非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是猪的一种烈性传染病，强毒株感染猪的死亡率可达100%^[1]。该病于1909年首次在肯尼亚发现，至今在撒哈拉以南的非洲国家一直呈地方性流行^[2]。1957年、1960年ASF两次传入葡萄牙，并在多个西欧国家流行，直到1995年才得以根除^[3]。2007年，ASF传入格鲁吉亚，很快传播到高加索地区和俄罗斯联邦等邻国，目前，在13个欧洲国家流行^[3]。在我国，2018年8月辽宁沈阳首次暴发ASF疫情，至今31个省(市、自治区)和香港特别行政区均有疫情报道，给我国养猪业带来沉重打击^[4-5]。

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)多为血吸附阳性，能吸附猪红细胞形成特征性的红细胞花环，与病毒编码的血吸附蛋白有关^[6-7]。血吸附蛋白是ASFV的毒力因子和免疫逃逸蛋白，因此是研制基因缺失苗的常用靶基因^[8-10]。然而，ASFV基因缺失苗存在较大的安全隐患，特别是基因突变或重组导致新毒株流行的可能性，所以有必要进行基因缺失苗接种与自然感染猪的鉴别诊断^[11-13]。

ASFV的血吸附蛋白由EP402R基因编码，全长肽链由375个氨基酸组成，包括信号肽(1—16 aa)、胞外区(17—207 aa)、跨膜区(208—228 aa)和胞内区(229—375 aa)^[14]。其中，胞外区的两个免疫球蛋白样结构域是红细胞的结合部位，与小鼠、大鼠和人CD2分子具有一定的序列同源性，据此将ASFV血吸附蛋白称为CD2分子的同源物，简称CD2v^[15]；胞内区与细胞CD2分子无序列同源性，在不同ASFV毒株之间高度保守^[15]。尽管ASFV感染康复猪可以产生血吸附抑制抗体，也能用于病毒的血清学分群^[16]，但多数感染猪的血吸附抑制抗体滴度都较低^[17]。尽管用昆虫细胞表达的CD2v免疫猪可以产生血吸附抑制抗体，但需要与弗氏佐剂进行反复免疫^[17]。ASFV血吸附抑制抗体针对CD2v的胞外区，其免疫原性低的原因尚不清楚，而胞内区的免疫原性尚无研究报道。

组氨酸标签是目前最常用的重组蛋白纯化标签，但其融合抗原不仅需用价格较贵的镍亲和柱纯化，而且可能与带相同标签的重组亚单位疫苗免疫血清发生交叉反应。类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptide, ELP)是根据体内弹性蛋白的五肽重复序列合成的聚合物，具有温度敏感的可逆相变特性，其融合蛋白可用简单的相变循环纯化^[18]。因此，本研究对ASFV的CD2v氨基酸序列进行抗原指数分析，将抗原指数较高的胞内区与ELP进行融合表达，通过相变循环进行融合蛋白纯化，利用蛋白酶切除ELP标签，用获得的重组CD2v抗原建立了ELISA抗体检测方法，有望用于ASFV CD2v基因缺失苗接种与自然感染猪的鉴别诊断。

1 材料与方法 1.1 主要试剂

含FLAG标签的ELP融合表达载体pET-ELP由本实验室构建和保存；TEV蛋白酶活性包涵体由本实验室制备；ASFV多抗原(p54、pK205R和pB602L)ELISA抗体检测试剂盒由本课题组研制，在英国动物卫生所世界动物卫生组织(OIE)非洲猪瘟参考实验室，利用200余份已知血清进行检测验证，研究成果已获得专利授权(专利号：CN201310193976.0)；检测血清采自国内某ASFV感染猪场，淘汰前采血分离血清，根据多抗原ELISA检测结果分为ASFV抗体阳性和阴性血清；辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗猪IgG为Abcam公司产品；FLAG标签单克隆抗体为日本MBL公司产品；ELISA和免疫转印用四甲基联苯胺(TMB)显色液为碧云天生物技术有限公司产品。

1.2 生物信息学分析

从GenBank下载SY18株ASFV CD2v(EP402R)氨基酸序列(GenBank登录号：MH766894.1)，用Lasergene软件包(DNAStar，USA)中的Protean软件进行二级结构分析，其中抗原指数(Antigenic index)分析用Jameson-Wolf法进行，选择CD2v蛋白胞质内高抗原指数区域进行表达试验。

1.3 表达载体构建

SY18株ASFV CD2v(EP402R)基因(GenBank登录号：MH766894.1)由上海生工生物工程有限公司合成，克隆在pUC-57质粒载体中，命名为pUC-EP402R。根据预测的CD2v胞质内区域编码序列设计1对PCR引物，正向引物序列：5′-TAGGATCCCGAAAAAGAAAAAAACATGTTGA-3′ (下划线为引入的BamHⅠ酶切位点)；反向引物序列：5′-TAGAATTC AGGTAGTGGTTTGGGTG-GA-3′(下划线为引入的EcoRⅠ酶切位点)，预期PCR扩增产物为318 bp。以pUC-EP402R为DNA模板进行PCR扩增，将PCR产物克隆入pMD18-T载体，提取重组质粒DNA送上海生工生物工程有限公司，用通用引物进行序列测定。用限制性酶BamHⅠ和EcoRⅠ将序列正确的CD2v基因片段从pMD18-T载体上切下，插入pET-ELP载体中TEV蛋白酶识别位点和FLAG标签之间，获得的重组载体命名为pELP-CD2v。

1.4 融合蛋白诱导表达

将重组载体pELP-CD2v转化BL21(DE3)株大肠杆菌，挑取单菌落接种卡那霉素(50 μg·mL^-1)LB培养液，37 ℃摇床培养过夜。按照1:100体积比，将重组菌培养物接种卡那霉素2×YT培养基，37 ℃摇床培养5 h，加入0.2 mmol·L^-1 IPTG (终浓度)，30 ℃摇床诱导表达6 h。4 ℃、5 000 g离心10 min，离心沉淀菌体用1/20培养基体积的PBS悬浮，冰浴中超声波充分裂解；4 ℃、12 000 g离心10 min，收集离心上清液，重复离心1次，取离心上清液进行融合蛋白纯化。

1.5 融合蛋白纯化

取重组菌裂解液7份，加入等体积6 mol·L^-1NaCl，分别在22、24、26、28、30和32 ℃，孵育10 min，设未纯化重组菌对照，室温12 000g离心5 min，离心沉淀用PBS悬浮，取样进行12%SDS-PAGE分析，考马斯蓝染色后用凝胶成像系统(GelDocXR)进行蛋白条带灰度扫描，用Image Lab图像分析软件计算蛋白浓度，以目的蛋白最多、杂蛋白最少为判定标准，选择最佳的ELP-CD2v融合蛋白相变温度。再取重组菌裂解液6份，分别加入等体积1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mol ·L^-1 NaCl，设不加NaCl对照，在最佳相变温度孵育10 min，如前进行离心和电泳分析，以目的蛋白最多、杂蛋白最少为判定标准，选择纯化ELP-CD2v融合蛋白所需的盐浓度。再取重组菌裂解液5份，加入最佳浓度NaCl和0、0.1%、0.2%、0.5%、1%Triton X-100，在最佳相变温度孵育10 min，如前进行离心和电泳分析，以目的蛋白最多、杂蛋白最少为判定标准，选择纯化ELP-CD2v融合蛋白所需的Triton X-100浓度。最后取重组菌裂解液200 mL，加入最佳浓度的NaCl和Triton X-100，在最佳相变温度孵育10 min，室温12 000 g离心5 min，离心沉淀用PBS悬浮，取样进行SDS-PAGE分析。

1.6 ELP标签切除

ELP-CD2v融合蛋白的ELP标签切除参考文献[14]进行，融合蛋白浓度为3.6 mg·mL^-1，TEV蛋白酶活性包涵体用量为100 μg·mL^-1，切割条件为30 ℃、12 h。切割反应完成后，在最佳条件下进行再次相变循环，取离心上清液(含重组CD2v)进行SDS-PAGE电泳分析。

1.7 重组CD2v蛋白免疫鉴定

重组CD2v抗原(1 μg)经过12%SDS-PAGE分离后，利用湿转印法转移硝酸纤维素膜。将转印膜置于含5%脱脂乳粉的PBS中，37 ℃封闭2 h。分别加入PBST(含0.05% Tween 20的PBS)稀释的FLAG抗体(1:2 000)和ASFV抗体阳性猪血清(1:100)，37 ℃孵育1.5 h，PBST洗涤3次。加入PBST稀释(1:10 000)辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗猪或羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h，PBST洗涤3次。加入免疫转印用TMB底物溶液，室温避光显色10 min。

1.8 重组CD2v抗原ELISA的建立

在初步试验基础上，用碳酸盐溶液(pH9.6)将纯化的重组CD2v抗原稀释至0.5 μg·mL^-1，加入酶标板各孔，100 μL·孔^-1，设不加抗原空白对照孔，4 ℃包被过夜；甩去抗原包被液，PBST洗板1次；加含5%脱脂乳粉的PBST(含0.05%Tween 20的PBS)，200 μL·孔^-1，37 ℃封闭1.5 h；加封闭液稀释(1:200)检测血清，100 μL·孔^-1，37 ℃孵育1 h，PBST洗涤3次；加入封闭液稀释(1:10 000) HRP标记羊抗猪IgG，100 μL·孔^-1，37 ℃孵育1 h，PBST洗板3次；加入ELISA用TMB显色液，100 μL·孔^-1，室温避光显色15 min；加入1 mol ·L^-1硫酸，50 μL·孔^-1，立即以空白对照孔调零，用酶标仪读取各孔OD_{450 nm}值，用Microsoft Excel 2010计算ASFV抗体阴性猪血清的OD_{450 nm}平均值和标准误，以OD_{450 nm}平均值+3倍标准误作为抗体阳性血清的判定阈值。

1.9 重组CD2v抗原ELISA的初步应用

将50份ASFV感染猪血清在56 ℃灭活60 min，用ASFV多抗原ELISA进行检测。多抗原ELISA的包被抗原为重组p54、pK205R、pB602L混合抗原，抗原浓度分别为0.5、2.0和2.0 μg·mL^-1，操作过程与重组CD2v抗原ELISA相同，ASFV抗体阳性血清的判定阈值为OD_{450 nm}值≥ 0.163。根据多抗原ELISA检测结果，选择ASFV抗体阳性和阴性血清各15份，按照上述程序进行重组CD2v抗原ELISA检测。

2 结果 2.1 CD2v抗原指数分析

氨基酸序列的二级结构分析结果显示，CD2v蛋白胞外区含6个抗原指数较高的氨基酸区域，但分散存在而且均较短，分别为30—40、56—62、66—70、129—137、150—156和178—184位氨基酸区域；胞内区抗原指数不仅普遍较高，而且紧密连成3个高抗原指数区域，分别是231—281、289—296和299—333位氨基酸(图 1)。因此，本研究选择CD2v蛋白胞内区(231—333位氨基酸)进行表达研究。

2.2 ELP-CD2v融合表达载体的鉴定

将ASFV CD2v蛋白胞内区基因片段克隆入pET-ELP载体，获得的重组载体pELP-CD2v用BamHⅠ/EcoRⅠ酶切鉴定，结果显示切出的基因片段为预期的318 bp(图 2)。序列测定结果显示重组载体中的CD2v基因片段无突变。

2.3 ELP-CD2v融合蛋白的表达分析

SDS-PAGE分析结果显示：与未诱导pELP-CD2v重组菌相比，IPTG诱导重组菌出现约68 ku的额外蛋白条带，表达产物为可溶性蛋白，存在于裂解重组菌的离心上清液中(图 3)。

2.4 ELP-CD2v融合蛋白的相变温度测定

在3 mol·L^-1NaCl条件下，分别将pELP-CD2v重组菌裂解液在不同温度条件下进行相变循环。SDS-PAGE分析结果显示，ELP-CD2v融合蛋白的最佳相变温度为28 ℃，相变循环纯化的融合蛋白的回收率最高(73.9%)，菌体杂蛋白无明显差异(图 4)。

2.5 纯化ELP-CD2v融合蛋白的盐浓度优化

分别将pELP-CD2v重组菌裂解液与不同浓度NaCl混合，在28 ℃进行相变循环。SDS-PAGE分析结果显示：在1.5 mol·L^-1NaCl条件下，相变循环纯化的ELP-CD2v融合蛋白的回收率最高(79.2%)，菌体杂蛋白无明显差异(图 5)。

2.6 纯化ELP-CD2v融合蛋白的Triton X-100浓度优化

向pELP-CD2v重组菌裂解液加入1.5 mol·L^-1NaCl和不同浓度Triton X-100，在28 ℃进行相变循环。SDS-PAGE分析结果显示：在1.5 mol·L^-1NaCl和0.2% Triton X-100条件下，相变循环纯化的ELP-CD2v融合蛋白的回收率最高(78.3%)，菌体杂蛋白明显减少(图 6)。

2.7 ELP-CD2v融合蛋白的纯化与ELP标签切除

在优化条件(28 ℃、1.5 mol·L^-1NaCl、0.2% Triton X-100)下进行1次相变循环，SDS-PAGE分析显示纯化的ELP-CD2v融合蛋白的纯度为76.3%，回收率为53.2%。用TEV蛋白酶活性包涵体切除ELP标签，然后进行再次相变循环，SDS-PAGE分析显示回收的重组CD2v蛋白的纯度为91.7%(图 7)。

2.8 重组CD2v蛋白的免疫鉴定

将纯化的重组CD2v蛋白转印硝酸纤维素膜，分别用Flag标签特异抗体和ASFV抗体阳性血清进行免疫转印试验，结果显示重组CD2v蛋白能被Flag抗体和ASFV抗体阳性血清识别，分子量约为18ku，较理论计算值约大5 ku(图 8)。

2.9 重组CD2v抗原ELISA的初步应用

根据多抗原ELISA检测结果，选择ASFV抗体阴性和阳性血清各15份，用重组CD2v抗原ELISA进行检测，结果显示15份ASFV抗体阴性血清的OD_{450 nm}平均值为0.074，标准误为0.026，以抗体阴性血清OD_{450 nm}平均值+3倍标准误为标准，将抗体阳性血清的判定阈值定为0.152，与多抗原ELISA的判定阈值(0.163)非常接近。在此条件下，重组CD2v抗原ELISA检测30份血清的结果与多抗原ELISA完全相符(表 1)。

3 讨论

近年来，ASFV基因缺失苗已经取得了一定的研究进展，其中CD2v(血吸附蛋白)是常用的靶基因之一^[8-10]，但尚未考虑基因缺失疫苗接种与自然感染猪的鉴别诊断。为此，本研究进行重组CD2v抗原表达研究，旨在建立ASFV CD2v抗体的血清学检测方法。然而，目前普遍认为CD2v蛋白的免疫原性较弱，多数ASFV感染猪的血吸附抑制抗体水平较低甚至检测不到^[17]，但缺少合理的解释。将ASFV CD2v确定为细胞CD2同源物的主要依据是其胞外区与小鼠、大鼠和人CD2具有一定的氨基酸序列同源性，但相似性并不高，分别为11.14%、10.05%和12.29%^[15]。CD2v与猪CD2的序列相似性至今尚无报道。本研究将SY18株ASFV CD2v胞外区氨基酸序列提交GenBank进行序列同源性搜索，结果未发现与猪CD2具有序列同源性。因此，CD2v蛋白的弱免疫原性似乎难以用序列同源性来解释。西班牙学者们用表达ASFV CD2v基因的重组杆状病毒感染昆虫细胞，然后用感染细胞进行猪免疫试验，结果显示可以产生CD2v特异抗体。用此免疫血清进行免疫荧光试验，结果在重组杆状病毒感染细胞中能检测到CD2v表达，但与ASFV病毒颗粒反应阴性，据此认为病毒颗粒的含量低是CD2v免疫原性低的原因^[17]。然而，这似乎也不能解释CD2v的弱免疫原性，因为p30也是ASFV次要结构蛋白，病毒颗粒中的含量(0.13%)与CD2v较接近(0.06%)^[20]，却能诱导坚强的抗体应答^[21]。本研究的序列分析显示，CD2v胞内区氨基酸不仅抗原指数普遍较高，而且紧密相连，提示CD2v胞内区的免疫原性较强。虽然胞外区也有抗原指数较高的氨基酸区域，但分散存在而且多为5~6个氨基酸，因此推测CD2v胞外区的弱免疫原性可能与其氨基酸组成有关。

组氨酸标签是目前最常用的重组蛋白纯化标签，其融合蛋白需用价格较贵的镍亲和柱纯化。另外，我国猪场使用带组氨酸标签的重组亚单位疫苗已较普遍，使用带组氨酸标签的重组抗原进行抗体检测有可能出现交叉反应。因此，本研究将ASFV CD2v胞内区与ELP进行融合表达，利用简单、经济的相变循环进行融合蛋白纯化，然后用TEV蛋白酶活性包涵体切除ELP标签。相变循环纯化ELP融合蛋白的前提是表达产物必须是可溶性蛋白，因此本研究在20 ℃条件下缓慢诱导ELP-CD2v融合蛋白表达，结果大部分表达产物为可溶性蛋白，能够利用相变循环进行纯化。相变温度和盐浓度是ELP相变循环的两个重要参数，与目的蛋白的结构和长度有关，因此本研究对ELP-CD2v融合蛋白的相变温度和氯化钠浓度进行了优化，在优化条件下进行1次相变循环，但纯化的融合蛋白纯度较低(约60%)，重复相变循环也无明显改进。由于相变循环可在低浓度去污剂存在的条件下进行^[22]，因此, 本研究在不同浓度Triton X-100条件下进行相变循环，结果显示在0.2% Triton X-100条件下，相变循环纯化的ELP-CD2v融合蛋白的纯度有所提高(76.3%)。在切除ELP标签后进行再次相变循环，回收的重组CD2v蛋白纯度高达91.7%。应当指出的是，本研究纯化的重组CD2v蛋白C端含FLAG标签，理论计算相对分子质量为13 ku，但在SDS-PAGE凝胶上显示为约18 ku的蛋白条带，可能与其中性等电点(pH 7.0)导致的迁移速度较慢有关。免疫转印结果显示，重组CD2v蛋白能被FLAG抗体和ASFV抗体阳性血清识别，而FLAG标签在其C端，提示重组蛋白的翻译正确。

为了评价用重组CD2v抗原检测ASFV抗体的可行性，本研究先用多抗原ELISA进行血清样品检测。此多抗原ELISA利用非洲猪瘟OIE参考实验室的已知血清进行过验证，根据100余份ASFV抗体阴性血清检测及其ROC曲线分析结果，将ASFV抗体阳性血清的判定阈值定为0.163。100余份ASFV实验感染或非洲疫区的血清样品检测结果显示，此多抗原ELISA的检测敏感性和特异性高于OIE推荐ELISA和商品化ELISA试剂盒。根据多抗原ELISA检测结果，选择ASFV抗体阳性和阴性血清各15份进行重组CD2v抗原ELISA检测，结果显示15份抗体阴性血清的OD_{450 nm}平均值为0.074，以OD_{450 nm}平均值+3倍标准误为标准，将抗体阳性血清的判定阈值定为OD_{450 nm}= 0.152，与多抗原ELISA的判定阈值非常接近，提示重组CD2v抗原ELISA具有良好的检测特异性。用重组CD2v抗原ELISA对15份ASFV抗体阳性血清进行检测，结果全部为CD2v抗体检测阳性，而且OD_{450 nm}值与多抗原ELISA非常接近。这些研究结果有些出乎意料，因为目前普遍认为CD2v的免疫原性较弱，多数ASFV感染猪的血吸附抑制抗体水平很低^[17]，但可用以下理由进行解释。首先，CD2v胞外区与细胞CD2具有一定的序列同源性，而胞内区与细胞CD2没有序列同源性，两者的免疫原性理应有所差异。其次，本研究的抗原指数分析结果表明，CD2v胞外区的免疫原性明显低于胞内区，与两者的氨基酸组成密切相关。另外，ASFV血吸附抑制抗体针对的是CD2v的胞外区，血吸附抑制抗体水平与CD2v胞外区的免疫原性相关，与CD2v胞内区无关。最后，ASFV血吸附蛋白抗体检测多用血吸附抑制试验检测，ELISA等其他抗体检测尚无报道，因此仅依据血吸附抑制抗体水平来判断CD2v的免疫原性不够全面。

4 结论

作者获得了强免疫原性重组CD2v抗原，可以用于ASFV CD2v抗体的检测，与多抗原ELISA相结合有望用于CD2v基因缺失苗接种与自然感染猪的鉴别诊断。