2. 江苏省农业科学院兽医研究所, 农业部兽用生物制品工程技术重点实验室, 南京 210014
2. Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and Technology of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs(MARA) of China, Institute of Veterinary Medicine, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China
山羊副流感病毒3型(caprine parainfluenza virus type 3，CPIV3)为本课题组从羊群中分离出的一株新病毒[1]，其属于副黏病毒科(Paramyxoviridea)副黏病毒亚科(Paramyxovirinea)呼吸道病毒属(Respirvirus)的单股负链有囊膜的RNA病毒，该属成员有人副流感病毒Ⅰ型(human parainfluenza virus type 1，HPIV1)和人副流感病毒3型(HPIV3)、仙台病毒(Sendai virus，SV)和牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3)[2-3]。羊的CPIV3攻毒试验显示攻毒组出现流涕、高热和精神不振等临床症状，病羊剖检后发现其肺部和上呼吸道出现较为严重的病变，CPIV3还能感染周围圈舍的健康羊群，并可连续检测到CPIV3病毒血症和排毒，证明其有很强的传染力和致病性[4]。因此，CPIV3给养羊业的健康发展带来的威胁应该引起重视。
MicroRNAs(miRNAs)是一种长为20 nt左右的单链RNA，其来源于非编码区且在进化上非常保守[5]。miRNAs可以靶向结合某些蛋白分子形成沉默综合体(RISC)进而抑制其mRNA的翻译或使其mRNA降解，从而介导基因的表达[6]。研究表明，动物体内60%以上的蛋白编码基因表达受到miRNA的调控[7]，在生命体的各种生理和病理过程中扮演着重要的角色[8-9]。据报道，miRNA普遍可以靶向天然免疫通路中的重要分子，其中Ⅰ型干扰素(IFN)信号通路中的各种关键信号分子常成为miRNA的靶标[10]。研究发现，水疱性口炎病毒(VSV)感染诱导的miR-155能靶向调控细胞因子信号抑制物(SOCS1)，从而增强Ⅰ型IFN的表达[11]。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染宿主细胞时，miR-26a的表达量上调，而上调的miR-26a可促进Ⅰ型IFN和MX1、ISG15的表达[12]。然而，CPIV3诱导的miRNA在IFN通路中的作用机制尚不清楚。
为探索CPIV3感染MDBK细胞中miRNA的表达变化，前期研究将CPIV3感染MDBK细胞，通过高通量测序技术筛选出大量差异表达的miRNA，其中bta-miR-677在CPIV3感染细胞样品中显著上调[13]。通过TargetScan预测bta-miR-677靶基因发现，bta-miR-677可靶向线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondria antiviral signaling protein, MAVS)，MAVS是干扰素通路中的关键因子[14]，在MDBK细胞中过表达bta-miR-677可能会影响IFN表达变化。因此，本研究将bta-miR-677在MDBK细胞中进行过/抑制表达，并探讨bta-miR-677调控IFN的分子机制，为研究基于bta-miR-677防控CPIV3的分子药物提供重要的科学基础。
1 材料与方法 1.1 细胞与主要试剂MDBK和293T细胞均购于中国兽医药品监察所；CPIV3 JSHA2014-1为本研究组分离所得并保存。Lipofectamine 2000转染试剂和TRIzol RNA试剂盒均为Invitrogen公司产品，EasyScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、EasyScript One-Step RT-PCR SuperMix等PCR相关试剂购自北京全式金生物公司；LipofectamineRNAiMAX转染试剂、One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit及DNF内切酶购自TaKaRa公司，胶回收和质粒提取试剂盒均购自Axygen公司；MAVS抗体购自Abcam公司。双荧光素酶报告基因系统载体pRL-CMV、pGL3-control和Dual-Luciferase Reporter Gene AssayKit均购自Promega公司。
1.2 Bta-miR-677的设计与合成根据miRBase数据库(http://www.mirbase.org/)获得成熟bta-miR-677序列：CTCACTGATGAGCAGCTTCTGAC，设计bta-miR-677模拟物(bta-miR-677 mimics)、bta-miR-677抑制物(bta-miR-677 inhibitor)和bta-miR-677突变体(bta-miR-677 mut)，3种miRNAs由吉玛制药技术有限公司合成。
1.3 病毒感染与Bta-miR-677表达变化将MDBK细胞铺于24孔板中，待板中细胞达到90%汇合度后，分别接种0.5、1和3 MOI CPIV3 JSHA2014-1株病毒液，同时设立对照组；以同样的方法将1 MOI CPIV3 JSHA2014-1或紫外灭活的病毒接种MDBK细胞，分别于接毒12、24和48 h收取细胞，同时设立对照组；用qRT-PCR检测bta-miR-677表达量，所用引物qbta-miR-677序列见表 1。
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表 1 相关引物序列表 Table 1 The sequence of primers used in this study |
将MDBK细胞铺于24孔板中，待板中细胞达到70%汇合度后，分别将bta-miR-677 mimics、inhibitors和NC转染MDBK细胞，同时设立对照组，转染按照Lipofectamine 2000说明书进行；转染24 h收取细胞，用Transzol UP试剂提取细胞的总RNA，使用北京全式金生物公司的EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix和EasyScript One-Step RT-PCR SuperMix进行反转录和qRT-PCR检测。使用ABI Step One荧光定量PCR仪进行扩增，反应程序参照试剂盒说明书进行。以β-actin为内参计算转染miRNA组和NC对照组的IFN-α/β和IFI6、OAS1Y、OAS1Z、RSAD2、MX1和MX2转录量变化，结果以2－ΔΔCt表示。所用的引物见表 1。
1.5 bta-miR-677靶基因预测用TargetScan预测bta-miR-677的靶基因，选择与天然免疫信号通路相关的重要基因进行靶向验证和功能验证。
1.6 靶基因的验证 1.6.1 双荧光素酶报告基因系统验证bta-miR-677的靶基因根据MAVS mRNA的3′UTR设计引物，如表 1所示。进行RT-PCR扩增，然后将扩增所得的MAVS序列克隆至pGL3-control载体，构建重组载体pGL3-MAVS 3′UTR。将pGL3-MAVS 3′ UTR、pRL-CMV和bta-miR-677 mimics或bta-miR-677 mut共转染293F T细胞，利用试剂盒分析荧光素酶的变化。同时转染NC作为对照组。
1.6.2 qRT-PCR验证bta-miR-677的靶基因将MDBK细胞铺于6孔板中，待6孔板MDBK细胞长满70%，转染bta-miR-677 mimics，48 h后收取细胞，用Transzol UP试剂提取细胞中的总RNA后，使用qRT-PCR检测MAVS的mRNA水平。
1.6.3 Western blot验证bta-miR-677的靶基因将MDBK细胞铺于6孔板中，待6孔板MDBK细胞长至70%，转染bta-miR-677 mimics，48 h后用碧云天的Western blot细胞裂解液获取蛋白，将收获的上清收到1.5 mL离心管中，加入Loading Buffer，煮沸10 min使蛋白变性，然后进行SDS-PAGE电泳。随后将蛋白通过转印仪转印至NC膜，用碧云天的Western blot封闭液封闭过夜，将NC膜取出用PBST洗涤三次后，加入抗MAVS的抗体作为一抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗涤三次后，加入HRP标记的二抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗涤三次，加入ECL显色液后进行曝光显色分析。
1.7 MAVS基因敲减对Ⅰ型IFN和ISGs的影响根据MAVS的保守区域设计三条MAVS的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)，同时合成NC作为对照，序列见表 1，由上海吉玛公司合成。将MDBK细胞铺于24孔板中，待细胞密度达到70%时，将3条si-MAVS和NC同时转染MDBK细胞，24 h后收取细胞，用qRT-PCR检测IFN-α/β和IFI6、OAS1Y、OAS1Z、RSAD2、MX1、MX2的转录水平。
1.8 统计分析应用统计分析软件Graphpad Prism计算各组数据的平均值(x)和标准差(s)，每组试验结果都由试验重复3次，通过ANOVA、Least significance difference(LSD)方法进行计算。P < 0.05为差异显著，用*表示；P < 0.01、P < 0.001为差异极显著，分别用**和***表示。数据以x±s表示，用Graphpad Prism软件绘制bta-miR-677、IFN和MAVS mRNA等表达量变化趋势图。
2 结果 2.1 CPIV3感染对bta-miR-677表达的影响将CPIV3 JSHA2014-1株接种MDBK细胞，用qRT-PCR检测bta-miR-677表达变化，发现bta-miR-677表达量在CPIV3感染后12、24和48 h逐渐递增，如图 1A所示；且bta-miR-677的表达量随着接种CPIV3剂量的增加而增加，如图 1B所示；同时，接种经紫外灭活CPIV3的MDBK细胞bta-miR-677表达无明显变化，如图 1C所示。
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***. P < 0.001；*. P < 0.05 图 1 CPIV3感染后bta-miR-677表达上调 Fig. 1 Bta-miR-677 expression was upregulated during CPIV3 infection |
用bta-miR-677 mimics转染MDBK细胞，24 h后收集MDBK细胞，利用qRT-PCR检测细胞中的IFN-α/β和IFI6、OAS1Y、OAS1Z、RSAD2、MX1、MX2的转录水平。结果显示，IFN-α/β和6种ISGs转录均极显著上调(P＜0.001或P < 0.01)，如图 2、3所示。
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***. P < 0.001 图 2 Bta-miR-677过表达增加IFN-α/β的转录变化 Fig. 2 Bta-miR-677 mimics increase type Ⅰ interferon transcription in MDBK cells |
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***. P < 0.001；**. P < 0.01 图 3 Bta-miR-677过表达增加IFI6、MX1、MX2、OAS1Y、OAS1Z和RSAD2的转录 Fig. 3 Bta-miR-677 mimics increased IFI6, MX1, MX2, OAS1Y, OAS1Z and RSAD2 transcription in MDBK cells |
用bta-miR-677 inhibitor转染MDBK细胞，24 h后收集MDBK细胞，利用qRT-PCR检测细胞中的IFN-α/β和IFI6、OAS1Y、OAS1Z、RSAD2、MX1、MX2的转录水平。结果显示，IFN-α/β和6种ISGs转录均显著(P＜0.05)或极显著下调(P＜0.01)，如图 4、5所示。
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**. P < 0.01；*. P < 0.05 图 4 Bta-miR-677抑制表达降低IFN-α/β的转录变化 Fig. 4 Bta-miR-677 inhibitor decrease type Ⅰ interferon transcription in MDBK cells |
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图 5 Bta-miR-677抑制表达降低IFI6、MX1、MX2、OAS1Y、OAS1Z和RSAD2的转录 Fig. 5 Bta-miR-677 inhibitor decrease the IFI6, MX1, MX2, OAS1Y, OAS1Z and RSAD2 transcription in MDBK cells |
经TargetScan靶基因预测软件分析bta-miR-677的靶基因发现，MAVS的3′UTR中有bta-miR-677的靶向结合序列(3′UTR: 1 785-1 792 bp)，如图 6A所示。接着通过荧光素酶报告基因系统检测试剂盒检测荧光素酶活性水平，如图 6B所示，转染bta-miR-677 mimics能显著降低荧光素酶活性，与对照组相比降低2倍左右，差异极显著(P＜0.01)，而转染bta-miR-677-mut mimics不能降低荧光素酶活性，同正常对照组无显著差异。用qRT-PCR检测MAVS mRNA转录水平，结果显示，转染bta-miR-677 mimics组MAVS mRNA与对照组转录水平无明显差异(P>0.05)，见图 6C；用Western blot分析MAVS蛋白的翻译水平，结果显示，转染bta-miR-677 mimics能使MAVS蛋白表达量显著低于对照组，见图 6D。
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**. P < 0.01 图 6 Bta-miR-677靶基因的预测及验证 Fig. 6 Prediction and validation the target genes of bta-miR-677 |
将合成的3条针对MAVS基因的si-MAVS转染于MDBK细胞，通过qRT-PCR检测MAVS基因转录水平，结果显示，转染si-MAVS后MAVS转录水平极显著降低(P＜0.001)，见图 7A。用Western blot检测MAVS的蛋白水平，结果显示，转染si-MAVS后MAVS的蛋白水平显著下降，见图 7B。结果说明，si-MAVS能有效抑制MAVS的表达。转染si-MAVS 24 h后检测到IFN-α/β和6个ISGs极显著上调(P＜0.01或P＜0.001)，见图 8、9。
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A. MAVS相对转录水平；B.MAVS蛋白水平；***. P < 0.001 A. Relative transcription level of MAVS; B. Protein level of MAVS; ***. P < 0.001 图 7 Si-MAVS对MAVS的影响 Fig. 7 Si-MAVS decreased the expression of MAVS in MDBK cells |
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***. P < 0.001 图 8 Si-MAVS对IFN的影响 Fig. 8 Si-MAVS increased IFN transcription in MDBK cells |
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***. P < 0.001；**. P < 0.01 图 9 转染MAVS对IFI6、MX1、MX2、OAS1Y、OAS1Z和RSAD2的影响 Fig. 9 Si-MAVS increased IFI6, MX1, MX2, OAS1Y, OAS1Z and RSAD2 transcription in MDBK cells |
2011年，Delic′等[15]首次报道了查氏疟原虫感染可诱导miR-677的表达下调；另有Chang等[16]报道称，背根神经受损时miR-677的表达下调，但miR-677的功能及作用机制尚无报道。在本研究中，笔者将CPIV3感染MDBK细胞进行高通量测序发现，有240个miRNA在病毒感染中下调，9个miRNA在病毒感染中上调，其中bta-miR-677上调2.6倍[13]。为进一步揭示bta-miR-677上调与CPIV3感染的相关性，本研究将不同剂量的CPIV3接种于MDBK细胞，经qRT-PCR检测发现，bta-miR-677转录水平与CPIV3呈时间和剂量依懒性。因此，bta-miR-677在CPIV3感染过程中的功能与作用值得深入研究。
病毒入侵机体后会引发一系列的抗病毒反应，同时也会诱导机体miRNA的表达出现变化，这些miRNA通常会靶向某些天然免疫通路中的关键分子，进而调控Ⅰ型IFN的表达。研究表明，miR-146a可通过靶向白细胞介素-1受体激酶(IRAK1)和泛素连接酶(TRAF6)抑制Ⅰ型IFN信号通路[17]；miR-30e*可通过靶向核因子抑制蛋白(IκBα)从而促进Ⅰ型IFN的表达[18]；miR-373可靶向两面神激酶1(JAK1)和干扰素调节因子9(IRF9)抑制Ⅰ型IFN的表达[19]。在本研究中，笔者将bta-miR-677 mimics转染MDBK细胞，通过qRT-PCR检测发现Ⅰ型IFN和6种ISGs(IFI6、OAS1Y、OAS1Z、RSAD2、MX1和MX2)转录水平上调。结果表明，bta-miR-677参与调控Ⅰ型IFN信号通路。但bta-miR-677促进Ⅰ型IFN和ISGs产生的分子机制还需要进一步验证。
随后，本研究用TargetScan预测miR-677的靶基因及其潜在的结合位点，发现MAVS mRNA的3′UTR中存在bta-miR-677的结合位点。MAVS是视黄酸诱导基因蛋白Ⅰ(RIG-Ⅰ)和黑素瘤差异化相关基因5(MDA5)受体重要的共同配体[20]，在病毒感染期间，RIG-Ⅰ和MDA5受体能够识别病毒的RNA，随后激活MAVS[21-22]，MAVS通过招募和激活核因子κB激酶抑制剂IKK和TBK1，从而激活IRF3/7和核转录因子NF-κB，进而诱导IFN和炎性细胞因子的产生[23]。据报道，将鹅MAVS的PRR结构域缺失后发现，下游ISGs的mRNA水平显著提高[24]；VSV也可以通过裂解MAVS蛋白抑制Ⅰ型IFN的产生[25]；另有报道，丙型肝炎病毒(HCV)感染后，MAVS能够诱导Ⅰ型和Ⅲ型干扰素[26]。在本研究中，通过双荧光素酶报告系统、qRT-PCR、Western blot和RNAi等试验方法验证了bta-miR-677对MAVS的靶向调节作用。并证实bta-miR-677可通过靶向MAVS，提高Ⅰ型IFN及IFI6、OAS1Y、OAS1Z、RSAD2、MX1和MX2转录水平。
综上所述，本研究揭示了bta-miR-677调控Ⅰ型IFN和ISGs表达的分子机制。首次鉴定了bta-miR-677可靶向MAVS，正向调节Ⅰ型IFN，进而促进ISGs产生的功能。此结果为基于bta-miR-677研究治疗CPIV3感染的分子药物奠定了科学基础。
4 结论Bta-miR-677可通过靶向降解MAVS的蛋白翻译水平提高Ⅰ型IFN和IFI6、OAS1Y、OAS1Z、RSAD2、MX1、MX2表达量。
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