2. 河南广播电视大学 农医学院, 郑州 450000
, ZHU Hanyu1, PENG Zhan1, YAN Chenbo1, YANG Dexin1, HU Wenju2, DING Xuefen1, WANG Xinzhuang1
2. College of Agricultural Medicine, Henan Radio and Television University, Zhengzhou 450000, China
原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)是哺乳动物精原细胞与卵原细胞的祖细胞, 通过减数分裂形成配子[1-3]。PGCs对体外研究胚胎发育、发现新基因、基因组学以及发育生物学和细胞生物学等研究有着重要意义，因此, PGCs作为干细胞的研究受到各国学者的广泛关注[4-7]。Matsui等[8]发现，通过在培养液中加入合适浓度的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)和干细胞因子(stemcellfactor, SCF)，同时在饲养层和血清存在的培养条件下，PGCs可以重编程为胚胎生殖细胞(embryonic germ cells, EG cells)。EG细胞与胚胎癌细胞(embryonal carcinoma cells，EC cells)、胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES cells)特征相似，都属于多能性干细胞[8]。小鼠PGCs的特化、迁移、转分化和表观遗传等已经被广泛的研究，这为小鼠生殖细胞系，小鼠ES起源和其它哺乳动物的生殖细胞系研究奠定了基础[9-12]。兔作为一个合适的动物模型，与鼠相比，其体积大、寿命长，易于试验操作；与猪、牛、猴相比，其体积小，采样简单，配种方便，易于在实验室饲养观察。研究表明，兔的胚胎和胎儿胎盘发育与人类相似[13]，啮齿类动物的基因序列进化得更快，因此，兔的基因序列比啮齿类动物的基因序列更接近于人类[14]。目前，兔已经被广泛地作为动脉粥样硬化[15-16]、肠道免疫[17]、生殖[13]、关节炎[18]、癌症[19]和阿尔茨海默病[20]等多种非感染性疾病的实验室模型。对兔PGCs的深入理解或许会为其它物种PGCs的研究带来启发，如人类及其它许多濒危物种等。
在兔上，Leichthammer等[21]用穿刺法分离培养兔PGCs并观察其体外生长特性。Lee等[22]在培养液中加入细胞因子, 培养兔PGCs，观察其形态变化。李义书等[23]采用共培养方式分离克隆出了兔类胚胎生殖细胞集落，并传至8代。王亚丹等[24]把兔PGCs接种于不同密度的鼠成纤维细胞、兔成纤维细胞制成的饲养层上，探究不同种属、密度的饲养层对兔PGCs集落形成的影响。虽已有众多学者对PGCs展开研究，但目前兔PGCs体外培养仍存在效率低下、数量少等问题，兔的PGCs在体内分化为配子或体外转分化EG细胞同样缺乏系统的研究。兔PGCs体外分离培养的影响因素主要是胚胎的日龄、分离方法、饲养层种类、培养基、添加物等。建立成熟的兔PGCs体外分离培养技术仍需对其影响因素进行全面深入的探索。
本试验采用常用的两种分离方法、3种传代方法和含不同浓度细胞因子的培养液探究兔PGCs体外培养的最适基本条件，通过形态学观察、AKP染色、RT-PCR检测八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor-4，Oct-4)的表达等方法鉴定兔PGCs，为兔PGCs的建系奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验动物家兔(Oryctolagus Cuniculus，6月龄以上)，购买于河南省实验动物中心。
1.2 主要试剂与仪器细胞因子LIF、bFGF、TGF-β1均购自杭州联科生物技术股份有限公司；转录因子Oct-4和内参基因GAPDH的引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。胎牛血清(FBS)、H-DMEM培养基购自Gibco公司；胰蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司。
HF151UV型CO2培养箱(力康生物医疗科技控股有限公司，中国)；荧光倒置显微镜(重庆奥特光学仪器有限责任公司，中国)；Real-time PCR扩增仪(Eppendorf公司，德国)；电泳凝胶成像分析系统(UVP公司，美国)。
1.3 REF的分离培养与饲养层的制备取妊娠第14~18天的胎兔，按照王亚丹等[24]兔胚胎成纤维细胞(rabbit embryo fibroblast，REF)培养和制备饲养层的方法分离得到REF，取P3代生长旺盛的REF，丝裂霉素C作用2 h，胰蛋白酶消化离心后重悬细胞，提前将12孔板用明胶包被，并将细胞悬液接种其中，完成饲养层的制备。将PGCs接种于饲养层前1~2 h更换为兔PGCs培养液。
1.4 酶消化法和机械法两种不同分离方法对兔PGCs的影响取妊娠第14~18天孕兔子宫，PBS缓冲液冲洗后转入无菌操作台中，进行无菌操作。在解剖镜下用眼科镊分离出生殖嵴，PBS液冲洗5次。分别用两种方法分离兔PGCs：1)酶消化法：用眼科镊将剥离好的生殖嵴于离心管中磨碎，加入4 mL 0.25%胰蛋白酶(含0.04% EDTA)消化液，37 ℃水浴消化10 min左右，5 min混匀一次。加4 mL培养液结束消化，吹打均匀后静置2 min，200目滤纱过滤，取滤液，1 600 r·min-1离心8 min，重悬后，接种到REF制备的饲养层上。2)机械法：用眼科镊将生殖嵴于离心管中研磨至均匀的粘稠状，加培养液，离心，重悬后，接种至提前制备好的饲养层上培养。最后放入37 ℃，5%的CO2培养箱中培养。
1.5 不同传代方法对兔PGCs的影响兔PGCs集落分别采用以下3种方法传代：1)酶消化法：在解剖镜下，用玻璃细针将生长状态良好的PGCs集落挑出，置于0.25%胰蛋白酶(含0.04% EDTA)的消化液中作用2 min左右后，加入含有胎牛血清的培养液结束消化，于离心机中1 500 r·min-1离心6 min，弃上清，加入1 mL培养液，重悬，接种到另一新制备的饲养层上传代培养。2)机械法：在无菌室中，于解剖镜下，挑选生长状态良好的兔PGCs集落，用玻璃细针轻轻将其从饲养层上剥离，置于新的10 mL离心管中，用量程为1 mL的移液枪轻轻吹打直至集落离散为小细胞团块和单个细胞，于离心机中1 500 r·min-1离心6 min，重悬，接种到另一新制备的饲养层上继续培养，完成机械法传代。3)连同饲养层消化法：PBS缓冲液清洗2遍细胞，0.25%胰蛋白酶(0.04% EDTA)消化液作用2~3 min，2 mL培养液结束消化，1 600 r·min-1离心6 min, 重悬后，接种到新制备的饲养层上继续培养。
1.6 兔PGCs的鉴定1.6.1 形态学鉴定 将PGCs体外分离后，接种于REF饲养层上，倒置显微镜下观察，以12 h为间隔拍照，记录PGCs细胞形态的变化。
1.6.2 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase staining, AKP)染色鉴定 已知PGCs在AKP的检测中呈阳性(红黑色)，已分化的细胞则呈阴性(淡黄色、无颜色)。因此，以饲养层细胞作为阴性对照，弃掉培养液，用PBS缓冲液清洗2遍细胞。按AKP染色试剂盒说明书进行染色鉴定。
1.6.3 RT-PCR鉴定 用自制玻璃细针挑取未分化的PGCs集落，PBS液清洗2遍后，Trizol法提取总RNA，反转录成cDNA，通过RT-PCR检测Oct-4的表达。反应体系：Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL，总体积为25 μL。所用引物及序列见表 1。
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表 1 引物序列 Table 1 The primers sequence |
将培养液分为A、B、C、D 4组，以D组为对照组，探究不同细胞因子浓度对兔PGCs的影响，兔PGCs基础培养液为：高糖90% DMEM、1% NaHCO3、1%双抗、1% NEAA、1% L-谷氨酰胺、0.1 mmol·L-1 β-巯乙醇。各组细胞因子浓度见表 2。
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表 2 细胞因子浓度 Table 2 Cytokines concentration |
用“平均值±标准差”来表示所得试验数据，运用SPSS Statistics 19.0统计学软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，图片绘制处理采用GraphPad Prism 5。
2 结果 2.1 REF的生物学特性刚接种的原代REF呈圆形，3 h后细胞开始逐渐贴壁, 贴壁的细胞呈长梭形，16 h左右细胞开始增殖。P0代中杂细胞较多, 随着传代次数的增多，REF的纯度增加，同时细胞之间出现揉合状。传代后的细胞贴壁增殖较快，2 d左右可以长满培养瓶底部。P1~P3代的REF增殖速度较快, 且细胞纯度较高。随着代数的增高, 细胞活力下降(图 1)。
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A.P1代兔胚胎成纤维细胞; B. P3代兔胚胎成纤维细胞 A. P1 REF; B. P3 REF 图 1 兔胚胎成纤维细胞形态 Fig. 1 The morphology of REF |
在无菌室中，倒置显微镜下每隔12 h观察所分离培养的兔PGCs。发现在饲养层上培养24~48 h后开始出现兔PGCs集落，集落由小变大，突出于饲养层生长，PGCs互相吸引、聚集、分裂增殖，集落呈鸟巢状，集落中细胞排列紧密, 集落边缘清晰，立体感强。分化的兔PGCs集落呈扁平状铺开, 不再突出于饲养层生长, 立体感弱，并混有成纤维样、上皮样、神经样等细胞(图 2)。
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A.胰酶消化法刚接种0 h的兔PGCs; B.机械法分离刚接种0 h的兔PGCs; C.兔PGCs P0代集落; D.传代后将要发生分化的细胞集落 A.PGCs of rabbits inoculated with trypsin digestion for 0 h; B. PGCs of rabbits inoculated with mechanical isolation for 0 h; C. Colonies of PGCs in the initial generation in rabbit; D. The colonies of PGCs that will differentiate after passage 图 2 兔PGCs形态观察 Fig. 2 The morphology of rabbit PGCs |
AKP染色结果提示了胚胎性干细胞的多能性潜能，未分化的细胞胞质内含有活性较高的碱性磷酸酶，而在已分化细胞中活性低。因此，对体外培养未发生分化的PGCs集落进行AKP染色，为红黑色，呈阳性(图 3)，已分化细胞为未着色或淡黄色，呈阴性。
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图 3 AKP染色阳性 Fig. 3 AKP staining positive |
转录因子Oct-4被视为多能性干细胞特异性表达的多能性标志基因。因此，可通过RT-PCR法检测兔PGCs集落中转录因子Oct-4的表达，从而进一步在分子角度对PGCs进行鉴定。结果如图 4所示，1号泳道为Oct-4 PCR扩增产物，2号泳道为阴性对照，3号泳道为内参基因GAPDH扩增产物。
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M.DNA相对分子质量标准; 1. Oct-4扩增产物; 2.阴性对照；3. GAPDH扩增产物 M. DNA marker DL2000; 1. Fragment of Oct-4; 2. Negative control; 3. Fragment of GAPDH 图 4 Oct-4、GAPDH基因片段RT-PCR扩增结果 Fig. 4 RT-PCR amplication results of Oct-4 and GAPDH |
将胎兔生殖嵴经胰酶消化法和机械法两种不同分离方法处理后，分别接种至密度为6×104 REF饲养层上，机械法得到的兔PGCs集落数量是胰酶消化法的2.2倍，且差异极显著(P < 0.01, 表 3)。
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表 3 不同分离方法对兔PGCs集落个数影响 Table 3 Effects of different isolation methods on the number of rabbit PGCs colonies |
P0代兔PGCs集落分别通过胰酶消化法、机械法、连同饲养层消化法进行传代培养比较。结果显示，P1和P2代时机械法得到的PGCs集落数量多于其他两种传代方法，而且机械法可以将PGCs传至P4代，而其它两种方法只能将其传至P2代(表 4)。
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表 4 不同传代方法对兔PGCs集落数量的影响 Table 4 Effects of different passage methods on the number of rabbit PGCs colonies |
分别用A、B、C、D 4组培养液体外培养兔PGCs，每组重复3个孔。结果显示(表 5)，其中B组和C组集落的个数差异不显著，B组的集落个数显著大于A组和D组(对照组)。A、B、C 3组的集落个数都显著大于D组。
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表 5 不同培养液对兔PGCs形成集落的影响 Table 5 Effect of different culture media on rabbit PGCs colonies formation |
B组的集落分化时间为296 h，显著大于A、C、D 3组，A、B、C 3组的集落分化时间显著大于D组(表 5)。
3 讨论PGCs体外分离培养体系的建立有望实现体外对PGCs进行基因编辑，诱导形成成熟卵子或精子，这将对生物科学和医学产生深远的影响。PGCs体外分离方法主要有胰酶消化法和机械法。黄奔等[25]比较了机械法和胰酶消化法对水牛原始生殖细胞分离培养的影响，结果表明，机械法分离更适于水牛PGCs的体外分离培养。本试验结果显示，机械法同样适用于分离兔PGCs。相关研究表明，胰酶分离牛ES细胞过程中可能导致ES细胞的破坏及其自我更新途径改变从而引起ES细胞的自我分化[26-27]。另一种原因可能是，利用胰酶消化生殖嵴，虽然可以将组织块消化为均匀的细胞悬液，但胰酶会降低兔PGCs的活力，延长PGCs聚集成多克隆细胞的时间。PGCs集落的传代方法主要有机械法、胰酶消化法、连同饲养层消化法。郭志林等[28]比较了传统传代方法(机械法+胰酶消化法)和连同饲养层消化法对小鼠PGCs体外培养的影响，结果表明，传统传代法更有利于小鼠PGCs的聚集和增殖。本研究结果显示，采用机械法消化兔PGCs集落，可以将PGCs传至P4代，而其它两种方法只能传至P2代。可能是由于机械法能避免胰酶对细胞活性的破坏，减少兔PGCs聚集成多克隆细胞的时间，延长多克隆细胞保持多能性的时间。胰酶消化法虽然能快速地将兔PGCs集落消化成均匀的细胞悬液，但是对细胞活性的破坏也较大，PGCs聚集成多克隆细胞的时间也将增加，且细胞容易分化。而连同饲养层消化法，虽然操作简便，但PGCs集落不纯，杂细胞含量多，聚集成多克隆细胞的时间随之增加。陈永珍等[29]和刘善荣等[30]通过对比机械法、酶消化法以及机械法结合酶消化法3种传代方法对人EG细胞分离培养的影响，发现酶消化法要优于后两种消化方法，这与本研究结果有所不同。推测原因可能是，在采用机械消化方法的时候，本研究用玻璃细针将生长状态良好的兔PGCs集落从饲养层上挑出后，并继续将PGCs移至10 mL离心管中，用量程为1 mL移液枪吹打数下，目的是使PGCs集落离散为小细胞团块甚至是更小的单个细胞，离心、重悬，接种到新制备的饲养层上继续培养；而陈永珍等[29]是将PGCs集落挑出后，直接转移到新制作的饲养层上培养。由于PGCs在体外形成的是多细胞克隆，这可能造成多个细胞仍聚集在一起，没有完全分散开，导致增殖速度变慢，甚至可能会抑制其生长。
细胞因子作为细胞在生物体内作用的主要中间物质，可调控细胞分化、增殖并指导细胞发挥特异功能[12]。在培养液中添加特定的细胞因子是为了营造与体内细胞相似的生存环境，同时研究细胞因子联合使用时的量效关系，对优化细胞体外培养条件至关重要。LIF在维持PGCs体外长期培养和抑制其未分化状态方面具有重要作用[11, 31]。研究发现，PGCs培养液中的LIF发挥作用是直接作用于PGCs，而不依赖于饲养层细胞[32-33]。FGF发挥生物学效应通过自分泌或旁分泌激活酪氨酸激酶成纤维细胞因子受体[34]。bFGF通过激活PI3K/AKT信号通路可以促进猪和水牛PGCs重编程为EG细胞[35-36]。Matsui等[8]的研究表明，小鼠PGCs体外培养的细胞因子浓度是10~20 ng·mL-1LIF(hLIF) +10~20 ng·mL-1bFGF + 60 ng·mL-1 SCF的培养液。Resnick等[37]在长期培养小鼠PGCs，并建立其ES细胞系过程中发现，LIF和bFGF的最适添加浓度分别为10 ng·mL-1和1 ng·mL-1。转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)通常抑制正常细胞的增殖并刺激其分化，因此可以起到抑制肿瘤的作用[38-39]。TGF-β超家族还参与调控免疫系统、机体胚胎发育、组织再生等众多生理过程[40-41]。文献报道，TGF-β1在鸡PGCs体外培养增殖过程中是不可或缺的[17]。本研究首次在兔PGCs培养液中添加TGF-β1，探究LIF、bFGF、TGF-β1联合使用时的最佳搭配浓度，为针对PGCs更深入的研究奠定基础。本研究中，兔PGCs培养液为：基础液+10% FBS + 10 ng·mL-1LIF + 4 ng·mL-1bFGF+ 2 ng·mL-1TGF-β1时其聚集成多克隆细胞的数量较多，保持未分化的时间较长。不同的细胞因子间相互影响，不同细胞因子浓度对PGCs的体外培养也会产生影响。细胞因子发挥作用是通过与相应的靶细胞膜受体结合。当细胞膜外环境中细胞因子浓度相对较低，能与PGCs受体有效结合的细胞因子有限时，胞内与增殖相关的通路不能被激活。相反，当细胞因子浓度相对过高时，相应膜受体结合细胞因子处于饱和状态。当配体与受体完全结合后，细胞因子效能并不会随细胞因子浓度增加而增加。
在接下来的试验中，我们将继续优化兔PGCs的体外培养条件，早日建立成熟的兔PGCs体外分离技术，为畜牧产业领域中经济动物的优质培育乃至生命科学生殖生育研究奠定基础。
4 结论本研究中，在第14~18天的胎兔胚胎中均可分离培养出PGCs；机械法分离原代兔PGCs形成的集落数量要多于胰酶消化法，机械法为较合适的兔PGCs分离方法；机械法传代兔PGCs集落数量要显著大于胰酶消化法和连同饲养层消化法，且代数也高于后两种传代方法，机械法为较合适的兔PGCs传代方法；兔PGCs在培养液B(基础液+ 10% FBS + 10 ng·mL-1LIF + 4 ng·mL-1bFGF + 2 ng·mL-1TGF-β1)中形成的集落数量较多，且保持未分化的时间较长，为最佳的兔PGCs体外培养环境。
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