，是由于疫苗抗原不纯导致的，还是由于感染产生的阳性结果。为此，本试验选择了防疫规范的奶牛场作为试验点，一是品种来源比较纯，二是每组牛日龄相差不大，三是每个试验组单独隔栏饲喂，尽可能地减少误差。根据免疫效果与抗原纯净度的检测发现，A企业a1组疫苗首免后抗体合格率很高，但是三免后3ABC抗体阳转牛的数量呈上升趋势，三免后3ABC抗体阳性多达14例，四免后，3ABC抗体阳转动物减少至7例，随着免疫次数的增加，3ABC抗体阳性率并未显示累积增加效应；且对免疫1~3次后非结构蛋白抗体阳性的所有牛进行了OP液中FMDV检测，佐证了非结构蛋白抗体确实是由于疫苗免疫造成的，而非试验过程感染了FMDV。A企业a1组疫苗虽然达到了OIE对疫苗抗原纯净度检验(1/8以下阳性)的要求，但对感染与免疫鉴别诊断产生了明显的干扰，说明该组疫苗的纯化工艺制备的抗原没有完全去除非结构蛋白3ABC，同时若依据OIE的抗原纯净度检验标准，则不能准确评价我国口蹄疫疫苗的抗原纯净度，需要免疫更多的动物来评价。A企业a2组疫苗与C企业生产的疫苗抗原纯净度较好，虽然单一方法检测有3ABC抗体阳性结果出现，但两种方法检测均为阳性者为零，说明出现的阳性结果是由于非特异性反应所致，也说明对免疫群体进行3ABC抗体检测时，需要对阳性结果进行复核检验，以排除方法本身产生的一些误差。B企业提供的疫苗前两次免疫后均未检测出3ABC抗体阳转牛，3次免疫后1个月，两种方法复核检测到了1例3ABC抗体阳性牛(3ABC抗体阳性率达0.6%)，对感染与免疫鉴别诊断产生了微弱的干扰。

血清学诊断的准确性与多种因素有关，如反应模式、所用抗原抗体、操作过程等，不同试剂盒的检测结果可能存在一定的误差^[13]；另外FMDV非结构蛋白阻断ELSIA抗体检测方法是目前国际上认可度较高的一种区分FMDV感染与免疫动物的血清学方法^[20-21]。当前还没有疫苗抗原中非结构蛋白含量检测方法，只能将疫苗多次免疫动物后，通过检测非结构蛋白抗体来定性评价抗原的纯净性。因此，本研究使用了两种非结构蛋白阻断ELISA抗体检测试剂盒进行了比较检测，排除了非特异性干扰，将两种方法均检测为阳性者判定为真阳性结果，更加准确地反映了不同企业生产的灭活疫苗的抗原纯净度。

4 结论

通过对我国3个企业的FMD灭活疫苗免疫效果及其对感染与免疫鉴别诊断干扰的比较分析得知，当前FMD疫苗抗原的生产与纯化工艺达到了较好的水平，但是，放大动物数量进行评价时，个别批次的疫苗产品仍然对感染与免疫鉴别诊断存在一定程度的干扰，提示疫苗企业，在抗原纯化工艺方面需要进一步改进并稳定生产工艺。同时，首免1个月后必须加强免疫，在疫苗配制工艺方面还有进一步提升的空间，提高首免抗体合格率。对种畜要经过十多次的免疫，很难确保非结构蛋白抗体阴性，那么亟待研制出能区分感染与免疫的标记疫苗、亚单位等新型基因工程疫苗。因此，当前生产的口蹄疫灭活疫苗若进一步改进和稳定抗原浓缩及纯化工艺，或使用能精确甄别感染与免疫的口蹄疫标记疫苗等基因工程疫苗将极大地助力我国口蹄疫的防控和净化，加速我国口蹄疫免疫无疫区的建设和认证。

致谢: 感谢3个口蹄疫疫苗生产企业无偿提供口蹄疫灭活疫苗，感谢甘肃荷斯坦奶牛繁育示范中心提供试验场所以及帮助免疫和采血。