2. 福建省兽医中药与动物保健重点实验室, 福州 350002
, LIAO Lüyan1, LIU Zhenni1, YAN Ping1, ZHU Zheng1, WU Chunlin1, LI Jian1,2, HUANG Yifan1,2, WU Yijian1,2
2. Fujian Key Laboratory of Traditional Chinese Veterinary Medicine and Animal Health, Fuzhou 350002, China
番鸭呼肠孤病毒感染可引起雏番鸭、半番鸭免疫抑制性传染病，病原为番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus，MDRV)，是呼肠孤病毒科(Reoviridae)正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)中禽正呼肠孤病毒(Avian orthoreovirus)的一员，属于水禽源呼肠孤病毒[1-3]，主要通过消化道和呼吸道途径感染番鸭，集中在脾、盲肠等组织器官中复制[4-5]。肠道黏膜是抵御外源性病原体和毒素的重要免疫屏障，其形态结构的完整性直接影响肠道黏膜屏障功能和营养物质的肠道吸收能力[6-7]。本课题组前期研究证实MDRV感染可致番鸭肠黏膜和抗氧化功能受损，造成肠道黏膜免疫功能低下甚至丧失以及吸收障碍[8-9]。在临床剖检中发现MDRV感染雏番鸭小肠，尤其是回肠出现肠黏膜充血、出血和有大小不等的坏死小点，部分病鸭淋巴环带明显肿胀[1]。在肠黏膜发挥免疫效应的淋巴细胞是从流动血液中定向迁移到黏膜部位的淋巴细胞，即通过肠淋巴细胞归巢(lymphocyte homing)而来，可以说淋巴细胞归巢过程决定了肠黏膜免疫屏障功能的坚固程度[10-11]。因此笔者推测MDRV造成的肠道病变与淋巴细胞归巢有关，拟建立检测淋巴细胞迁移的方法进行探究。
目前有各种标记分子用于细胞迁移的研究，且主要有两种方式：(1)体外用标记分子标记组织或者细胞，通过染色体核型及标记特性识别细胞[12]；(2)将标记分子直接引入体内，在体内标记细胞。将标记后的细胞再引入体内，可以预先对接种的细胞进行识别[13]。5(6)-羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE，CFSE)是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，不仅用于细胞增殖的体外试验，也可用于追踪细胞在体内的分裂增殖过程[14]。研究显示，CFSE作为细胞标记物，能稳定地存在于细胞核中且不会引起细胞发生凋亡[15]。因此笔者采用CFSE体外标记淋巴细胞，建立检测番鸭体内淋巴细胞的分布和迁移的方法，并初步研究MDRV感染对淋巴细胞归巢至雏番鸭回肠的动态影响。
1 材料与方法 1.1 毒株番鸭呼肠孤病毒YB毒株(TCID50为107.56·0.1 mL-1)，由实验室分离鉴定[1]。
1.2 试验动物1日龄MDRV抗原抗体阴性健康番鸭购自福建省莆田市某种番鸭场。
1.3 主要试剂和仪器RPMI 1640不完全培养基、RPMI 1640完全培养基购自南京凯基公司; CFDA-SE(S1076)购自北京Solarbio公司；鸭外周血淋巴细胞分离液试剂盒(LTS1090D)和鸭脏器组织淋巴细胞分离液试剂盒(LTS1090DP)购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；RNA提取试剂盒(TransZol Up Plus RNA Kit)、TransScript Ⅱ Reverse Transcriptase(High Temperature RT)、SYBRⓇ Premix EX TaqTM均购自TransGen Biotech；一抗MDRV-σA多克隆抗体和番鸭整合素α4兔源多克隆抗体rHis-α4由本实验室制备鉴定[16]；二抗Goat Anti-Rabit IgG-FITC和Goat Anti-Rabit IgG-Cy3购自Abcam公司。ABI7500实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；FACS Canto Ⅱ型流式细胞仪购自BD公司。
1.4 CFSE染色示踪方法的建立和条件优化 1.4.1 雏番鸭淋巴细胞分离制备按照天津灏洋鸭外周血淋巴细胞分离液试剂盒操作说明书，无菌采集雏番鸭心脏血，室温静置1 h，取上清分离淋巴细胞。细胞密度用RPMI 1640不完全培养基调整至107个·mL-1备用。
1.4.2 不同孵育液及CFSE标记浓度筛选用DMSO制备浓度为25、50、100、200、400 μmol·L-1的CFSE溶液，孵育液选择PBS及RPMI 1640不完全培养基，分别将1/10的孵育液体积的CFSE溶液加入到混有细胞的孵育液中，标记终浓度分别为2.5、5、10、20、40 μmol·L-1。染料与细胞充分混匀后放入37 ℃培养箱，标记时间为30 min，标记结束选用RPMI 1640完全培养基洗涤细胞两次，终止染色。用流式细胞仪检测样品的CFSE+细胞率及CFSE平均荧光强度，各样品平行检测三次。
1.4.3 CFSE细胞毒性分析试验将“1.4.2”中不同CFSE标记条件的番鸭淋巴细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以体积比9:1混匀，光学显微镜下3 min内分别计数活细胞和死细胞。细胞存活率(活细胞率，%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。
1.4.4 CFSE在番鸭体内的荧光强度变化动力学按照合适的CFSE标记条件标记雏番鸭淋巴细胞，按番鸭每克体重2×105个淋巴细胞的比例通过番鸭肱静脉注射，分别于注射后2、3、6、9、12、24、48 h采集番鸭血液、胸腺、脾、法氏囊、十二指肠、空肠、回肠和盲肠。分离新鲜组织的淋巴细胞，用流式固定液37 ℃固定15 min，清洗1~2次，置于4 ℃冰箱。随后用流式细胞仪检测样品的CFSE+细胞率。
1.4.5 流式细胞仪检测分析启用BDC6软件，选用未标记CFSE的淋巴细胞调节流式细胞仪后选择CFSE荧光通路，上机收集细胞数量设置为10 000个，速度选择中速，以FSC/SSC二维散点图跑出淋巴细胞群体，去掉细胞碎片，统一进行标准化设门。各样品平行检测三次。
1.5 MDRV感染雏番鸭淋巴细胞归巢至回肠组织的检测 1.5.1 试验分组及动物试验模型建立试验分组与处理见表 1。
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表 1 试验分组与处理 Table 1 Experiment grouping and processing |
在感染后1、3、6、10、15、21 d(分别记作1、3、6、10、15、21 dpi)，空白对照组1(MOCK1)和感染组1(MDRV1)每组随机抽取3只试验雏番鸭采集回肠组织3份：①参照“1.4.1”分离番鸭回肠组织淋巴细胞，用于CFSE+淋巴细胞检测；②取适量肠组织洗净吸干，放于液氮速冻，而后转移至-80 ℃冰箱保存，用于MDRV病毒载量检测；③用多聚甲醛固定，用于制备石蜡切片。
1.5.2.2同“1.5.2.1 ”各时间点，在MOCK2组和MDRV2组未标记番鸭中每组随机抽取3只采集回肠组织，参照“1.4.1”分离淋巴细胞用于α4+淋巴细胞检测。
1.5.3 Real-time PCR检测回肠组织MDRV sigmaNS基因表达水平参照GenBank中GAPDH核苷酸序列及本实验室测序MDRV sigmaNS序列设计引物。GAPDH引物，上游：5′-TGCTAAGCGTGTCATCATCT-3′，下游：5′-AGTGGTCATAAGACCCTCCA-3′；sigmaNS引物，上游：5′-CTGGTCAGACCGTCTTCAGG-3′，下游：5′-GCGACGCAGAGTCCTATCA-3′。按全式金TransZolTM Up试剂盒说明书分别提取MOCK1组和MDRV1组回肠组织的总RNA，通过全式金公司TransScript II Reverse Transcriptase(High Temperature RT)反转得到相应cDNA，qRT-PCR按照SYBRⓇ Premix EX TaqTM试剂说明进行操作，以GAPDH为内参基因，检测sigmaNS mRNA相对转录水平，每个样本重复3次。
1.5.4 番鸭回肠组织CFSE+淋巴细胞流式检测参照“1.4.5”对MOCK1组和MDRV1组中分离得到的CFSE+淋巴细胞进行流式检测。
1.5.5 番鸭回肠组织α4+淋巴细胞流式检测将MOCK2组和MDRV2组中分离得到的淋巴细胞稀释至2×106个·mL-1。每个样品取100 μL细胞悬液，分别加入稀释度为1:100的10 μL rHis-α4多抗。再分别加入1:500稀释的FITC标记的羊抗兔IgG，4 ℃避光反应30 min。加入500 μL预冷的0.01 mol·L-1 PBS，2% BSA，1%叠氮钠混合液重悬细胞。用0 d空白对照组淋巴细胞调节流式细胞仪，选用FITC荧光通路后，对α4+淋巴细胞流式细胞仪进行检测。
1.5.6 石蜡切片免疫荧光试验取MOCK1组和MDRV1组回肠组织按常规方法制备切片，以抗MDRV-sigmaA兔源多克隆抗体(1:200)为一抗4 ℃孵育过夜，以Cy3标记的山羊抗免IgG(1:300)为二抗避光室温孵育50 min。洗涤后用DAPI染细胞核，避光室温孵育10 min。封片后于荧光显微镜下观察并采集图像。
1.6 数据处理所得的数据采用SPSS Statistics 22.0统计软件的单因子方差分析(ANOVA)对数据进行分析处理，用LDS多重比较法比较组间差异，结果以x±s表示。P < 0.05代表差异显著，P＜0.01代表差异极显著。
2 结果 2.1 孵育液及标记终浓度对标记率及荧光强度的影响CFSE标记淋巴细胞后，在荧光显微镜下可见带有绿色荧光的淋巴细胞(图 1)。首先通过流式细胞仪筛选出淋巴细胞群落R1(图 2A)。之后通过未标记CFSE淋巴细胞校准，结果如图 2B，校准后对不同孵育液和不同标记终浓度的淋巴细胞荧光率及荧光强度进行检测。
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A.普通显微镜观察；B.荧光显微镜观察 A. Observation under ordinary microscope; B. Observation under fluorescence microscope 图 1 显微镜观察CFSE标记番鸭淋巴细胞(100×) Fig. 1 Microscopic observation of CFSE-labeled lymphocytes of Muscovy duckling (100×) |
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A.流式细胞仪筛选的淋巴细胞群落；B.流式细胞仪校准结果 A. Lymphocyte community screened by flow cytometry; B.CFSE calibration results of flow cytometry 图 2 流式细胞仪筛选及校准结果 Fig. 2 Flow cytometry screening and calibration results |
使用不同浓度CFSE溶液在不同孵育液中标记淋巴细胞，流式检测分析获得CFSE+细胞率和荧光强度变化结果(图 3)。结果显示，在2.5~40 μmol·L-1 CFSE浓度下，PBS和1640细胞培养基作为孵育液时的标记率均接近100%(图 3A)，表明孵育液及不同标记终浓度对标记率没有影响；PBS孵育后CFSE平均荧光强度分别为875.65、1 229.45、2 208.04、3 200.00、3 993.49，显著(P < 0.05)高于RPMI 1640不完全培养基孵育后CFSE平均荧光强度266.51、536.55、943.84、1 989.05、3 064.35(图 3B)。表明PBS作为孵育液时淋巴细胞的CFSE平均荧光强度更高，并且随着CFSE标记终浓度的升高而增强。综上所述，选择PBS作为孵育液，并用高浓度的CFSE进行标记，可以提高标记细胞的荧光强度。
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*.P < 0.05 图 3 两种孵育液各浓度CFSE标记后番鸭淋巴细胞的CFSE+淋巴细胞率(A)和平均荧光强度(B, n≥3) Fig. 3 CFSE+ cell rate(A) and fluorescence intensity (B) of lymphocytes of Muscovy after being labeled with CFSE at different final concentrations of the two incubators(n≥3) |
标记后细胞的活性是体内淋巴细胞示踪成功的关键，只有在一定范围的CFSE浓度对细胞才是无毒的。本研究选用台盼蓝染色法计算不同孵育液及不同标记终浓度下的淋巴细胞存活率，结果显示(图 4)，在0~40 μmol·L-1的CFSE标记下，1640培养基孵育液组淋巴细胞平均存活率分别为98.2%、96%、93%、91%、89%、86% (P>0.05，差异不显著)；PBS孵育液组淋巴细胞平均存活率随着CFSE终浓度的上升而下降(92.50%、92.24%、87.80%、83.58%、76.74%、44.04%)，与空白对照(0 μmol·L-1)相比，2.5~10 μmol·L-1组差异不具有统计学意义(P>0.05)，而20~40 μmol·L-1组差异显著(P < 0.05)，淋巴细胞的细胞存活率随CFSE标记浓度的增加而降低。结果表明，培养基1640作为孵育液时淋巴细胞存活率差异不显著，在CFSE标记浓度一致的情况下，培养基1640作为孵育液时淋巴细胞存活率高于PBS孵育时的淋巴细胞存活率；而选择PBS作为孵育液，CFSE标记浓度应控制在2.5~10 μmol·L-1。
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*.P < 0.05 图 4 不同孵育液中各CFSE标记终浓度对淋巴细胞的活细胞率的影响(n≥3) Fig. 4 Effects of final concentration of each CFSE marker in different incubation solutions on the survival rate of lymphocytes (n≥3) |
综合CFSE+淋巴细胞率、平均荧光强度和标记细胞存活率的试验结果，在后续的试验中选用PBS作为孵育液，CFSE终浓度为10 μmol·L-1进行淋巴细胞染色标记。
2.3 番鸭血液及各脏器组织的CFSE信号动态检测10 μmol·L-1CFSE标记终浓度条件下，选用PBS为孵育液，对番鸭淋巴细胞进行标记，按番鸭体重每克2×105个淋巴细胞的比例通过番鸭肱静脉注射，分别于注射后2、3、6、9、12、24、48 h取外周血和脏器组织分离淋巴细胞以作流式细胞术检测。结果显示(图 5)外周血内的CFSE+淋巴细胞基本稳定在2%~5%，而脾在注射CFSE标记的淋巴细胞后2 h内达到最大值，而后整体呈下降趋势；胸腺和法氏囊的淋巴细胞趋势相反，当胸腺CFSE+淋巴细胞增加时，法氏囊的CFSE+淋巴细胞反而减少。空肠、回肠和盲肠CFSE+淋巴细胞在3 h内达到最大值，但9 h后十二指肠CFSE+淋巴细胞才大量增多。
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图 5 MDRV感染番鸭血液及各脏器组织的CFSE信号动态检测结果(n≥3) Fig. 5 Dynamic of CFSE signal of lymphocytes in blood and viscera tissues in MDRV infected Muscovy ducklings(n≥3) |
为了确定MDRV感染番鸭后在番鸭机体的表达情况，本试验检测了试验雏番鸭回肠MDRV的sigmaNS基因mRNA水平，结果显示，3~10 dpi为病毒基因表达高峰期，sigmaNS基因水平在6 dpi达峰值(图 6)。
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图 6 空白组(MOCK)与感染组(MDRV)病毒载量检测结果 Fig. 6 Figure of viral load detection results in MOCK group and MDRV group |
通过GraphPad软件分析回肠淋巴细胞流式检测结果(未显示)制作柱状图 7。结果显示，在所有的检测时间点，MDRV组中CFSE+淋巴细胞率均高于MOCK组，其中感染后1~10 d极显著(P < 0.01)高于MOCK组。在病毒感染高峰期，回肠淋巴细胞归巢程度显著升高，提示MDRV感染在一定程度上诱导淋巴细胞向回肠的迁移。
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**.P < 0.01 图 7 雏番鸭回肠CFSE+淋巴细胞率柱状图 Fig. 7 Results of CFSE+ lymphocyte in ileum of Muscovy ducklings |
α4β7属于整合素家族，是调节淋巴细胞向肠组织迁移的重要分子[17]。笔者采用流式细胞术检测回肠中α4+淋巴细胞的动态变化，通过GraphPad软件分析制作柱状图 8。结果显示，MDRV组雏番鸭肠道α4+淋巴细胞比率在整个试验期各个时间点均高于MOCK组，MDRV组在发病期(1~10 dpi)肠道α4+淋巴细胞比率极显著(P < 0.01)高于MOCK组；结果表明，MDRV感染可诱导肠道淋巴细胞归巢受体α4的表达，提高肠道中α4+淋巴细胞比率，尤其在发病期更为显著，可引起黏膜免疫反应。
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**.P < 0.01 图 8 回肠α4+淋巴细胞流式细胞术检测结果 Fig. 8 Results of ileum α4+ lymphocytes of Muscovy by flow cytometry |
为了验证CFSE染色试验结果，笔者采集感染后第6天注射过CFSE+淋巴细胞的番鸭回肠组织，通过石蜡切片免疫荧光试验进行观察。结果显示(图 9)，MDRV组sigmaA蛋白(红光)于回肠组织中大量表达，且带有CFSE信号(绿光)的淋巴细胞显著多于MOCK组番鸭。这表明MDRV组归巢至回肠CFSE+的淋巴细胞显著增加，进一步说明MDRV感染可以促进番鸭淋巴细胞向回肠归巢，引起黏膜免疫反应。
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图A为空白组与MDRV感染组的回肠组织的石蜡切片荧光结果(200×)，蓝色荧光代表DAPI染核荧光，红色代表MDRV蛋白sigmaA，绿色荧光代表静脉注射的带有CFSE+淋巴细胞。不是所有CFSE+淋巴细胞都被箭头标示。图B(2 000×)为图A的h图中箭头所指部分的局部放大 Immunostaining of ileum in control and MDRV-infected groups(Figure A, 200×), blue part indicated DAPI staining positive, red part indicated MDRV-sigmaA signal positive, green part indicated CFSE signal positive. Not all CFSE+lymphocyte are arrowed. Figure B(2 000×) show partial enlarged views of the arrowed parts in panel h of Fig. A 图 9 雏番鸭回肠CFSE+淋巴细胞的免疫荧光定位 Fig. 9 CFSE+ lymphocytes localization of ileum detected by immunofluorescence |
现有的细胞示踪方法主要有同位素标记法、磁标记技术、荧光染料标记技术、生物发光标记技术等[18]。应用荧光染料标记细胞的方法避免了同位素标记方法的污染及生物发光技术的繁琐标记过程又具有核磁标记技术的高效率[19-20]。CFSE荧光标记方法简单便捷、标记效率高、对细胞形态及增殖的影响小、适用于长期示踪研究[21]。在本试验发现细胞悬浮于1640中有助于细胞的存活，但CFSE的平均荧光强度显著低于PBS孵育的淋巴细胞(P < 0.05)。这可能是由于培养基带有胺基的物质(如自由氨基酸等)与CFSE发生竞争反应，从而降低了细胞内的荧光强度[22]。本试验最终确定了CFSE终浓度≤10 μmol·L-1条件下对悬浮于PBS中的番鸭淋巴细胞标记可以得到理想的标记效果及存活状况。在此标记条件下笔者对输注了2×105个·g-1(按体重计算淋巴细胞数)的番鸭CFSE+信号连续观察2 d，发现标记的CFSE+淋巴细胞最先往番鸭脾部位迁移定植，随后逐渐向其他器官迁移。当CFSE+淋巴细胞注射入番鸭体内3 h后，CFSE+淋巴细胞大量向空肠、回肠和盲肠部位迁移，9 h后大量向十二指肠黏膜部位迁移，归巢至其它免疫器官的淋巴细胞较少。肠道不仅是消化器官，也是体内最大的免疫器官，是重要的潜在环境病原致病的风险承担者，在免疫防御等方面发挥重要的作用[23]。因此探究病毒感染对番鸭肠道淋巴细胞迁移的影响对于肠道免疫作用的研究具有重要意义[24]。
本课题组前期研究发现，MDRV感染对雏番鸭肠道黏膜免疫抑制的调节作用与淋巴细胞迁移和跨越内皮细胞，参与淋巴细胞归巢活动有关[25]。本研究应用建立的CFSE标记示踪法，在所有的检测时间点，MDRV感染雏番鸭回肠中CFSE+淋巴细胞率均高于空白对照组，6 dpi达到峰值。据报道淋巴细胞在肠屏障表面炎性反应的启动过程中有着重要作用，淋巴细胞可刺激肠黏膜防卫素的分泌，进而诱导炎性细胞因子IL-6、IL-17和IL-22等的释放[26-27]。说明MDRV感染促进淋巴细胞大量归巢至回肠，从而引起免疫反应的发生，甚至可以引起肠道严重的炎症反应。有研究证明整合素α4分子是肠黏膜T细胞的归巢受体，也是肠道黏膜的固有层内典型的活化T细胞相关的标志物[28-29]。通过进一步检测发现MDRV感染能够诱导淋巴细胞α4的表达量，显著提高雏番鸭外周血和肠道α4+淋巴细胞比率，其趋势与标记番鸭的CFSE+淋巴细胞趋势保持一致。此外笔者运用荧光切片的方法对6 dpi的番鸭回肠组织进行观察，发现回肠中淋巴细胞数量明显增多，从另一层面直观反映了MDRV感染对回肠淋巴细胞归巢的促进作用。以上结果都说明CFSE+染色示踪方法可应用于淋巴归巢的研究中，并且笔者运用该方法揭示了MDRV感染能促进淋巴细胞向回肠归巢。肠道的淋巴细胞归巢是肠黏膜免疫系统重要的正常免疫活动之一，但过度的淋巴细胞归巢是免疫紊乱的病理基础[30]。MDRV如何诱导淋巴细胞归巢以及淋巴细胞归巢对肠道黏膜免疫的具体作用机制还需要进一步探究。
4 结论成功建立稳定的可用于流式检测和石蜡切片分析的番鸭淋巴细胞示踪方法，该方法初步应用提示MDRV感染可促进番鸭淋巴细胞向回肠归巢，为进一步研究番鸭呼肠孤病毒的感染机制提供了技术支撑。
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