2. 青藏高原动物遗传资源保护与利用国家教育部重点实验室, 成都 610041;
3. 四川省阿坝州畜牧科学研究院, 阿坝 623000
2. Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization of Ministry of Education, Chengdu 610041, China;
3. Animal Husbandry Science Institute of Aba Autonomous Prefecture, Aba 623000, China
牦牛(Bos grunniens)主要生活在青藏高原及周边地区，适应高寒、低氧的恶劣环境，能充分利用当地的牧草资源，为牧民提供主要的经济来源和优质的畜产品。此外，牦牛在动物基因遗传资源研究中也是一个极其珍贵的基因库。然而，与平原牛种相比，其生长速度慢、性成熟晚、繁殖效率低下，是高原畜牧业发展的主要瓶颈之一[1]。虽然近些年对牦牛育种繁殖的研究不断深入，并取得了较大的进展，但总体上看仍较落后[2]。为解决此难题，人工授精、同期发情、体外受精等现代繁殖技术在牦牛生产中具有巨大的推广潜能。卵母细胞的成熟是现代繁殖技术的前提，卵母细胞质量直接决定其体外受精效率以及胚胎的发育能力。相对于体内环境，体外成熟的卵母细胞受精后所形成的胚胎发育能力普遍偏低，且胚胎移植后的妊娠率及成活率也不容乐观[3-4]。
随着第一个组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶KDM1A的发现，组蛋白甲基化是不可逆的这个观点被推翻[5-6]。根据Jmjc (Jumonji C)结构域的有无可将去甲基化酶分为两大类：赖氨酸特异性去甲基化酶KDM与含Jmjc结构域的组蛋白去甲基化酶家族。这些酶主要通过去除赖氨酸残基上的甲基来调控基因的表达[7]。KDM1A属于胺氧化酶超家族，主要介导H3K4和H3K9的单甲基化和二甲基化[8-9]。前期研究发现，KDM1A在哺乳动物组织中广谱表达，且通过抑制或激活相关基因转录来调控DNA损伤、转录子的活性以及纺锤体和染色体的缺失，进而在多种生物体的生殖细胞系中发挥重要作用[8-12]。此外，该基因也参与了癌症发生转移、胚胎发育的调节以及性激素受体介导基因的转录调控等过程[13]。Di Stefano等[14]发现，敲除Kdm1a可引起基因的异常表达以及H3K4甲基化水平升高，导致胚胎致死。此外，Shao等[15]在研究小鼠早期胚胎时发现，小鼠胚胎中的KDM1A活性被抑制后，胚胎阻滞在4-细胞时期。敲除小鼠胚胎干细胞中的JHDM2A和JMJD2C后，发现胚胎干细胞的Oct-4、Sox-2以及Nanog等全能性因子表达水平受到抑制，且加快了细胞的分化，揭示其参与维持胚胎干细胞的全能性[16-17]。本课题组前期研究发现，牦牛KDM1A基因遗传进化高度保守，在牦牛睾丸组织中高表达，推测其参与调控牦牛睾丸发育及雄性生殖[18]。以上研究表明，KDM1A在哺乳动物的生长发育及生殖活动中扮演重要角色。
在卵母细胞减数分裂过程中组蛋白甲基化水平呈动态变化，提示组蛋白去甲基化酶对卵母细胞减数分裂成熟及胚胎发育至关重要[19-21]。前期研究发现，KDM1A参与早期生殖细胞的发生以及受精后胚胎的发育[15, 17]。本团队前期研究发现，Kdm1a基因在牦牛卵泡发育过程中均有表达，且不同发育阶段的mRNA表达水平差异显著。但KDM1A在牦牛卵母细胞减数分裂成熟过程中的作用尚未见报道。因此，本研究利用特异性抑制剂GSK-KDM1A，探讨KDM1A对牦牛卵母细胞减数分裂成熟及发育潜能的影响，为进一步研究KDM1A在牦牛卵母细胞减数分裂过程中的作用及牦牛卵母细胞减数分裂的调控机制奠定基础。
1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂二氧化碳培养箱(Thermo, 美国)，荧光定量PCR仪(Bio-Rad，美国)，共聚焦荧光显微镜(ZESS，德国)；胎牛血清(FBS)、Medium 199 (Gibco，美国)，促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH)、谷氨酰胺(L-Glu)、17β雌二醇(17β-E2)等(Sigma, 美国)，兔单克隆抗体KDM1A和羊抗兔二抗(Abcam, 美国)，G-IVF、G-1TMplus、G-2TMplus等(Vitrolife, 瑞典)，GSK-KDM1A(Med Chem Express, 美国)。
1.2 牦牛卵母细胞的采集及培养在成都周边的牦牛屠宰场，将健康状况良好、未孕、3~6岁的母牦牛屠宰后，立即用灭菌剪刀、镊子采集牦牛的卵巢组织，用含双抗(80 mg·L-1青霉素和100 mg·L-1链霉素)的生理盐水清洗后，放入37 ℃生理盐水中，置于保温壶中，2 h内带回实验室处理。用灭菌剪刀剔除卵巢附组织，使用含双抗的室温生理盐水冲洗，用10 mL一次性注射器(12号针头)抽取直径为3~8 mm的卵泡，置于体视显微镜下挑选形态完整、包裹紧密、胞质均匀的卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complex, COCs)。在培养液(Medium 199 + FBS 10% + 1 μg·mL-1 FSH +1 μg·mL-1 LH + 1 μg·mL-1 17β-E2 + 0.03 μg·mL-1谷氨酰胺+ 2.2 μg·mL-1碳酸氢钠+ 0.22 μg·mL-1丙酮酸钠)中分别添加不同浓度的GSK-KDM1A，使其终浓度为0、160和320 nmol·L-1。将所收集的COCs随机分为3组，每组约40枚，放入预先平衡的含不同浓度GSK-KDM1A的卵母细胞成熟液中，于38.5 ℃、5.5% CO2、饱和湿度条件下培养。
1.3 卵丘细胞的扩展及卵母细胞成熟的检测COCs在不同浓度GSK-KDM1A培养液的培养过程中，通过体视显微镜观察卵丘细胞扩展情况，并通过图像比例尺计算出各组中卵丘细胞的扩展程度。各试验组COCs体外培养24 h后，经0.2%透明质酸酶脱去颗粒细胞，观察第一极体的排出数，根据含极体的卵母细胞数与总卵母细胞的比例统计卵母细胞的成熟率。
1.4 RT-qPCR检测相关基因的表达将各组成熟后的COCs脱去颗粒细胞，采用微量试剂盒Single Cell-to-CtTMKit (Invitrogen, 美国)提取总RNA，具体操作步骤参照产品使用说明书。将RNA中加入Single Cell VILOTMRT Mix和Single Cell SuperScriptⓇ RT各1.5 μL，反转录得到cDNA，以此作为模板进行RT-qPCR。根据GenBank数据库中公布的基因序列，用Primer 5.0进行引物设计(表 1)，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。采用实时荧光定量PCR仪(CFX96, Bio-Rad)检测基因的相对表达量。运用TaKaRa公司的SYBRⓇ Premix Ex TaqTM试剂盒，具体反应体系：cDNA 1.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 5.5 μL，SYBRⓇ Premix Ex TaqTMⅡ 7.5 μL。反应程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s, 共40个循环。所有RT-qPCR反应至少重复3次，用2-ΔΔCt法计算比较分析目的基因相对表达量。
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表 1 RT-qPCR引物信息 Table 1 Primer information of RT-qPCR |
从液氮罐中取出牦牛冻精，置于42 ℃温水中解冻，显微镜下观察精子的活力情况。采用上游法将精子加入预平衡的获能液中孵育，收集上清液，再离心收集获能的精子备用。将成熟培养后的COCs转入IVF受精微滴中，每个微滴放30枚左右，将获能的精子均匀加入受精微滴，使精子浓度为1×105个·mL-1。最后转入培养箱中，38.5 ℃、5.5% CO2共孵育20 h。
根据Xiong等[22]的方法进行胚胎的体外培养。将受精后的COCs转移至预平衡的G-1微滴中，每个微滴放置10~20枚受精卵，置于38.5 ℃、5.5% CO2、湿度饱和的培养箱中培养。72 h后将受精卵转移至G-2微滴中继续培养，培养24与168 h后分别观察并统计卵裂数和囊胚数。
1.6 免疫荧光检测卵母细胞中KDM1A的表达将各组COCs分别培养0、12和24 h，脱去颗粒细胞后转入4%多聚甲醛固定液中固定30 min，再置于封闭液中37 ℃孵育1 h。然后在一抗KDM1A (1:500)中4 ℃孵育过夜，二抗羊抗兔(1:10 000)室温孵育2 h。孵育好的卵母细胞转入DAPI中，室温下避光染色5 min。最后将卵母细胞移至滴有防荧光淬灭剂的载玻片上，盖上盖玻片，共聚焦荧光显微镜检测拍照。
1.7 数据统计与分析所有组别的试验至少重复3次，利用SPSS 19.0进行ONEWAY ANOVA检验，用SSR法进行多重比较，P＜0.05认为差异显著，P＜0.01认为差异极显著。
2 结果 2.1 KDM1A对卵母细胞减数分裂成熟的影响COCs在各组培养24 h，观察COCs卵丘细胞扩展的变化情况(图 1A)，卵丘细胞的扩展程度及卵母细胞的成熟率统计结果见表 2。结果显示，在3组培养液COCs成熟过程中，卵丘细胞扩展程度均较0 h时显著增加(P < 0.05)。24 h时3组间卵丘细胞扩展面积差异显著(P < 0.05)，其中320 nmol·L-1组扩散程度最小，且添加GSK-KDM1A显著抑制了颗粒细胞的发散(P < 0.05)。体外培养24 h后，在体视显微镜下观察卵母细胞第一极体排出情况，统计卵母细胞的成熟率。结果显示，添加GSK-KDM1A显著降低了卵母细胞减数分裂成熟率(P < 0.05)，320 nmol·L-1组卵母细胞成熟率显著低于160 nmol·L-1组(P < 0.05)。由此表明，GSK-KDM1A能抑制牦牛卵母细胞的减数分裂成熟。
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A.卵丘细胞的扩散情况；B. DAPI染色后卵母细胞的细胞核形态结构；比例尺代表100 μm A. The expansion of cumulus cells; B. The nuclear morphology of oocytes stained by DAPI; The scale represents 100 μm 图 1 牦牛卵丘细胞的扩展及卵母细胞成熟过程中的3个时期 Fig. 1 Expansion of cumulus cells and 3 stages of yak oocyte maturation |
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表 2 KDM1A对COCs中卵丘细胞扩展及卵母细胞成熟的影响 Table 2 Effects of KDM1A on the cumulus cells expansion and oocyte maturation |
在COCs体外培养过程中，取适量的卵母细胞用DAPI染色，根据染色形态结构判断卵母细胞所处的阶段(图 1B)。从卵巢中取出的COCs，约91.5%的卵母细胞处于GV期；培养12 h后，约83.8%的卵母细胞发育到了MⅠ期；培养24 h后，约80.7%的卵母细胞可见第一极体即MⅡ期。根据所确定的培养时间，收集各阶段的卵母细胞，通过RT-qPCR检测Kdm1a的动态表达谱(图 2)。结果显示，卵母细胞中Kdm1a在MⅠ期的表达水平显著低于GV和MⅡ期(P＜0.05)，而GV和MⅡ期之间无显著差异(P＞0.05)。
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不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)，下同 The different lower case letters indicate significant difference (P < 0.05), the below as the same 图 2 Kdm1a在牦牛卵母细胞减数分裂不同时期的表达 Fig. 2 The expression of Kdm1a in different stages of the oocyte meiosis |
将牦牛COCs放入含0、160和320 nmol·L-1 GSK-KDM1A的培养液中培养24 h，脱去颗粒细胞后进行RNA提取和反转录，以GAPDH为内参基因，RT-qPCR检测卵母细胞中的Kdm1a、Oct-4、Sox-2以及Nanog基因的表达水平(图 3)。结果显示，GSK-KDM1A显著下调Kdm1a的表达水平(P＜0.05)，但Oct-4和Sox-2的表达水平却显著的上调(P＜0.05)，各组之间Nanog的表达水平无显著差异(P＞0.05)。
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图 3 KDM1A对胚胎干细胞转录因子表达的影响 Fig. 3 Effect of KDM1A on the expression of embryonic stem cell transcription factors in yak oocyte |
COCs在添加不同浓度GSK-KDM1A的卵母细胞成熟液中培养，对各组培养0、12和24 h的卵母细胞进行免疫荧光染色(图 4)，对其相对灰度值进行统计分析(图 5)。结果显示，KDM1A蛋白在卵母细胞减数分裂成熟过程中呈动态表达，且12 h时的相对表达量显著低于0和24 h (P＜0.05)，与RT-qPCR结果吻合。此外，KDM1A的表达量与GSK-KDM1A的浓度呈负相关，320 nmol·L-1组各时间点的KDM1A表达量显著低于160 nmol·L-1组(P＜0.05)。
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图中比例尺代表 20 μm The scale represents 20 μm 图 4 荧光染色检测KDM1A蛋白的表达 Fig. 4 Detection of KDM1A protein expression by fluorescence staining |
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图 5 不同处理对牦牛卵母细胞内KDM1A水平的影响 Fig. 5 Effects of different treatments on KDM1A level in yak oocytes |
将采集的COCs置于含不同浓度GSK-KDM1A的培养液中培养，随后进行体外受精，评估KDM1A对早期胚胎发育的影响(表 3)。结果显示，与对照组相比，GSK-KDM1A处理显著降低了卵母细胞的卵裂率(P＜0.05)，且320 nmol·L-1组的卵裂率显著低于160 nmol·L-1组(P＜0.05)。然而，GSK-KDM1A的处理对囊胚形成率无显著影响(P＞0.05)。
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表 3 KDM1A对卵母细胞发育潜能的影响 Table 3 Effects of KDM1A on the developmental potential of oocytes |
表观遗传修饰即在DNA序列不发生改变的前提下，基因功能发生改变。在配子发生和胚胎发育过程中，表观遗传修饰呈现动态变化并扮演重要角色[19-23]。在果蝇中，KDM1A使H3K4去甲基，敲除果蝇Kdm1a导致雌性缺乏卵母细胞和雄性无精子[23]。敲除小鼠Kdm1a将引起H3K4甲基化水平及相关基因表达异常，导致早期胚胎死亡[15]。本研究通过向卵母细胞体外成熟液中添加GSK-KDM1A，评估其对卵母细胞成熟及发育潜能的影响。结果表明，GSK-KDM1A能够有效抑制牦牛卵母细胞的减数分裂成熟，改变卵母细胞的基因表达模式及影响卵母细胞的后期发育潜能。
颗粒细胞是伴随着卵母细胞发育而逐渐形成的细胞群，其包裹在卵母细胞周围并与之形成代谢联系[24-25]。研究发现，颗粒细胞的存在对于卵母细胞生长、发育、排卵和后续的受精潜能是必不可少的，无颗粒细胞的卵母细胞的成熟、受精以及后续的发育都较低[26]。卵母细胞发育的过程中，颗粒细胞发生解离，使COCs扩展。因此，卵丘细胞的扩散程度可作为衡量卵母细胞成熟的指标之一[27]。本研究发现，GSK-KDM1A的添加及浓度的增加显著抑制了牦牛COCs的扩散，降低了成熟效率。Kim等[10]揭示，KDM1A可与雌、雄激素受体结合发挥其去甲基化作用，从而激活激素受体依赖基因的表达，进而影响颗粒细胞的增殖分化活动。KDM1A参与Notch信号通路的部分基因调控，而该信号通路中较多成员在介导卵泡发育及颗粒细胞增殖方面起重要作用[28]。KDM1A可调控成熟促进因子(MPF)、亚基CyclinB1以及CDK抑制因子P21的表达[29-30]。
此外，本研究揭示，KDM1A在牦牛卵母细胞减数分裂成熟过程中的各发育时期均有表达，且呈动态变化。这可能和卵母细胞减数分裂成熟过程中MPF活性的动态变化有关，MPF的活性又与KDM1A的表达有关。KDM1A在牦牛卵母细胞的GV期和MⅡ期表达量较高，推测其可能是维持卵母细胞减数分裂阻滞的一个因素。此外，KDM1A除了可对成熟调控因子起作用，其去甲基化作用还可通过介导染色质重塑过程来调控减数分裂[31]。换而言之，KDM1A表达被抑制后，调控卵母细胞成熟的相关细胞周期蛋白因子的活性及染色质重塑活动都受到了一定程度的影响，从而导致其成熟率的下降。
卵母细胞发育潜能指卵母细胞随着卵泡发育而逐渐获得的发育成熟、受精并发育到囊胚阶段的能力[32]。而卵母细胞受精后，雌雄原核形成到合子基因组激活之前，维持胚胎的发育所需要的营养及调控因子均来自于卵母细胞时期积累的母源蛋白。因此，卵母细胞成熟过程中蛋白的积累对受精和受精后的发育能力有直接影响，受精及后续的胚胎发育质量可直接评估成熟卵母细胞的质量[28]。因此，本试验对不同浓度GSK-KDM1A培养成熟处理的卵母细胞进行体外受精，评估其对卵母细胞发育潜能的影响。结果显示，卵裂率显著降低，表明GSK-KDM1A对卵母细胞受精能力有负效应，这可能与其抑制Kdm1a的表达有关。胚胎转录因子在维持胚胎干细胞的多能性和分化中起着重要作用，且其甲基化水平异常可影响早期的卵裂进程[33-34]，其中Kdm1a与Sox-2、Oct-4以及Nanog等转录因子的关系较密切。在研究小鼠重编程过程中Kdm1a的表达时发现，其可与Oct-4和Nanog共同调控胚胎重编程的相应通路[35-36]。此外，下调Kdm1a可直接影响Sox-2的蛋白水解，且在小鼠原肠胚的形成过程中需要Kdm1a的参与，抑制Kdm1a后发现Oct-4表达显著上调，并且在4-细胞时期发生不可逆阻滞[37]。Katz等[38]也发现，小鼠胚胎干细胞中Sox-2、Oct-4、Nanog的甲基化水平升高，导致全能因子表达下调和启动胚胎的分化。本研究为了进一步探究引起卵裂率降低的原因，检测了卵母细胞中胚胎干细胞转录因子的表达水平。KDM1A主要通过修饰H3K4me1/2来调控干细胞转录因子，对转录因子的表达具有正负双重调控效益[39-40]。在本研究中，GSK-KDM1A的处理上调了Sox-2和Oct-4的表达，而对Nanog无显著影响。可能是由于抑制剂处理使KDM1A显著的失活，改变了卵母细胞中干细胞转录因子的表达模式，过早启动Sox-2和Oct-4的表达，使得胚胎受精及后期的发育不利。由此表明，卵裂进程的减少或延缓可能与这些转录因子的表达异常有关。总而言之，KDM1A在牦牛卵母细胞减数分裂成熟过程中起一定的作用，并可通过影响胚胎干细胞转录因子来调控卵母细胞的发育潜能，其具体的调控机制有待进一步研究。
4 结论KDM1A在牦牛卵母细胞减数分裂成熟过程中呈动态表达，表明其参与了牦牛卵母细胞的减数分裂成熟过程。GSK-KDM1A能有效抑制牦牛卵母细胞中KDM1A的表达，影响牦牛卵母细胞的体外成熟及其发育潜能，揭示KDM1A在此过程中扮演重要角色。
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