半月板撕裂是一种常见的膝关节损伤，临床表现为急性疼痛和运动障碍。由于缺乏血供，半月板损伤后很难再生。目前，对于半月板损伤的修复多是采用外科方法进行缝合修补甚至于切除[1]。而半月板切除术虽然在短期内能缓解疼痛和恢复膝关节功能，但多项研究显示其长期治疗效果不佳，会加速骨关节炎的发展[2]。近年来，软骨组织工程领域的发展备受关注，利用组织工程技术修复和再生半月板已成为治疗半月板损伤的一种新模式[3-4]。其中，支架在提供细胞生存空间和维持肢体负荷方面起着至关重要的作用，是组织工程半月板研究领域的重点内容之一[5]。脱细胞处理后的半月板基质(meniscus acellular matrix，MAM)保留了天然的生物活性和三维结构[6-7]，是一种理想的支架材料。可其存在孔隙率太低、孔径太小，不利于外源细胞的植入和营养液流通的问题，影响到组织工程半月板的体外构建效果。本实验室曾使用甲酸、胰蛋白酶和胶原酶等方法处理MAM支架，处理后的支架虽然孔隙率和孔径均有所增加，但支架的胶原纤维结构破坏严重、生物力学性能明显降低，不适用于组织工程半月板的构建[8]。本试验旨在研究物理钻孔法增加MAM支架孔隙率的可行性，并检测钻孔对半月板的脱细胞时间、支架的力学性能、细胞在支架中装载量和组织重塑效果的影响。
1 材料与方法 1.1 主要试剂及仪器十二烷基硫酸钠，木瓜蛋白酶，Cell Counting Kit(ZETA)，BlyscanTM Glycosaminoglycan Assay(biocolor)，小鼠抗Ⅱ型胶原抗体(Abcam)，山羊抗小鼠IgG抗体(Abcam)。犬骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)为笔者实验室保存、鉴定[9]。
医用多功能电动锯钻(NM-1002，安徽佰陆小动物骨科器械有限公司)，万能力学测试机(HY-0230，上海衡翼仪器有限公司)，扫描电子显微镜(Nova nano SEM450，美国FEI公司)，多功能酶标仪(spark，瑞士tecan公司)，化学发光凝胶成像系统(ChemiDoc MP，美国Bio-Rad公司)。
1.2 半月板的采集与钻孔处理从死亡试验犬(西北农林科技大学实验动物中心提供)两后肢膝关节中采集完好的天然半月板，将右后肢内外侧半月板用安装26 G针头(直径450 μm)的医用多功能电动锯钻垂直半月板下底面穿透全层钻孔，孔密度为1个·mm-2(图 1)。左后肢内外侧半月板留作对照。
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图 1 钻孔半月板示意 Fig. 1 Schematic diagram of the drilled meniscus |
根据本实验室之前的研究结果和笔者的预筛选结果，将反复冻融3次的钻孔组和对照组半月板置于含1.0%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.1%乙二胺四乙酸(EDTA)和0.5%过氧乙酸的脱细胞液中恒温摇床振摇，每2 d更换1次脱细胞液，其中钻孔组共处理3 d，对照组共处理6 d。取出后，两组样品均用蒸馏水在超声波清洗器中洗涤1 h，随后在75%乙醇中于摇床中振摇1 d，以无菌PBS在摇床中洗涤1 d，用湿润滤纸包裹，-20 ℃储存。
1.4 MAM支架的组织学检测抽取两组MAM支架样品，置于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中室温下固定48 h，经梯度酒精脱水、二甲苯透明、常规石蜡包埋后进行5 μm厚度的连续切片，并对切片进行HE和天狼猩红染色，然后在光学显微镜下观察染色结果，以检测细胞脱除是否干净和胶原纤维结构是否完整。
1.5 MAM支架的孔隙率与力学性能测定 1.5.1 孔隙率检测恒温条件下，将装满无水乙醇的5 mL比重瓶质量设为m1，支架干质量设为m0。抽取两组MAM支架，分别放入装满无水乙醇的比重瓶中，静置浸泡24 h，然后使用真空泵脱气直至无气泡逸出，加满无水乙醇，称重记为m2。取出浸满无水乙醇的支架，对剩余无水乙醇和比重瓶称重记为m3。孔隙率=(m2－m3－m0)/(m1－m3)。
1.5.2 压缩模量检测将两组MAM支架样品置于万能力学测试机的载物台上，在持续垂直压力作用下以1 mm·min-1的速率挤压支架，而后根据所获得的力与形变关系曲线计算和比较不同孔隙率支架的压缩模量，并与脱细胞前的半月板检测值进行比较。
1.6 MAM支架植入BMSCs前后的电镜观察将第4代BMSCs从液氮罐中取出，迅速置于37 ℃温水中快速复温。在超净工作台内，将细胞吸入离心管中1 000 r·min-1离心5 min，弃上清，加入3 mL α-MEM完全培养基重悬细胞，移入60 mm培养皿中置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞长至80%融合即可进行传代培养。将生长状态良好的第6代BMSCs消化离心计数，制备成3×105·mL-1的细胞悬液，取500 μL细胞悬液分别逐滴添加到钻孔支架和对照支架上，于培养箱中静置5 h以待细胞在支架上充分黏附，然后加入α-MEM完全培养基在37 ℃、5%CO2饱和湿度下共培养，每2 d换液1次，共培养4 d。取种植细胞前的MAM支架及细胞-支架复合物样品，置于2.5%戊二醛4 ℃过夜，PBS缓冲液浸洗，酒精逐级脱水，CO2临界点干燥4 h，离子镀膜仪喷金，扫描电镜观察。
1.7 钻孔支架中BMSCs增殖检测将生长状态良好的第6代BMSCs消化离心制备成3×105·mL-1的细胞悬液，取500 μL细胞悬液分别逐滴添加到钻孔支架和对照支架上，待细胞在支架上充分黏附后加入α-MEM完全培养基将细胞-支架复合物在37 ℃、5% CO2饱和湿度下共培养，每2 d换液1次。然后，利用CCK-8法检测BMSCs在两种支架上的增殖情况。分别于培养的第1、4、7天，用含10% CCK-8的完全培养基替换原培养基，置于培养箱内继续培养4 h，取200 μL培养液置另一新孔板中，在多功能酶标仪上测定各孔液体的OD450 nm值，每个样品在每个时间点重复3孔。
1.8 钻孔支架中BMSCs向软骨分化的检测将第6代犬BMSCs制备成3×106·mL-1的细胞悬液，取500 μL细胞悬液分别逐滴添加到钻孔支架和对照支架上，待细胞在支架上充分黏附后将细胞-支架复合物在37 ℃、5%CO2饱和湿度下共培养，第3天改用软骨诱导培养基(含10% FBS，40 ng·mL-1地米塞松，50 μg·mL-1抗坏血酸，50 μg·mL-1 L-脯氨酸，1 mmol·L-1丙酮酸钠，10 μL·mL-1 ITS，10 ng·mL-1 TGF-β3，10 ng·mL-1 BMP-2和1%双抗的α-MEM培养基)培养，每2 d换液1次。
1.8.1 糖胺聚糖(GAG)定量检测分别取两组诱导1、2、3及4周的细胞-支架复合物样品，用木瓜蛋白酶提取液(8 mg·mL-1乙酸钠，4 mg·mL-1乙二胺四乙酸二钠，0.8 mg·mL-1半胱氨酸盐酸盐，0.1 mg·mL-1木瓜蛋白酶)65 ℃消化过夜。将消化液10 000 g离心10 min后取上清，按照BlyscanTM Sulfated Glycosaminoglycan Assay说明书步骤，使用多功能酶标仪在656 nm波长处测定吸光值，减去空支架对照值后根据标准曲线算出各组样本中GAG的含量。
1.8.2 Ⅱ型胶原蛋白(COL-Ⅱ)Western blot检测将两组体外诱导1、2、3及4周的细胞-支架复合物样品分别在冰盒中剪碎，用RIPA充分裂解提取总蛋白，使用BCA测定总蛋白浓度。调平各组样品的总蛋白浓度后加入loading buffer煮沸变性，进行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭，分别与Ⅱ型胶原抗体和相应二抗孵育，最后加入化学发光液用凝胶图像处理系统分析样本条带，以检测样本中COL-Ⅱ的相对表达量。
1.9 数据统计试验数据采用SPSS18.0软件处理，结果以x±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。柱状图用GraphPad Prism 6软件绘制。
2 结果 2.1 MAM支架的组织学检测MAM支架的组织学染色结果如图 2所示。光学显微镜下，钻孔组和对照组MAM支架的HE染色片均未见细胞核，表明细胞脱除干净；天狼猩红染色显示胶原纤维结构完整，钻孔组可观察到明显的孔洞样结构，但钻孔对其周围的胶原纤维结构无明显影响。
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图 2 MAM支架的组织学染色结果 Fig. 2 Histologic staining results of MAM scaffolds |
钻孔支架和对照支架的孔隙率与压缩模量检测结果见表 1。钻孔组支架的孔隙率极显著高于对照组支架(P < 0.01)。钻孔支架和对照支架的压缩模量差异不显著(P>0.05)，说明钻孔不会影响支架的力学性能。
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表 1 支架的孔隙率与压缩模量测试结果(x±s, n=3) Table 1 Test results of porosity and compressive modulus of the scaffolds(x±s, n=3) |
在扫描电镜下，对照组MAM支架的表面结构致密、没有明显空隙(图 3A)，底面显微结构相对疏松、有许多小空隙(图 3B)；钻孔MAM支架可见直径400多微米孔洞，孔洞周围的基质结构并未受到明显影响(图 3C)。种植BMSCs后，对照组MAM支架的表面长满细胞(图 3D)，底面长满细胞并有细胞向空隙内生长(图 3E)；钻孔MAM支架的孔洞周围表面长满细胞，有大量细胞布满孔洞周缘并向空洞内部延续生长(图 3F)。
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A. MAM支架表面致密；B. MAM支架底面疏松；C.钻孔MAM底面，制样时有些压缩变形；D. BMSCs长满MAM支架表面；E. BMSCs长满MAM支架底面，并有细胞向内生长；F. BMSCs向钻孔MAM支架的孔内生长 A. Dense surface of MAM scaffold; B. Loose subface of MAM scaffold; C. Subface of drilled MAM, some compression deformation when making samples; D. BMSCs overgrow the surface of MAM scaffold; E. BMSCs overgrow the subface of MAM scaffold and cells grow inward; F. BMSCs grow into the hole of the drilled MAM scaffold 图 3 MAM支架植入BMSCs前后的扫描电镜观察 Fig. 3 Scanning electron microscope observation before and after implantation of BMSCs in MAM scaffolds |
钻孔组和对照组细胞-支架复合物在培养第1、4、7天时样品的OD450 nm值见表 2。两组OD450 nm值均随培养时间的增加呈上升趋势，但钻孔组的OD450 nm值在第1天时显著高于对照组(P＜0.05)、第4、7天时极显著高于对照组(P＜0.01)。
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表 2 CCK-8增殖试验结果(x±s, n=3) Table 2 Results of CCK-8 proliferation test (x±s, n=3) |
钻孔组和对照组细胞-支架复合物向软骨诱导培养1、2、3、4周时的GAG含量(μg·mg-1)见表 3。两组细胞-支架复合物的GAG含量均随诱导时间的增加呈上升趋势，但钻孔组GAG含量在第2周时显著高于对照组(P＜0.05)、第3和4周时极显著高于对照组(P＜0.01)。
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表 3 细胞-支架复合物GAG定量检测结果(x±s, n=3) Table 3 GAG quantitative detection result of cell-scaffold complexs (x±s, n=3) |
COL-Ⅱ的Western blot检测结果显示，钻孔组和对照组细胞-支架复合物中COL-Ⅱ表达均呈阳性(图 4A)，并且相对灰度值随诱导时间的增加呈上升趋势，但钻孔组在诱导培养2、3、4周时的相对表达量均极显著高于对照组(P＜0.01，图 4B)。
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A.凝胶电泳结果(PCNA为内参，D为钻孔组，C为对照组)；B.条带灰度分析，**.P < 0.01 A. Gel electrophoresis results (PCNA was the internal reference, D represent drill group, C represent control group); B. Analysis results of band gray scale, **.P < 0.01 图 4 细胞-支架复合物的Ⅱ型胶原蛋白Western blot检测 Fig. 4 Western blot analysis of typeⅡ collagen of the cell-scaffold complexes |
孔隙率和细胞植入量是组织工程支架的重要评价指标。良好的孔隙率对细胞向支架深层迁移和增殖、营养物质和代谢产物的运输，以及细胞间的交流有着至关重要的作用[10]。半月板组织细胞含量少，基质中胶原纤维密度高，这种特异性结构使MAM中的孔隙率很低[11]。支架的孔隙率过低不仅直接影响种子细胞的植入数量，而且妨碍种子细胞在支架内的代谢、增殖和组织重塑。为此，研究人员采取了多种方法来提高MAM支架的孔隙率。Maier等[12]使用胰蛋白酶/胶原酶/蛋白酶的多步酶促消化过程对绵羊半月板进行脱除细胞和增加空隙率处理，结果显示所制成MAM支架的孔隙率有所增加。Chen等[13]采用甲酸、乙酸、过乙酸、苹果酸、琥珀酸和柠檬酸等多种酸类处理猪的半月板，结果显示以较高浓度的酸溶液和较短的处理时间可提高支架孔隙率并达到最佳的脱细胞效果，同时对GAG和Ⅱ型胶原的影响不大。有些研究者探索采用脱细胞软骨基质为材料重制半月板多孔支架，用于组织工程软骨的构建，这些支架的孔隙率可达到90%，且不影响其支持细胞附着和向软骨分化的特性[14-17]。此外，还有研究者使用激光消融技术改变半月板的物理结构来增加支架孔隙率，通过调整相应参数获得所需的支架中的孔道密度和直径[18]。本试验中采用钻孔法增加MAM支架的孔隙率，不但操作简单便捷、缩短了半月板的脱细胞时间，而且提高了BMSCs在支架中的沉积、黏附、增殖和向软骨分化能力。
半月板在膝关节中承担着传递负荷、减少震荡和吸收应力的重要力学作用[19]。因此，用于构建组织工程半月板的支架材料必须具有足够的力学强度。MAM支架本身来源于动物膝关节半月板组织，具有天然的力学特性[20]。显然，支架的力学性能与孔隙率有直接关系。为提高MAM支架的细胞植入率，人为增加孔隙率必然会对支架的力学性能和细胞复合能力造成影响。采用胶原酶消化法，虽可增加支架的孔隙率，但也会损伤支架的胶原纤维结构；采用化学物质增加支架的孔隙率，也难免会影响复合细胞的生存和分化能力；采用激光打孔可能造成孔壁表层胶原纤维的热变性、影响细胞的黏附，且设备昂贵；采用脱细胞软骨材料重制多孔支架，程序繁杂，存在诸多影响因素。唯有机械打孔法，只要调整好孔径和密度，既能很好地增加MAM支架的空隙率，又可保存足够的力学性能，不失为充分开发利用MAM支架的理想方法。Nordberg等[11]用针刺法增加人MAM支架的孔隙率，并将增加孔隙率的支架与脂肪干细胞共培养28 d，结果表明针刺法增加支架孔隙率后在保存支架力学性能的基础上也能提高细胞的植入量和组织的重塑能力。本研究采用钻孔法增加犬MAM支架的孔隙率，将支架与BMSCc共培养，经过组织学观察、细胞增殖和GAG、Ⅱ型胶原检测，获得了比较理想的结果。但针刺打孔难免对孔壁组织造成挤压，影响孔内细胞向孔壁浸润和培养液的流通；钻孔法可最大限度地减少挤压孔壁组织，利于细胞在孔壁的黏附与扩散。可见钻孔法是一种简便有效地增加MAM支架孔隙率的理想方法。
总之，半月板的主要化学成分是胶原蛋白和GAG，它们占到半月板干质量的90%以上[21]。因此，在组织工程研究中MAM支架的细胞植入率是其开发利用的难点[22-23]。本研究通过对半月板进行物理钻孔，在保持其足够力学性能的前提下提高了MAM支架的孔隙率，这不仅缩短了制备支架的脱细胞时间，而且提高了细胞在支架中的植入率和培养液的流动性，有利于细胞在支架中的沉积、黏附、增殖和分化，从而促进了组织重塑，为MAM支架在组织工程半月板构建中的广泛应用奠定了基础。
4 结论钻孔法增加半月板基质支架的孔隙率，不但能保持支架的力学性能、提高细胞的植入量，而且能促进细胞的增殖、分化和组织重塑。
| [1] | JEONG H J, LEE S H, KO C S. Meniscectomy[J]. Knee Surg Relat Res, 2012, 24(3): 129–136. DOI: 10.5792/ksrr.2012.24.3.129 |
| [2] | AAGAARD H, VERDONK R. Function of the normal meniscus and consequences of meniscal resection[J]. Scand J Med Sci Sports, 1999, 9(3): 134–140. |
| [3] | BUMA P, RAMRATTAN N N, VAN TIENEN T G, et al. Tissue engineering of the meniscus[J]. Biomaterials, 2004, 25(9): 1523–1532. DOI: 10.1016/S0142-9612(03)00499-X |
| [4] | ZHANG Y, LI P S, WANG H, et al. Research progress on reconstruction of meniscus in tissue engineering[J]. J Sports Med Phys Fitness, 2017, 57(5): 595–603. |
| [5] |
周预, 刘玉杰, 黄靖香, 等. 兔半月板脱细胞基质的制备[J]. 中国医学科学院学报, 2011, 33(1): 62–65.
ZHOU Y, LIU Y J, HUANG J X, et al. Development of rabbit meniscus acellular matrix[J]. Acta Academiae Medicinae Sinicae, 2011, 33(1): 62–65. DOI: 10.3881/j.issn.1000-503X.2011.01.013 (in Chinese) |
| [6] | SANDMANN G H, EICHHORN S, VOGT S, et al. Generation and characterization of a human acellular meniscus scaffold for tissue engineering[J]. J Biomed Mater Res A, 2009, 91A(2): 567–574. DOI: 10.1002/jbm.a.32269 |
| [7] | STAPLETON T W, INGRAM J, FISHER J, et al. Investigation of the regenerative capacity of an acellular porcine medial meniscus for tissue engineering applications[J]. Tissue Eng Part A, 2011, 17(1-2): 231–242. DOI: 10.1089/ten.tea.2009.0807 |
| [8] |
黄丽洁.山羊半月板脱细胞基质支架的制备及扩大孔径方法的研究[D].杨凌: 西北农林科技大学, 2017.
HUANG L J. Preparation of goat's meniscus acellular matrix scaffold and study on its pore size expansion method[D]. Yangling: Northwest A&F University, 2017. (in Chinese) http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10712-1017073831.htm |
| [9] |
崔豪, 赵雯, 邹彤, 等. Ⅰ型胶原涂层聚己内酯(PCL)半月板组织工程支架的细胞亲和性[J]. 中国兽医学报, 2019, 39(1): 138–143.
CUI H, ZHAO W, ZOU T, et al. Cell affinity of polycaprolactone meniscal tissue engineering scaffolds coated with collagen Ⅰ[J]. Chinese Journal of Veterinary Science, 2019, 39(1): 138–143. (in Chinese) |
| [10] |
赵忠琪, 王晓坤, 彭慧敏, 等. 提高关节软骨脱细胞支架孔隙率及细胞渗透性方法的研究进展[J]. 中国生物医学工程学报, 2018, 37(1): 112–118.
ZHAO Z Q, WANG X K, PENG H M, et al. Research progress of the methods improving porosity and cellular infiltration in articular cartilage extracellular matrix scaffold[J]. Chinese Journal of Biomedical Engineering, 2018, 37(1): 112–118. DOI: 10.3969/j.issn.0258-8021.2018.01.015 (in Chinese) |
| [11] | NORDBERG R C, CHAROENPANICH A, VAUGHN C E, et al. Enhanced cellular infiltration of human adipose-derived stem cells in allograft menisci using a needle-punch method[J]. J Orthop Surg Res, 2016, 11(1): 132. |
| [12] | MAIER D, BRAEUN K, STEINHAUSER E, et al. In vitro analysis of an allogenic scaffold for tissue-engineered meniscus replacement[J]. J Orthop Res, 2007, 25(12): 1598–1608. DOI: 10.1002/jor.20405 |
| [13] | CHEN Y C, CHEN R N, JHAN H J, et al. Development and characterization of acellular extracellular matrix scaffolds from porcine menisci for use in cartilage tissue engineering[J]. Tissue Eng Part C Methods, 2015, 21(9): 971–986. DOI: 10.1089/ten.tec.2015.0036 |
| [14] | CHENG N C, ESTES B T, AWAD H A, et al. Chondrogenic differentiation of adipose-derived adult stem cells by a porous scaffold derived from native articular cartilage extracellular matrix[J]. Tissue Eng Part A, 2009, 15(2): 231–241. DOI: 10.1089/ten.tea.2008.0253 |
| [15] | CHENG N C, ESTES B T, YOUNG T H, et al. Engineered cartilage using primary chondrocytes cultured in a porous cartilage-derived matrix[J]. Regen Med, 2011, 6(1): 81–93. DOI: 10.2217/rme.10.87 |
| [16] | YANG Q, PENG J, LU S B, et al. Evaluation of an extracellular matrix-derived acellular biphasic scaffold/cell construct in the repair of a large articular high-load-bearing osteochondral defect in a canine model[J]. Chin Med J (Engl), 2011, 124(23): 3930–3938. |
| [17] | YUAN Z G, LIU S Y, HAO C X, et al. AMECM/DCB Scaffold prompts successful total meniscus reconstruction in a rabbit total meniscectomy model[J]. Biomaterials, 2016, 111: 13–26. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2016.09.017 |
| [18] | LAKES E H, MATUSKA A M, MCFETRIDGE P S, et al. Mechanical integrity of a decellularized and laser drilled medial meniscus[J]. J Biomech Eng, 2016, 138(3): 031006. DOI: 10.1115/1.4032381 |
| [19] | MAKRIS E A, HADIDI P, ATHANASIOU K A. The knee meniscus:structure-function, pathophysiology, current repair techniques, and prospects for regeneration[J]. Biomaterials, 2011, 32(30): 7411–7431. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2011.06.037 |
| [20] | STAPLETON T W, INGRAM J, KATTA J, et al. Development and characterization of an acellular porcine medial meniscus for use in tissue engineering[J]. Tissue Eng Part A, 2008, 14(4): 505–518. DOI: 10.1089/tea.2007.0233 |
| [21] | HERWIG J, EGNER E, BUDDECKE E. Chemical changes of human knee joint menisci in various stages of degeneration[J]. Ann Rheum Dis, 1984, 43(4): 635–640. DOI: 10.1136/ard.43.4.635 |
| [22] | GAO S, YUAN Z G, XI T F, et al. Characterization of decellularized scaffold derived from porcine meniscus for tissue engineering applications[J]. Front Mater Sci, 2016, 10(2): 101–112. DOI: 10.1007/s11706-016-0335-y |
| [23] | SHEN W L, CHEN J L, ZHU T, et al. Osteoarthritis prevention through meniscal regeneration induced by intra-articular injection of meniscus stem cells[J]. Stem Cells Dev, 2013, 22(14): 2071–2082. DOI: 10.1089/scd.2012.0563 |