2. 新疆维吾尔医学专科学校, 和田 848000
2. College of Xinjiang Uyghur Medicine, Hotan 848000, China
不同的毛色已成为区分一些动物亚种(或品种)的标志之一[1]。随着大量新技术的出现和日益深化，哺乳动物被毛形态学研究在各个领域、各个方面起着越来越重要的作用[2]。目前，在哺乳动物中已发现378个与毛色相关的遗传位点和171个与毛色相关的基因[3]。
转录组测序(RNA-Seq)是指利用第二代高通量测序技术全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本[4-7]。通过转录组测序可以确定功能基因的转录结构及在不同生理条件下的表达差异变化[8-9]。相对于传统芯片而言，RNA-Seq无需预先设计探针，即可对任意物种的任意细胞类型的转录组进行检测，能够提供更精确的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围[10-11]。
马鹿(Cervus elaphus)为鹿科大型兽类，是一种具有药用价值和经济价值的珍贵哺乳动物。在世界范围内马鹿分布在欧洲、亚洲和北美洲，根据个体大小、被毛颜色、头骨和角型特征的不同被分为22个亚种[12]。我国有8个马鹿亚种，马鹿在我国已被列入国家Ⅱ级重点保护动物。在新疆有阿勒泰马鹿(Cervus elaphus sibiricus)、天山马鹿(Cervus elaphus songaricuss)和塔里木马鹿(Cervus elaphus yarkandensis)3个亚种[13]。塔里木马鹿(Cervus elaphus yarkandensis)属我国西部系统的马鹿亚种，是新疆唯一高度适应荒漠生境而形成的特有亚种，是我国珍稀鹿科资源。在中国濒危动物红皮书中, 塔里木马鹿被列为濒危(E)[14]，该亚种也已被列入“美国濒危物种名录”[15]。塔里木马鹿被毛呈沙灰色，有黑褐色白线，臀斑为白色，背两侧的毛色较深，颈下、腹下和四肢内侧为灰白色[16]。天山马鹿分布于天山山脉东部和中西部海拔1 400~3 200 m的灌丛和森林草地中，被毛呈深灰色，颈部有长而粗密的额毛和髯毛，头、颈和四肢的被毛呈黑灰色，眼圈呈浅黄色[13]。马鹿的毛色是鉴定亚种的重要指标，国内外学者对马鹿皮毛的宏观和微观指标开展了较系统的研究，然而在分子水平上探讨马鹿毛色相关基因的研究尚未见报道。
本研究对塔里木马鹿与天山马鹿的皮肤组织进行转录组测序并对基因表达水平进行比较分析，初步检测到了与塔里木马鹿毛色相关的基因。本研究为今后塔里木马鹿形态特征的分子机制研究提供基本资料，并为进一步探讨和寻找塔里木马鹿相关功能基因结构及新基因的挖掘提供科学有效的数据信息。
1 材料与方法 1.1 样本采集2017年12月从新疆昌吉市盛华商贸有限责任公司养殖场选取体型发育基本一致的成年健康雄性塔里木马鹿和天山马鹿各3头，经麻醉后立即采集耳组织样本，用RNase-free水清理后置于液氮中速冻，并于-80 ℃保存备用，用于提取组织总RNA。
1.2 马鹿皮肤组织总RNA提取和RNA质量检测利用TaKaRaRNA试剂盒提取总RNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA是否降解和受到污染。利用Nanodrop、Qubit 2.0和Aglient 2100等方法对所提取的RNA纯度、浓度及完整性进行检测，以确保转录组测序所用样品的质量。
1.3 cDNA文库的构建及文库的检测质检合格的总RNA每个样本各取3 μg扩增产物，cDNA作为起始原料进行文库构建，用带有Oligo(dT)的磁珠富集马鹿mRNA，加入阳离子(Mg2+)将mRNA进行随机打断，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，利用AMPure XP beads纯化cDNA。纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XP beads进行片段大小选择，优选长度为150~200 bp的cDNA片段。最后通过PCR富集得到cDNA文库。使用Qubit2.0进行初步定量，使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，用qRT-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度＞2 nmol·L-1)，完成库检。
1.4 高通量测序结果的质量控制用Illumina Hi Seq TM2000进行高通量测序，测序所得的原始序列通过去除低质量序列、去接头等过程得到高质量的Clean reads。质控后通过Trinity对转录组数据进行组装，将各样品的Clean Data与组装得到的Transcript或Unigene库进行序列比对。为确保测序文库的质量，从mRNA片段化随机性检验、插入片段长度检验、转录组测序数据饱和度检验等3个不同角度对转录组测序文库进行质量评估。
1.5 差异表达基因的筛选与功能注释使用BLAST[17]软件将Unigene序列与NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、eggNOG4.5、KEGG数据库比对，利用KOBAS2.0[18]得到Unigene在KEGG中的KEGG Orthology结果，预测完Unigene的氨基酸序列之后通过HMMER[19]软件与Pfam数据库比对，获得Unigene的注释信息。采用Bowtie[20]将测序得到的Reads与Unigene库进行比对，根据比对结果，结合RSEM[21]进行表达量水平估计。利用FPKM值表示对应Unigene的表达丰度。将皮尔逊相关系数r(Pearson’s correlation coefficient)作为样品间相关性的评估指标[22]。采用DESeq [23]进行样品组间的差异表达分析，获得两个条件之间的差异表达基因集。在差异表达分析过程中利用Benjamini-Hochberg方法对原有假设检验得到的显著性P值(P-value)进行校正，并最终采用校正后的P值，即FDR(false discovery rate)作为差异表达基因筛选的关键指标，将FDR < 0.01且差异倍数FC(fold change)≥2作为筛选标准，并对筛选得到的差异表达基因进行聚类分析。
1.6 实时荧光定量PCR验证为了进一步验证测序结果的准确性，挑选POMC、VDR、PTPRF、CIITA、ARPC5L、Ggt1、MITF等7个差异表达基因并利用转录组测序得到基因序列，以β2M为内参基因[24]，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法进行验证。用Primer Premier5软件设计基因定量引物，基因名称及引物信息见表 1。以cDNA第一链为模板，扩增目的基因。qRT-PCR反应体系为20 μL：上、下游引物各1 μL，2×SYBRⓇ Green Super mix 10 μL，QN Rox dye 1 μL，DEPC水5.8 μL，cDNA模板1 μL，Yellow 0.2 μL。qRT-PCR扩增程序: 95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃(根据实际引物退火温度进行调整)退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。采用2-ΔΔCt计算基因的相对表达量。
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表 1 差异表达基因qRT-PCR的特异性引物 Table 1 Specific primers of differentially expressed genes for qRT-PCR |
检测塔里木马鹿和天山马鹿皮肤组织RNA的总量大于10 μg，完整度(RIN值)均大于7，18S:28S均大于2.2，质量满足建库要求，可用于后续的分析。
2.2 塔里木马鹿和天山马鹿皮肤组织Unigenes的组装分析塔里木马鹿和天山马鹿的皮肤组织经转录组测序共获得47.51 Gb Clean Data，各样品Clean Data均达到7.29 Gb，Q30碱基百分比在85.01%及以上，平均GC含量达到了54.12%，组装后共获得86 277条Unigenes，其中长度在1 kb以上的Unigenes有27 802条，Unigene的N50为2 004，组装完整性较高(图 1)。
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图 1 Unigene长度分布 Fig. 1 Unigene length distribution |
通过Blastx将Unigene序列分别与NR、eggNOG、Pfam、KOG、Swiss-Prot、COG、GO和KEGG数据库进行比对，选择BLAST参数E-value不大于1×10-5和HMMER参数E-value不大于1×10-10，最终获得25 038个有注释信息的Unigenes，占总Unigenes的90.06%，基因注释的统计结果见表 2。
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表 2 Unigene注释统计表 Table 2 Unigene annotation statistics |
2.4.1 样品间相关性评估 r2越接近1说明两个样品的相关性越强。从图 2可以看出，本研究中塔里木马鹿T02号样品和T03号样品与天山马鹿T04、T05、T06号样品的相关性比较好，塔里木马鹿T01号样品的相关性相对较差，因此后续的分析中剔除T01号样品。
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T01、T02、T03号样品为塔里木马鹿样品，T04、T05、T06号样品为天山马鹿样品 T01, T02, T03 are Tarim red deer samples, T04, T05, T06 are Tianshan red deer samples 图 2 样品的相关性热图 Fig. 2 Correlation thermogram of samples |
2.4.2 差异表达基因的筛选 塔里木马鹿和天山马鹿基因差异性表达分析结果显示，将校正后的P值FDR(false discovery rate)小于0.01且差异倍数FC(fold change)大于等于2作为筛选标准，共筛选出了922条差异表达基因，上调表达的有495条基因，下调表达的有427条基因(图 3)。
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图 3 差异表达基因火山图 Fig. 3 Volcano plot of DEGs |
根据基因在不同样品中的表达量，对识别到的差异表达基因进行功能注释，注释到的差异表达基因数量统计结果见表 3。
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表 3 注释的差异表达基因数量统计表 Table 3 Number of annotated differentially expressed genes |
2.5.1 差异表达基因的GO功能富集分析 差异表达基因GO[25]功能富集分析结果表明，有568个基因得到分类注释，涉及生物学过程(biological processes, BP)、细胞组分(cellular components, CC)及分子功能(molecular functions, MF)3大类61个小类(图 4)。在生物学过程中占有较高比例的是代谢过程和单一生物体过程，富集最集中的是三羧酸循环；在细胞组分中，细胞和细胞组分占有较高比例，富集最集中的是纤维胶原三聚体；而在分子功能中，催化活性和连接占有较高比例，富集最集中的是FK506结合蛋白(FK506 binding)。
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图 4 GO富集分析注释统计图 Fig. 4 GO enrichment analysis annotated statistical graph |
2.5.2 差异表达基因的COG直系同源性分析 差异表达基因COG直系同源性分析结果表明，186个差异表达基因分布在26类功能类别中，这些功能类别中一般功能预测(R)为注释最多，细胞运动(N)为注释最少(图 5)。此外，51条Unigenes被注释到了运输和代谢，24条Unigenes被注释到信号转导机制，12条Unigenes被注释为能量产生和转化。除此之外，从差异表达基因与NR、Swiss-Prot、Pfam、eggNOG数据库的比对结果来看，有736个基因与NR数据库中的已知基因蛋白序列显著匹配，有644个基因与Pfam数据库比对上，与Swiss-Prot数据库中585个基因比对上，有698个基因与eggNOG数据库比对上。
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图 5 COG注释分类统计图 Fig. 5 COG annotation classification diagram |
2.5.3 差异表达基因KEGG注释 KEGG[26]富集分析结果表明，共注释到480个基因，涉及240个通路，其中差异表达基因富集较显著的主要通路信息如表 4所示。其中细胞外基质受体相互作用(ECM-receptor interaction)最为富集，其次是蛋白质的消化与吸收(protein digestion and absorption)和PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)。
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表 4 KEGG富集分析的详细结果 Table 4 Detailed results of KEGG enrichment analysis |
2.5.4 差异表达基因的KEGG通路富集分析 通过差异表达基因的KEGG通路富集分析，得到富集最显著的KEGG通路是ECM-受体间相互作用。由图 6可知，图中纵坐标为表示多重假设检验校正后的P值，因此，随着纵坐标的变大，在该通路中差异表达基因的富集显著性越可靠。该图中显示的是富集最显著的20条KEGG通路条目。
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图 6 KEGG通路富集散点图 Fig. 6 KEGG pathway enrichment scatter diagram |
对MITF、Ggt1、VDR、PTPRF、CIITA、ARPC5L、POMC等7个差异表达基因进行表达趋势验证，结果显示(图 7)，转录组测序结果为6个上调基因和1个下调基因，与qRT- PCR检测结果相符，两种检测结果一致说明转录组测序结果的可靠性高。
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图 7 7个候选基因差异表达趋势比较图 Fig. 7 Trend diagram of differential expression of 7 candidate genes |
近年来，人类、动物和植物在基因组和转录组水平上适应性进化的分子机制研究不断涌现，成为进化生物学研究的热点[27-29]。RNA-Seq技术作为一种转录组测序研究方法，相对一些传统方法，具有明显的优势[30-31]。本研究用从头组装法将序列拼接成转录本，并以转录本作为参考序列，对塔里木马鹿和天山马鹿的皮肤转录组数据进行研究。
本研究经转录组测序共获得47.51 Gb Clean Data，各样品Clean Data均达到7.29 Gb，Q30碱基百分比在85.01%及以上，平均GC含量达到了54.12%。组装后共获得86 277条Unigenes，其中长度在1 kb以上的Unigenes有27 802条，Unigene的N50为2 004，组装完整性较高。从转录本表达水平分析的结果来看，本研究所选样本的相关系数较高，样本的表达情况较为一致，因此试验结果的可靠性较高。本研究所提取的RNA质量较高，建库过程合理规范，获得了符合测序要求的RNA片段，在建库或RNA提取过程中未出现RNA降解，避免了多位点比对的比例增加和基因表达定量准确性差的现象，测序结果满足后续研究要求。
3.2 塔里木马鹿和天山马鹿皮肤组织差异表达基因功能注释和富集分析各数据库中注释到的差异表达基因总数为740条，与这些数据库成功比对的差异表达基因为进一步分析相关新基因奠定了基础。GO功能富集分析结果显示，在生物学过程中，富集最集中的是三羧酸循环，三羧酸循环是细胞中产生能量的主要代谢途径，提供了大部分被电子传递链氧化的还原辅酶，从而产生三磷酸腺苷(ATP)，三羧酸循环除了在能量代谢和2-碳单元的氧化中起作用外，也是细胞中4-碳和5-碳化合物相互转化的主要途径[32]。三羧酸循环是糖、脂、蛋白质、甚至核酸代谢联络与转化的枢纽，所以，三羧酸循环在塔里木马鹿皮肤中的表达较为突出。细胞组分中富集最集中的是纤维胶原三聚体，可能原因是胶原主要在成熟软骨细胞中表达，主要存在于软骨中，也存在于眼(晶体和角膜)、耳(覆膜)、椎间盘和中胚层后巩节中[24]，由于本研究的取样位点是塔里木马鹿和天山马鹿的耳组织，因此纤维胶原三聚体在细胞组分中富集。除此之外，在分子功能中富集最集中的是FK506结合蛋白。FK506结合蛋白(FKBP12)最初被鉴定为免疫抑制剂FK506和雷帕霉素的细胞溶质受体，FKBP12是一种普遍表达的脯氨酸异构酶，其细胞功能尚不清楚[33-34]，在后续的试验中需进一步验证。
KEGG富集分析结果表明，显著富集的途径中细胞外基质受体相互作用(ECM)的显著性最高，可能是因为ECM的结构和功能由大分子的复杂混合物组成，包括糖胺聚糖(Gags)和纤维蛋白[35]。本研究中，塔里木马鹿皮肤组织中的ECM细胞外基质受体相互作用中骨桥蛋白(OPN)和黏结蛋白聚糖(Syndecan)等两个成员上调，胶原(collagen)、细胞粘合素(tenascin)和THBS在皮肤组织中显著富集。
通过分析信号通路和差异表达基因的表达量得到了可能与毛色形成直接相关的上调表达基因有KRT75、Ggt1、POMC等，下调表达的有MITF基因。马淑慧等[36]对黑色和白色被毛绵羊的POMC基因进行表达和定位，确定了POMC与毛色形成的关系，研究结果表明，POMC在不同毛色绵羊皮肤组织中的表达水平存在一定的差异，表明POMC的表达量变化会在一定程度上影响毛色的生成；此外，POMC神经元主要通过其分解产物MSH与脑中黑色素皮质素受体之间的相互作用来调节采食和能量平衡[37-38]；MITF基因的突变对毛色中出现斑点、毛色的稀释等白色毛表型起着重要的作用[39]；刘小辉[40]对不同羽色的坝上长尾鸡进行转录组测序，研究结果显示，MITF、TYR、KRT75等基因在羽色表达中起重要的作用，KRT75在白色羽中表达量最高。结合以上的研究结果，本研究所得到的差异表达基因可能都参与了塔里木马鹿皮肤黑色素细胞活动和黑色素形成过程，从而在塔里木马鹿毛色形成过程中起到了重要的作用。
3.3 qRT-PCR验证转录组测序结果通过荧光定量PCR方法，对筛选出来的MITF、Ggt1、VDR、PTPRF、CIITA、ARPC5L、POMC 7个差异表达基因进行验证。虽然qRT-PCR结果中有些基因的表达量值与转录组测序结果中的表达量值有差异，但表达趋势基本一致，可能是qRT-PCR检测带来的误差和测序过程中的误差导致了表达量倍数的差异。
4 结论本研究利用Illumina Hi Seq TM2000测序平台对塔里木马鹿和天山马鹿的皮肤组织进行了转录组测序，经过分析后得出初步结论：ECM-受体相互作用、蛋白质消化与吸收、PI3K-Akt信号通路及与黑色素合成相关的酪氨酸可能与塔里木马鹿的毛色有关；候选基因MITF、Ggt1、VDR、PTPRF、CIITA、ARPC5L、POMC等可能在塔里木马鹿毛色形成过程中发挥重要作用。
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