2. 四川农业大学, 畜禽遗传资源发掘与创新利用四川省重点实验室, 成都 611130;
3. 泸州市农业农村局, 泸州 646000;
4. 成都市动物疫病预防控制中心, 成都 610041
, ZHANG Peiwen1,2, DU Jingjing1,2, XIAO Junsen1,2, YANG Dongli3, WANG Dingguo4, ZHANG Shunhua1,2, ZHU Li1,2
2. Farm Animal Genetic Resources Exploration and Innovation Key Laboratory of Sichuan Province, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China;
3. Luzhou Bureau of Agricultural and Rural Affairs, Luzhou 646000, China;
4. Chengdu Animal Epidemic Prevention and Control Center, Chengdu 610041, China
肌肉组织是动物重要的运动器官，约占动物体重的40%，是毛细血管分布最为丰富的组织之一，在运动、葡萄糖摄取与利用、内分泌等方面扮演着重要角色[1-3]。除此之外，肌肉组织也参与骨折后修复过程[4]，还能在机体缺氧时有效保护机体暂时免受缺氧损伤[5]。近年来，由于能量摄入过多、代谢紊乱或遗传缺陷等因素导致的机体肥胖已成为世界性流行疾病。肥胖已成为危害人类健康的重要因素，可诱发心脑血管疾病、慢性炎症、糖尿病等，甚至与癌症的发生息息相关[6-9]。白色脂肪作为主要的储能组织，其过度沉积是肥胖综合征形成的主要原因[10]。更值得注意的是，当白色脂肪的能量储备能力达到极限时，过多的能量会以甘油三酯的形式转移至非脂肪组织——肌肉组织中进行异位储存，进而破坏肌肉组织的能量代谢和内分泌功能，诱发胰岛素抵抗和肌肉萎缩等疾病[11-13]。因此，研发预防或治疗肥胖、清除肌肉组织中白色脂肪过多沉积的药物已刻不容缓。
然而，市面上目前仍未开发出可有效治疗肥胖及其代谢综合征的药物。甜菜碱是一种来源于日常食物(如菠菜、海产品、小麦、甜菜等)，可在体内稳定循环、无毒无害的天然小分子[14]。已有的研究结果表明，甜菜碱不仅可改善高脂饮食诱导的小鼠体重增加和胰岛素抵抗，还可促进骨骼肌发育、提高人或小鼠的运动能力、缓解酒精性脂肪肝等[15-16]。此外，研究者还发现，日粮中添加甜菜碱可改变猪肌内脂肪含量[17-18]，但其结果因猪种不同而存在较大差异。因此，甜菜碱对肌肉组织中脂肪沉积的影响及其相关分子机制仍待进一步研究。据此，本试验以ob/ob肥胖小鼠为研究模型，通过在饮水中添加甜菜碱以探究其对遗传缺陷导致的肌肉组织中异位脂肪储存的影响，以期为开发预防或治疗肥胖及相关代谢综合征的药物提供基础数据和理论参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料6周龄雄性ob/ob肥胖小鼠购自江苏集萃药康生物科技有限公司；小鼠正常日粮购自成都达硕实验动物有限公司；甘油三酯测定试剂盒购自南京建成生物技术有限公司；血糖仪和血糖试纸购自上海罗氏血糖健康医护公司；甜菜碱、油红O粉末等试剂购自Sigma公司；96孔板购自生物工程(上海)股份有限公司；10 μL、200 μL、1 mL枪头，200 μL、1 mL EP管购自AXYGEN公司；异丙醇、75%酒精、氯仿、甲醇等试剂购自成都科隆化学品有限公司；DEPC水购自索莱宝科技有限公司；PCR仪购自成都百乐科技有限公司；气相色谱-质谱联用系统(GC-MS 7890B-5977A)购自安捷伦公司；台式冷冻离心机购自上海卡耐兹实验仪器设备有限公司。
1.2 试验动物将饲喂正常日粮的同批次12只ob/ob小鼠随机均分为试验组和对照组，每组6个重复，每个重复1只小鼠。其中正常组小鼠饮用纯净水，试验组小鼠饮用的纯净水中含1%甜菜碱。试验期间，小鼠可自由采食和饮水，环境温度控制在(22±4) ℃，12 h/12 h光暗循环。1个月后小鼠被脱颈处死，并迅速采集肌肉组织样品置于液氮，随后转移至－80 ℃冰箱保存。本试验在四川农业大学动物科技学院实验动物饲养管理和使用委员会的批准下执行。
1.3 ob/ob小鼠肌肉组织油红O染色取出－80 ℃冻存的肌肉组织样本，经4%多聚甲醛固定、乙醇脱水、二甲苯透明后制作厚10 μm的冰冻切片，放于－20 ℃冰箱保存备用。将－20 ℃保存备用的切片用油红O染液(0.5 g油红O粉末溶解于100 mL异丙醇中，待充分溶解后用定性滤纸去除杂质即可使用，每次现用现配)染色15 min，经60%异丙醇以及PBS洗去多余油红染液后，再由苏木精复染细胞核5 min，最后洗净苏木精并用甘油明胶封片。
1.4 ob/ob小鼠空腹血糖含量测定试验1个月后，试验小鼠断料不断水管控12 h，随后采取其尾部静脉血液，滴至血糖试纸测定部位，并迅速用罗氏血糖仪检测小鼠饥饿后血糖浓度(mmol·L-1)。
1.5 ob/ob小鼠肌肉组织甘油三酯含量测定称取适量肌肉组织样本((30±3) mg)，随后按重量(g):体积(mL)=1:9的比例加入匀浆介质(无水乙醇)，在冰水浴条件下机械匀浆；混匀后，2 500 g·min-1离心10 min，取上清液检测。向96孔透明板上加入工作液250 μL，再分别加入2.5 μL蒸馏水、标准品和待测样本，经酶标仪37 ℃孵育10 min后，在510 nm波长下测定各孔吸光值，最后绘制标准曲线并计算得出待测样本的甘油三酯含量(mmol·g-1)。
1.6 ob/ob小鼠肌肉组织脂肪酸组成测定称取(100±5) mg肌肉组织匀浆后加2 mL正己烷，在50 ℃水浴环境下振摇30 min，随后加3 mL KOH甲醇溶液(0.4 mol·L-1)使样品溶解，再次50 ℃振摇衍生30 min，使样品中脂肪酸甲酯化，冷却后加1 mL蒸馏水、2 mL正己烷充分混匀，静置分层后取上层，由气相色谱-质谱联用系统(GC-MS 7890B-5977A)检测。色谱条件：毛细管色谱柱(DB-23 30 m×320 μm×0.25 μm)；柱温为程序升温，进样口温度250 ℃，初始柱箱温度50 ℃保持1 min，25 ℃·min-1升至175 ℃后，4 ℃·min-1升至230 ℃保持10 min，检测器温度230 ℃；载气：氦气，流速50 mL·min-1；进样体积1 μL；分流比1/5。
1.7 实时荧光定量检测ob/ob小鼠肌肉组织基因表达用1 mL Trizol试剂提取50~100 mg肌肉组织样本总RNA，首先加入氯仿使RNA与蛋白质等有机溶质分离；随后加入异丙醇使样品中RNA沉淀；接着加入75%乙醇再次沉淀RNA，并洗去前面步骤残存的氯仿以及异丙醇；最后空气干燥2~3 min并用30 μL DEPC水稀释，－80 ℃保存备用。
取1 μL RNA使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa)进行mRNA的反转录，共两步：第一步取200 μL EP管加入1 μL RNA样品以及试剂盒中1、2、6号试剂各1、2、6 μL，离心混匀后在PCR仪经42 ℃ 2 min后去除基因组DNA；第二步取出EP管后再加入试剂盒中3、4、5、6号试剂各1、4、1、4 μL，离心混匀，在PCR仪上经37 ℃ 15 min后83 ℃ 5 s将单链RNA反转录生成cDNA，并稀释成50 ng·μL-1备用。
根据TB GreebTM Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒进行实时荧光定量检测，即在96孔板中加入配好的体系(包括上下游引物各0.5 μL，DEPC水3 μL，TB green 5 μL，cDNA样品1 μL)，使用CFX96荧光定量仪(Bio-Rad)对脂肪酸合成以及代谢相关基因表达进行检测。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，退火温度退火30 s，39个循环；72 ℃延伸1 min。从GenBank中检索试验所需基因参考序列信息，用Primer 5.0软件设计引物(表 1)，由成都擎科生物技术有限公司合成。β-actin作为mRNA的内参基因，运用2-△△Ct方法计算基因相对表达量[19]。
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表 1 qRT-PCR引物信息 Table 1 The primer information used for qRT-PCR |
所有数据用“平均值±标准差(mean±SE)”表示。利用SPSS22.0对数据进行Student’s t-test分析，P＞0.05、P＜0.05、P＜0.01分别代表差异不显著、差异显著、差异极显著。
2 结果 2.1 甜菜碱对ob/ob小鼠体重增加的影响由图 1可知，经饮水补饲甜菜碱1个月后，对照组小鼠体重增加(6.35±0.284 3) g，试验组小鼠体重增加(5.175±0.624 5) g，试验组ob/ob小鼠的体重增加被显著抑制(P < 0.05)。
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对照组(NC)为饲喂正常日粮和纯净水的ob/ob小鼠，试验组(Bet)为饲喂正常日粮和含1%甜菜碱纯净水的ob/ob小鼠。*.P＜0.05 The control group was ob/ob mice fed normal diet and purified water; The experimental group was ob/ob mice fed normal diet and purified water containing 1% betaine.*. P < 0.05 图 1 甜菜碱对ob/ob小鼠体重增加的影响 Fig. 1 Effect of betaine supplementation on body weight gain of ob/ob mice |
油红O染色结果显示，与对照组相比，补饲甜菜碱后小鼠肌肉组织中油红着色的面积相对减少(图 2A)，即脂质沉积量减少。与上述观察结果相符，如图 2B所示，对照组小鼠肌肉组织中甘油三酯含量为(0.019 2 ± 0.001 8) mmol·g-1，显著高于补饲甜菜碱小鼠((0.014 5 ± 0.001 5) mmol·g-1, P < 0.05)。与此同时，qRT-PCR结果显示，与对照组相比，补饲甜菜碱小鼠肌肉组织中的甘油三酯水解关键基因ATGL和HSL的表达量极显著升高(P＜0.01)。上述结果表明，甜菜碱补充可显著减少ob/ob小鼠肌肉组织中的脂质积累。
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A.小鼠肌肉组织的油红O染色(200×)；B.甘油三酯含量检测；C、D.qRT-PCR检测HSL和ATGL mRNA表达水平。*.P＜0.05；**.P＜0.01，下同 A. Oil red O staining on mouse muscle tissue(200×); B. Triglyceride content was detected; C, D. qRT-PCR was used to detect HSL and ATGL mRNA expression levels. *. P < 0.05;**. P < 0.01, the same as below 图 2 ob/ob小鼠肌肉组织脂质沉积情况检测 Fig. 2 Lipids deposition detection in muscle tissues of ob/ob mice |
将所有小鼠禁饲不禁水管控12 h后，取尾部静脉血液进行血糖含量检测。结果显示(图 3)，对照组小鼠的血糖含量为(10.7±0.263 0) mmol·L-1，补饲甜菜碱小鼠的血糖含量为(7.6±0.282 8) mmol·L-1，二者差异具有统计显著性(P < 0.05)。与对照组相比，补饲甜菜碱小鼠肌肉组织中的GLUT4表达水平极显著升高(P < 0.01)。
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A.ob/ob小鼠禁饲不禁水12 h后血糖水平；B. qRT-PCR检测肌肉组织内GLUT4 mRNA水平 A. The blood glucose level of ob/ob mice after fasting for 12 h; B. qRT-PCR was used to detect GLUT4 mRNA expression level in muscle tissue 图 3 ob/ob小鼠禁饲12 h后血糖水平检测 Fig. 3 Blood glucose level of ob/ob mice after fasting for 12 h |
由图 4可知，与对照组相比，补饲甜菜碱小鼠肌肉组织中辛酸/羊脂酸(C8:0)、十四烷酸/肉豆蔻酸(C14:0)、十六烷酸/软脂酸/棕榈酸(C16:0)、十七烷酸/珍珠酸(C17:0)、十八烷酸/硬脂酸(C18:0)、十四碳烯酸/肉豆蔻烯酸(C14:1)、十六碳烯酸/棕榈油酸(C16:1)、十八碳烯酸/油酸(C18:1)、十八碳二烯酸/亚油酸(C18:2)、十八碳三烯酸/亚麻酸(C18:3)、二十碳二烯酸/附子脂酸(C20:2)、二十碳四烯酸/花生四烯酸(C20:4)、二十二碳六烯酸/DHA(C22:6)的含量分别升高了2.4、2.0、1.9、2.0、1.5、1.6、1.8、2.1、2.2、1.9、2.1、1.4倍(P＜0.05)。而葵酸/羊蜡酸(C10:0)、十二烷酸/月桂酸(C12:0)的含量则分别升高了2.7和2.8倍(P＜0.01)。进一步的分析表明，补饲甜菜碱后小鼠肌肉组织中的饱和脂肪酸(saturated fatty acids, SFA)和多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFA)比例均显著升高(P＜0.05)，单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acids, MUFA)呈升高趋势，但差异不显著(P>0.05)。上述结果表明，甜菜碱抑制ob/ob小鼠肌肉组织中的脂质积累可能与脂肪酸代谢相关。
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图 4 ob/ob小鼠肌肉组织脂肪酸组成 Fig. 4 Fatty acid composition in muscle of ob/ob mice |
为进一步揭示甜菜碱对ob/ob小鼠肌肉组织脂质积累与脂肪酸代谢的影响，本研究利用qRT-PCR检测肌肉组织中脂肪酸合成及脂肪酸β氧化相关基因的表达量水平。结果显示(图 5)，补饲甜菜碱后，小鼠肌肉组织中脂肪酸合成关键基因FAS表达量显著降低(P＜0.05)，而ACS表达量无显著变化。相反，参与脂肪酸β氧化的关键调控因子PPARα、ACOX2、ACADL、CD36的表达量均极显著地高于对照组(P＜0.01)。上述结果表明，甜菜碱可通过抑制脂肪酸合成、促进脂肪氧化来减少ob/ob小鼠肌肉组织中的脂质积累。
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图 5 ob/ob小鼠肌肉组织脂肪酸合成及β氧化相关基因表达水平 Fig. 5 mRNA expression levels of fatty acid synthesis and β oxidation-related genes in muscle tissue of ob/ob mice |
ob/ob小鼠是瘦素基因(leptin)缺陷小鼠，瘦素基因主要通过抑制食欲、增加能量消耗、抑制脂肪酸合成并促进其分解等过程来对脂肪及体重进行调控，而ob/ob小鼠具体表现为体重迅速增加、摄食过量、胰岛素抵抗、代谢减弱等，常被用作研究肥胖及Ⅱ型糖尿病的模式动物[20-22]。肌肉组织是维持生命活动的重要器官之一，其中脂质沉积过多会引发胰岛素抵抗和肌肉萎缩等多种代谢疾病。已有的研究表明，甜菜碱可以改善高脂饮食诱导的体重增加、胰岛素抵抗，并增强脂质和能量代谢[16]，但甜菜碱如何对肌肉组织中脂质沉积产生作用尚不明确。因此本研究初步探究了甜菜碱对ob/ob小鼠肌肉中脂质沉积的影响，以期为开发预防或治疗肥胖及肥胖代谢综合征的药物提供参考。
本研究发现，ob/ob小鼠经饮水补饲1%甜菜碱后体重增加量显著减少(图 1)，这与之前研究甜菜碱可以改善体重过度增加是类似的[16]。脂肪组织储备能量的能力有限，ob/ob小鼠因遗传缺陷导致代谢减弱、脂质积累过度增加，脂肪异位储存是必然现象，且主要集中在肌肉和肝中[23-24]。本研究对肌肉组织进行油红O染色(图 2A)，发现试验组肌肉组织中油红着色的面积相对减少，且红色变浅，即脂质沉积量减少。而脂肪是由甘油和脂肪酸组成的甘油三酯，于是对甘油三酯含量进行量化(图 2B)，发现试验组肌肉组织中甘油三酯含量显著降低(P＜0.05)。为探究基因表达对甘油三酯含量的影响，本研究使用qRT-PCR检测了ATGL和HSL两个水解甘油三酯基因的表达情况[25-26]，结果显示，二者表达量均极显著升高(图 2C、2D，P＜0.01)。图 2表明，补饲甜菜碱会显著增加ob/ob小鼠肌肉组织中水解甘油三酯酶基因的表达，从而显著减少肌肉组织中甘油三酯的含量，进而减少脂质沉积。除此之外，肌肉组织中脂肪储存过多还会诱发胰岛素抵抗[11]，从而影响血液中循环的葡萄糖含量。通过图 3A、3B可以发现，在饥饿12 h后，与对照组相比试验组血液游离葡萄糖含量显著降低(P＜0.05)，并且GLUT4基因表达量极显著升高(P＜0.01)。GLUT4是一种主要分布在肌肉组织及脂肪组织细胞内，起转运葡萄糖作用的蛋白质[27]。已有研究表明，GLUT4基因的高表达可以改善db/db小鼠糖尿病血糖[28]，另外破坏肌肉组织中的GLUT4基因会导致严重的胰岛素抵抗和葡萄糖耐量减退[29]。图 3表明，补饲甜菜碱后肌肉组织脂质沉积减少导致胰岛素抵抗减弱。
脂肪的结构与功能主要受脂肪酸的影响[30]。肌肉组织中的脂肪酸主要来自血浆的转运和乳糜微粒的水解[31]。为探究脂肪酸对肌肉组织脂质沉积的影响，本研究对肌肉组织脂肪酸的组成及含量进行分析，发现试验组各类脂肪酸的含量相较于对照组均有不同程度的升高(图 4)。已有研究表明，补充甜菜碱可以显著增加育肥猪肌肉中的游离脂肪酸含量[32]，并且育肥猪肌肉组织能通过吸收游离脂肪酸轻微增加饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的含量[33]，这与本研究结果类似。葵酸(C10:0)根据不同的分类方法可归类为中链脂肪酸或饱和脂肪酸。在C57BL/6小鼠高脂日粮中添加2%的葵酸，8周后小鼠体重增加量显著降低，同时脂肪细胞体积明显减小，血清总胆固醇和甘油三酯含量显著降低，脂肪组织HSL基因表达水平显著升高、肝组织FAS基因表达水平显著降低[34]。亚麻酸(C18:3)作为长链多不饱和脂肪酸的代表，在日粮中添加亚麻酸会极显著降低肉兔血清中甘油三酯、总胆固醇以及极低密度脂蛋白的含量，同时极显著提高n-3 PUFA的含量[35]。PUFA能通过改变脂肪细胞增殖、分化、代谢相关基因的表达量来调控脂质代谢[36-38]。辛酸(C8:0)作为单体脂肪酸可调节心的能量代谢，对心血管疾病的防治有益[39]。本研究中，葵酸、辛酸、亚麻酸等脂肪酸比例均显著升高。结合上述各类脂肪酸的结果分析发现，甜菜碱可能通过改变肌肉组织中脂肪酸含量来调控脂质沉积并对机体产生有益作用。
在脂肪酸代谢过程中，许多基因扮演着重要角色(如FAS、PPARα、ACOX2、CD36等)，它们可以通过调节脂肪酸合成、β氧化过程来影响脂质沉积[40-43]。为进一步揭示补饲甜菜碱后肌肉组织脂质沉积与脂肪酸代谢的关系，本研究使用qRT-PCR检测了肌肉组织脂肪酸合成和β氧化基因的表达。结果显示，试验组ob/ob小鼠肌肉组织FAS基因表达量显著降低(图 5，P＜0.05)。除FAS调控脂肪酸合成外，ACS也是控制脂肪酸合成的主要基因之一，它能直接将乙酸转化为乙酰辅酶A供给从头合成脂肪酸[44]。本研究中，ACS基因表达量在两组之间并没有显著性差异(图 5，P＞0.05)，表明甜菜碱可能并不会直接影响ACS基因的表达。另外PPARα基因表达能抑制FAS基因表达，并且PPARα基因表达量可被PUFA增强[40]。本研究中，PUFA含量显著增加，PPARα基因表达量极显著升高(图 5，P＜0.01)，从而导致脂肪酸合成被抑制。CD36是脂肪酸转运蛋白，具有转运脂肪酸的作用，同时它还参与脂肪酸代谢[45]。已有研究表明，CD36基因的肌肉特异性表达会增加肌肉细胞对于脂肪酸的摄取并增强脂肪酸氧化[46]。本研究中，试验组肌肉组织CD36基因表达量极显著升高(图 5，P＜0.01)，这也合理的解释了肌肉组织脂肪酸含量的升高。ACADL基因编码脂肪酸β氧化过程的起始催化酶，其产物长链酰基辅酶A脱氢酶对于C6-C26的脂肪酸均具有催化活性[47]。已有研究表明，ACADL基因可在mRNA水平调控长链脂肪酸的代谢过程[48]。ACOX2是酰基辅酶A氧化酶(acyl-CoA oxidase, ACOX)家族的一员，该家族成员均参与脂肪酸代谢调控。其中，ACOX2负责支链脂肪酸的降解[49]。本研究中，qRT-PCR结果发现，试验组ob/ob小鼠肌肉组织中二者表达量均极显著高于对照组(图 5，P＜0.01)，表明甜菜碱可通过加速脂肪酸氧化分解减少ob/ob小鼠肌肉组织中的脂质沉积。
4 结论综上所述，ob/ob小鼠经饮水补饲1%甜菜碱后，肌肉组织脂肪酸合成基因表达降低，脂肪酸氧化基因表达升高，同时肌肉组织脂肪酸含量发生改变，最终导致肌肉组织脂质减少，说明甜菜碱可以改善由遗传缺陷带来的肌肉组织脂质沉积。
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