猪瘟(classical swine fever, CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)引起的一种高度接触性传染病，对世界养猪业造成了严重危害，被世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health, OIE)列为必须报告的动物疫病之一^[1]。CSFV是单股正链RNA病毒，属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)。CSFV基因组仅包含1个开放阅读框，编码约由3 900个氨基酸组成的多聚蛋白，该蛋白在宿主及病毒蛋白酶作用下最终将裂解为四个结构蛋白(包括核衣壳蛋白C、E1、E2及E^rns)与八个非结构蛋白(包括N^pro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及NS5B)^[2-3]。其中，囊膜糖蛋白E2在细胞或病毒粒子表面以同源或者异源二聚体的形式存在，在病毒吸附和入侵宿主细胞中起主要作用，且严重影响着CSFV的毒力^[4-5]。此外，E2是CSFV的主要保护性抗原，可诱导中和抗体产生，已被证明是一个最有效的免疫原^[6-7]。

目前，针对猪瘟的系统化预防接种以及包括消毒、检疫、隔离、无害化处理等在内的生物安全措施是控制该病流行的主要策略。长期以来，弱毒疫苗如中国猪瘟兔化弱毒疫苗(C株)的使用对猪瘟的控制起到了极大的作用，为世界范围内许多国家猪瘟的净化作出了巨大贡献。然而，传统C株疫苗不具备标记特性，该疫苗的使用不利于区分猪群中的野毒感染猪和疫苗免疫猪，这就给当前我国猪瘟的防控与净化带来了困难与新的挑战^[8-9]。为解决这一问题，欧盟首先致力于大规模研制更为安全且可进行鉴别诊断的E2蛋白亚单位疫苗。我国有多个课题组相继利用大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞杆状病毒表达系统进行E2蛋白的体外表达^{[6-7, 10-11]}。在昆虫细胞杆状病毒表达系统中，表达产物可进行更为充分的翻译后加工，因而其表达蛋白结构及生物活性与天然蛋白更为相似，相关研究表明，E2蛋白的糖基化对其免疫保护起决定作用^[12]。

E2蛋白作为CSFV疫苗研发的主要靶标，实现其高效表达是进行相关研究的基础，为提高E2蛋白在杆状病毒表达系统中的表达效率，本研究通过引入信号肽序列使E2蛋白实现分泌表达，进一步比较不同信号肽介导E2蛋白分泌表达的水平，从而筛选出有利于E2蛋白高效分泌表达的信号肽，随后从培养液上清中纯化E2蛋白，进行蛋白免疫原性分析，从而为E2亚单位疫苗的研制奠定基础。

1 材料与方法 1.1 试验材料

pFastBac1载体、DH10Bac感受态细胞、sf21细胞及猪瘟阳性血清均由河南省动物免疫学重点实验室保存。pUC57-E2由上海生工生物工程股份有限公司合成，E2基因末端有组氨酸标签相应碱基序列。重组酶、PNGase F购自NEB公司，琼脂糖购自Sigma公司，羊抗猪IgG购自天根生物技术有限公司，质粒小提试剂盒购自QIAGEN公司，其他试剂均为国产分析纯。15只6周龄雌性BALB/c小鼠购自郑州大学实验动物中心。

1.2 不同信号肽序列的引物设计

根据来自CSFV的内源信号肽序列(E1末端33个氨基酸对应碱基序列)、蜂素信号肽序列及gp67信号肽序列设计引物(表 1)。

1.3 重组质粒的构建及鉴定

上述引物经overlap PCR得到信号肽序列，将其通过同源重组方法插入pFastBac1载体。随后将E2基因经PCR扩增，上游引入BamHⅠ酶切位点，下游引入XhoⅠ酶切位点，PCR产物及pFastBac1载体经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切后回收，经DNA连接酶连接，得到重组质粒pFastBac1-endo-E2、pFastBac1-mel-E2和pFastBac1-gp67-E2，同时将未连接信号肽的重组质粒pFastBac1-E2作为对照，最终产物通过PCR进行鉴定。

1.4 重组黏粒的获得及鉴定

将“1.3”所获重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞，经蓝白斑筛选，挑选白色菌落于LB液体培养基，振荡培养过夜，随后使用QIAGEN试剂盒提取重组黏粒，分别命名为Bacmid-E2、Bacmid-endo-E2、Bacmid-mel-E2和Bacmid-gp67-E2，使用M13通用引物进行PCR鉴定。

1.5 杆状病毒的获得及扩增

以8×10⁴~1×10⁶个·孔^-1的细胞数将处于对数生长期的sf21细胞加入六孔板，静置15 min以上使细胞充分贴壁。在Cellfectin Ⅱ介导下，将重组黏粒转染至上述贴壁sf21昆虫细胞，观察细胞病变情况。细胞发生典型病变后，收取细胞培养上清作为第一代重组杆状病毒P1。在10 cm无菌培养皿中加入无血清培养基10 mL，随后加入sf21细胞，使细胞总数在6×10⁶个左右，轻晃培养皿使细胞均匀分布，静置约10 min，待细胞贴壁后，向其中加入800 μL左右的P1病毒，将培养皿放入28 ℃培养箱，避光静置培养3~4 d，收获细胞培养上清，即为2代病毒P2。使用同样方法扩增，收集P3代杆状病毒。

1.6 E2蛋白的表达及鉴定

以5个感染复数的P3代杆状病毒接种至对数生长期的sf21细胞，在不同时间点(48、72、96 h)分离培养上清，使用抗His标签单抗进行Western blot分析鉴定，从而检测不同时间点E2蛋白分泌表达情况。

1.7 E2蛋白的纯化

离心收集E2分泌表达培养上清，用0.22 μm滤膜过滤后，将上清通过镍离子亲和柱亲和纯化，经Buffer A(20 mmol·L^-1 Tris-HCl pH 7.5，150 mmol·L^-1 NaCl，20 mmol·L^-1咪唑)进行漂洗，随后用Buffer B(20 mmol·L^-1 Tris-HCl pH 7.5，150 mmol·L^-1 NaCl，200 mmol·L^-1咪唑)进行洗脱，收集洗脱液。收集纯化过程中各组分，经SDS-PAGE进行分析，并使用猪瘟阳性血清作为一抗进行Western blot鉴定。

1.8 E2蛋白糖基化水平鉴定

10 μL反应体系中，加入3 μg “1.7”纯化所得E2蛋白，1 μL 10×糖蛋白变性缓冲液和水。100 ℃煮沸10 min，使蛋白变性。加入2 μL 10×反应缓冲液，2 μL 10% NP-40，1 μL PNGase F，加水使反应体系至20 μL，37 ℃孵育1 h，随后经SDS-PAGE进行分析。

1.9 E2蛋白抗原性的分析

纯化的E2蛋白稀释至2 μg·mL^-1，每孔100 μL包被ELISA板，5%的脱脂奶粉封闭。猪瘟阳性血清以2倍比稀释，100 μL·孔^-1加入ELISA板，同时设置阴性血清对照，37 ℃孵育1 h，PBST漂洗后，加入1 000倍稀释的羊抗猪IgG，100 μL·孔^-1，37 ℃孵育1 h，PBST漂洗，TMB显色后读取OD_{450 nm}值。

1.10 动物免疫试验

将15只BALB /c小鼠随机分成3组，每组5只。A组：PBS阴性对照组；B组：阳性对照组，1/10头剂量的猪瘟商品疫苗；C组：E2蛋白加ISA201佐剂。分别采用皮下注射的方式进行免疫，在第1天进行一免，第28天进行二免，每7 d进行尾缘静脉采血。

1.11 抗体检测

采用IDEXX阻断ELISA试剂盒检测血清中猪瘟特异性抗体水平变化，操作按照试剂盒说明书进行，阻断率小于30%的为阴性，大于40%为阳性，之间为可疑。

2 结果 2.1 含不同信号肽序列的E2蛋白分泌表达质粒的构建

通过PCR扩增信号肽序列，将其通过同源重组方法插入pFastBac1载体。随后将E2基因经PCR扩增，上游引入BamHⅠ酶切位点，下游引入XhoⅠ酶切位点，将PCR产物及pFastBac1载体经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切后回收，酶切后片段及载体进行连接，从而得到不含信号肽的重组质粒pFastBac1-E2，以及含不同信号肽序列的3个重组质粒pFastBac1-endo-E2、pFastBac1-mel-E2和pFastBac1-gp67-E2(图 1)。

重组质粒经PCR鉴定，结果如图 2所示，目的片段的大小约为1 kb，阴性对照未见目的条带，重组质粒的PCR结果均符合预期，表明重组质粒制备成功。

2.2 重组黏粒的获得及鉴定

将重组质粒pFastBac1-E2、pFastBac1-endo-E2、pFastBac1-mel-E2和pFastBac1-gp67-E2分别转化至DH10Bac感受态细胞，经蓝白斑筛选，挑选白色菌落于LB液体培养基，振荡培养过夜，使用QIAGEN试剂盒提取黏粒，经M13通用引物进行PCR鉴定。鉴定结果如图 3所示，阴性对照未见目的条带，对于发生转座的阳性黏粒，其目的片段大小应为2.3 kb以上，重组黏粒的PCR产物大小约为3.3 kb，结果符合预期，表明挑选的白斑均成功发生了转座。

2.3 不同信号肽介导E2蛋白分泌表达的效率

利用重组黏粒感染sf21细胞，得到重组杆状病毒，使用P3代病毒感染细胞，收集不同时间点(48、72、96 h)的E2分泌表达培养上清，使用抗His标签单抗进行Western blot分析，比较E2蛋白表达量。结果如图 4所示，在没有信号肽介导的情况下，E2蛋白未实现分泌表达，在引入endo、mel或者gp67信号肽的情况下，E2蛋白均能够进行分泌表达。其中，gp67信号肽介导的E2蛋白分泌表达量最高，在培养72 h时，表达量达到峰值。

2.4 E2蛋白的纯化

收集引入gp67信号肽的重组病毒，使用其P3代病毒感染sf21细胞，收集72 h培养上清，经镍填料进行纯化，收集纯化过程中培养液上清、流穿液、漂洗液、洗脱液组分，进行SDS-PAGE分析。结果如图 5所示，由纯化结果可以看出，经镍填料纯化后，培养液上清杂蛋白得到有效去除，E2蛋白得到有效富集、纯化，其大小约为45 ku，大于其理论相对分子质量，表明所得蛋白存在糖基化等翻译后修饰。此外，最终洗脱液中E2蛋白纯度较高，达到90%以上，产率为25 mg·L^-1。Western blot检测结果表明，纯化的E2蛋白能与猪瘟阳性血清特异性反应，且为单一条带。

2.5 E2蛋白的糖基化水平分析

为了验证纯化所得E2蛋白具有糖基化修饰，利用N-糖酰胺酶F(PNGase F)处理E2蛋白，37 ℃温浴1 h后，进行SDS-PAGE分析。结果如图 6所示，加入PNGase F后，E2蛋白条带变窄变清晰，且对应相对分子质量明显变小，由约45 ku变为40 ku，这证实了E2蛋白中含有糖基化位点，且杆状病毒表达的E2蛋白糖基化水平较高。

2.6 E2蛋白的抗原性分析

将纯化后的E2蛋白以0.2 μg·孔^-1的量包被酶标板，检测重组蛋白的抗原性。随着血清稀释度的增加，OD_{450 nm}值呈下降趋势，当血清1:51 200稀释时，阳性值仍在阴性值8倍以上(图 7)，表明纯化所得E2蛋白能特异性识别猪瘟阳性血清中的抗体，且灵敏性良好。

2.7 抗体水平检测

第1、28天对小鼠分组进行免疫，并将每周采集的血清进行阻断ELISA检测。结果(图 8)显示，PBS组未检测到特异性抗体，E2和商品苗免疫组小鼠于一免后14 d开始产生猪瘟特异性抗体，加强免疫后抗体水平进一步升高，并在一免后35 d达到峰值。由此可见，纯化后的E2蛋白免疫原性良好。

3 讨论

E2亚单位疫苗具有安全性高、可进行鉴别诊断等优点，是新型CSFV疫苗的重点研究方向^{[9, 13-17]}。但是，E2亚单位疫苗一般需要加强免疫，因而对抗原需求量较大，通过相关手段实现其高效表达，对于降低疫苗生产成本具有重要意义^[18]。与其他表达系统相比，昆虫细胞杆状病毒表达系统具有以下特点：(1)与原核表达系统相比，昆虫细胞不产生内毒素，从而可省去纯化过程中去除内毒素的步骤；(2)昆虫细胞杆状病毒表达系统能够对蛋白质进行必要的翻译后加工，包括糖基化、磷酸化、酰基化等，从而使蛋白构象接近其天然状态；(3)与其他真核表达系统相比，昆虫细胞杆状病毒表达系统具有表达量高的特点。建立E2蛋白的昆虫细胞杆状病毒表达系统、提高蛋白的分泌表达水平对于相关研究具有重要意义。本研究使用昆虫细胞杆状病毒表达系统进行E2蛋白的表达，最终得到的E2蛋白糖基化水平较高，更接近其天然构象，且蛋白表达量较高，达到25 mg·L^-1。

在工业生产中，蛋白的分泌表达一直备受青睐^{[14, 19-21]}。分泌表达的优点在于一方面可避免目的蛋白因具有细胞毒性而影响蛋白胞内表达，另一方面可减少胞内蛋白对纯化过程的干扰，从而简化纯化步骤。信号肽是引导细胞内新合成蛋白质转移到内质网进而分泌到细胞外的一段短肽，通常由15~30个氨基酸残基组成，位于新合成肽链的N端，因其特有的功能在外源基因的表达上得以广泛应用。同一种蛋白在不同信号肽的作用下即使都能分泌表达，其分泌效率也会相差甚远^[22]。本研究通过信号肽的插入实现了E2蛋白的分泌表达，这一方面有利于E2蛋白的翻译后加工修饰，另一方面有利于简化后续纯化步骤，从而降低生产成本。本研究通过比较不同信号肽对E2分泌效率的影响，最终选择了信号肽gp67。

镍填料一步纯化所得E2蛋白纯度较高，且样品回收率较高，产率达到25 mg·L^-1，这表明，分泌表达中杂蛋白的干扰大大减少，E2蛋白挂柱效率高，从而提高了E2蛋白的纯化效率，节约了纯化成本。综上，本研究成功利用昆虫细胞杆状病毒表达系统实现了E2蛋白的高效分泌表达，且蛋白免疫原性良好。

4 结论

通过引入信号肽实现E2蛋白的分泌表达，通过比较蛋白分泌表达水平选择更优的信号肽序列，实现了gp67介导的E2蛋白在昆虫细胞杆状病毒表达系统中的高效分泌表达，进一步纯化得到纯度较高的E2蛋白，蛋白糖基化水平较高，产率约为25 mg·L^-1，且蛋白免疫原性良好，从而为E2亚单位疫苗的研制奠定了基础。