2. 山西省农业科学院畜牧兽医研究所, 太原 030032;
3. 山西省畜禽繁育工作站, 太原 030001
2. Institute of Animal Husbandry and Veterinary, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030032, China;
3. Livestock Breeding Station of Shanxi Province, Taiyuan 030001, China
绵羊是最早被驯化的家畜之一，可为人类提供羊肉和皮毛，具有重要经济价值，但由于绵羊为季节性发情动物，且多数品种在每个发情周期中只有一个卵泡发育成熟并最终排卵，导致其繁殖率较低。
在卵泡发育过程中，颗粒细胞的生长、增殖、分化是由激素类物质如卵泡刺激素(FSH)、黄体生成激素(LH)以及旁分泌和自分泌因子直接或间接调节[1-3]。WNTs作为一类分泌型糖蛋白信号家族，可通过WNT信号通路，调控多种细胞的增殖、分化以及凋亡等生物发育过程[4-6]。迄今为止，在哺乳动物中共发现19种WNT蛋白[7]。在经典WNT信号通路中(WNT/CTNNB1信号通路)，WNT蛋白与膜上G蛋白耦合受体结合，使细胞质中CTNNB1积累并转移到细胞核与多种转录因子TCF/LEF结合，通过募集或替换一系列协同作用因子，调控下游基因转录[8-10]。最初研究发现，WNT2在多种癌症组织中表达量较高[11-13]，提示其可能与细胞增殖相关。随后对小鼠的研究表明，WNT2可通过WNT/CTNNB1信号通路促进卵泡颗粒细胞增殖[14]。赵妙妙等[15]证实，经典WNT信号通路可促进绵羊卵泡颗粒细胞增殖。近年来对绵羊卵泡发育过程已有较多研究，但关于WNT2在绵羊卵泡发育中的作用机制尚未见报道。
本研究以绵羊卵泡为材料，对WNT2蛋白在绵羊卵泡中的表达进行定位分析，通过检测不同大小卵泡颗粒细胞中Wnt2 mRNA及蛋白的表达差异，探索其在不同发育阶段颗粒细胞中的作用。同时在卵泡颗粒细胞水平上沉默Wnt2基因，探究Wnt2基因沉默对颗粒细胞中Wnt2和CTNNB1基因表达和细胞凋亡的影响。研究结果可为进一步探讨WNT2在绵羊卵泡中的生物学功能及作用机制奠定理论基础。
1 材料与方法 1.1 组织材料在屠宰场挑选4~6月龄健康母羊20只，宰杀后采集双侧卵巢，剪去多余组织，放入低温灭菌DPBS缓冲液中。
1.2 主要试剂兔多克隆抗体WNT2一抗购自博奥森公司，生物素标记羊抗兔二抗、SP Rabbit HRP Kit(DAB)购自康为世纪公司，RNAiso Plus、RT reagent Kit With gDNA Eraser、SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ均购自TaKaRa公司，SDS-PAGE Gel Kit购自Solarbio公司，胎牛血清FBS购自CellMax公司，DMEM/F12基础培养液购自HyClone公司，Lipofectamine® 3000购自Invitrogen公司，一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自KeyGEN BioTECH公司。
1.3 试验方法 1.3.1 免疫组化检测WNT2蛋白在绵羊卵泡中的表达定位将采集的卵巢剪成长宽高均为0.5 cm的组织块，放入多聚甲醛中固定，依次进行脱水、透明、石蜡包埋，制成6 μm的切片。免疫组化染色参照SP Rabbit HRP Kit(DAB)试剂盒步骤，试验组滴加兔多克隆抗体WNT2一抗(稀释比例为1:200)，对照组滴加同等体积的PBS缓冲液，荧光显微镜下观察并拍照。
1.3.2 qRT-PCR检测Wnt2 mRNA在绵羊不同大小卵泡颗粒细胞中的表达根据GenBank提供的绵羊Wnt2基因mRNA序列，用Primer Premier5.0和Oligo6软件在线设计跨内含子的引物，以β-actin作为内参基因。引物由上海生物工程有限公司合成。引物信息如表 1所示。
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表 1 荧光定量PCR所用引物 Table 1 Primers for qRT-PCR |
将采集的卵巢用灭菌的PBS冲洗干净，剥离卵泡，根据卵泡直径将其分成3组[16]：大卵泡(直径≥ 5 mm)、中卵泡(3 mm < 直径 < 5 mm)、小卵泡(直径≤3 mm)，分别放入加有DPBS缓冲液的表面皿中，逐一从中间剪开，刮取颗粒细胞并收集。采用Trizol法提取总RNA，测定浓度、纯度及完整性后，将总RNA的浓度调整为5 μL总体积含1 μg RNA。按照PrimeScriptTM RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒说明书合成cDNA。
每个样本Wnt2和β-actin基因重复3次，根据SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒的操作说明建立qRT-PCR反应体系。反应最佳条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性3 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40个循环；熔解曲线阶段95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。
1.3.3 Western blot检测WNT2蛋白在绵羊不同大小卵泡颗粒细胞中的表达收集不同大小卵泡中的颗粒细胞(方法同1.3.2)，提取总蛋白。每个样本WNT2和β-actin蛋白重复3次，将蛋白样本与蛋白上样缓冲液(5×)按4:1混合，放入95 ℃水浴锅中使蛋白充分变性。通过SDS-PAGE电泳分离蛋白质，将凝胶中的目的蛋白转到NC膜上，用5%蛋白封闭液将膜封闭90 min。用TBST缓冲液稀释一抗WNT2兔多克隆抗体(稀释比例1:250)及β-actin兔多克隆抗体(稀释比例1:2 000)，4 ℃过夜孵育。用TBST缓冲液稀释二抗山羊抗兔IgG(稀释比例1:3 000)，室温孵育90 min。将发光液均匀涂抹在NC膜上，放入凝胶成像系统拍照并分析。
1.3.4 绵羊颗粒细胞的收集和培养将采集的卵巢用灭菌的PBS冲洗干净，剪取3 mm < 直径 < 5 mm的卵泡放入盛有DMEM/F12培养液的表面皿中，逐一从中间剪开并刮取颗粒细胞，收集培养液于无菌EP管，1 500 r·min-1离心5 min，弃上清，向离心管内加入DMEM/F12培养液轻微震荡重新悬浮细胞，将悬浮的细胞接种到DMEM/F12完全培养液中(含10%胎牛血清)，完全培养液的配方参照毕锡麟等[17]的方法，在培养箱中培养(温度设置为37 ℃，CO2浓度为5%)，待颗粒细胞长到90%以上，进行颗粒细胞传代与冻存。
1.3.5 siRNA转染绵羊颗粒细胞用于基因沉默试验的Wnt2 siRNA及无义序列siRNA(NC)均由上海生物工程有限公司设计及合成，序列信息见表 2。
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表 2 siRNA和NC序列 Table 2 Sequences of siRNA and NC |
将2代颗粒细胞接种于24孔板中，12 h内待细胞融合度达到50%以上即可进行转染试验。试验组(Wnt2干扰组，Wnt2 siRNA组)加入Wnt2 siRNA与脂质体混合物，阴性对照组加入无义序列siRNA(无义序列组，NC组)与脂质体混合物，空白对照组仅加入脂质体。转染步骤参照Lipofectamine® 3000的说明，Lipofectamine® 3000的最佳稀释比例是：25 μL DMEM/F12培养液和1.5 μL Lipofectamine® 3000。siRNA最佳稀释比例是：25 μL DMEM/F12培养液和1 μg siRNA(Wnt2 siRNA或NC)，培养液为不含血清的DMEM/F12培养液，6 h后观察转染效率并换成含血清的DMEM/F12完全培养液。
1.3.6 qRT-PCR检测Wnt2和CTNNB1 mRNA在siRNA转染后绵羊颗粒细胞的表达基因沉默48 h后用移液枪吸取并弃掉细胞培养液，PBS清洗，加入胰酶消化细胞，待完全消化后立刻加入1 mL DMEM/F12完全培养液终止消化。将获得的颗粒细胞悬液收集到无菌离心管内用于总RNA的提取和cDNA的合成(方法同1.3.2)，引物信息见表 1。
1.3.7 siRNA转染后绵羊颗粒细胞凋亡检测细胞凋亡检测试验分为干扰Wnt2组、NC组、空白对照组、阴性对照组、阳性对照组，每组重复3次。基因沉默72 h后按照一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书操作进行细胞凋亡检测，然后通过荧光显微镜检测并拍照，用软件ImageJ对细胞计数。
1.4 数据处理qRT-PCR结果采用ΔΔCT的计算方法，将各个目的基因与内参基因的CT值按照2-ΔΔCT算法，得出相对表达量；Western blot结果用Gel-Pro Analyzer软件分析目的蛋白的相对表达量，用目的蛋白灰度值/内参灰度值表示，得出相对表达量。利用SPSS18.0软件对数据进行分析，采用单因素方差分析和显著性检验的方法，所有数据均以“平均数±标准误(Mean±SEM)”表示。
2 结果 2.1 WNT2蛋白在绵羊卵泡中的表达定位如图 1所示，在试验组中，颗粒细胞、内膜细胞以及卵丘细胞均有明显着色，而在对照组中无着色。表明WNT2蛋白在绵羊卵泡的颗粒细胞、内膜细胞以及卵丘细胞均有表达。
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A、B.对照组；a、b.试验组。GC.颗粒细胞；TC.内膜细胞；CC.卵丘细胞 A, B. Control groups; a, b. Experimental groups. GC. Granulosa cells; TC. Theca cells; CC. Cumulus cells 图 1 绵羊卵泡中WNT2蛋白的定位(免疫组化，400×) Fig. 1 Localization of WNT2 protein in the ovine follicles (immunohistochemistry, 400×) |
经1%的琼脂糖凝胶电泳后，可清晰看出总RNA的3条带(图 2)，即5S(120 bp)、18S(1 900 bp)和28S(4 700 bp)，说明所提取的总RNA具较好的完整性，可进行后续试验。
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图 2 总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图 Fig. 2 Electrophoresis pattern of total RNA |
qRT-PCR结果表明，绵羊不同大小卵泡中颗粒细胞的Wnt2 mRNA表达量存在差异，且Wnt2在大卵泡颗粒细胞的表达量显著高于中、小卵泡颗粒细胞(P < 0.05)，在中卵泡颗粒细胞中的表达量显著高于小卵泡颗粒细胞(P < 0.05，图 3)。
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不同字母表示差异显著(P < 0.05)，下同 The different letters indicate the significant difference(P < 0.05), the same as below 图 3 不同大小卵泡颗粒细胞中Wnt2 mRNA的相对表达量 Fig. 3 Relative expression of Wnt2 mRNA in the follicle granulosa cells with different sizes |
Western blot结果显示，WNT2蛋白在大卵泡颗粒细胞的表达量显著高于中、小卵泡颗粒细胞(P < 0.05)，在中卵泡颗粒细胞中的表达量显著高于小卵泡颗粒细胞(P < 0.05，图 4)。
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图 4 不同大小卵泡颗粒细胞中WNT2蛋白的相对表达量 Fig. 4 Relative expression of WNT2 protein in the follicle granulosa cells with different sizes |
用于基因沉默试验的Wnt2 siRNA及无义序列siRNA(NC)是带有绿色荧光(FAM)的siRNA，故在显微镜下可以看到转染成功的颗粒细胞为绿色(图 5中的亮点)。
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A. Wnt2干扰RNA组；B.无义序列组；C.空白对照组 A. Wnt2 siRNA; B. NC siRNA; C. Blank 图 5 绵羊卵泡颗粒细胞转染效果(100×) Fig. 5 The transfection result of ovine follicular granulosa cells (100×) |
对体外培养的绵羊卵泡颗粒细胞转染48 h后回收细胞，利用qRT-PCR检测基因沉默后Wnt2 siRNA、Negative siRNA(NC)及空白对照组(Blank)中Wnt2、CTNNB1 mRNA相对表达差异，结果如图 6所示，Wnt2 siRNA组Wnt2、CTNNB1的表达量显著低于Negative siRNA(NC)组和空白对照组(P < 0.05)，但后两组之间的Wnt2、CTNNB1基因表达量无显著差异(P>0.05)，表现为空白对照组基因表达略高于Negative siRNA(NC)组。
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图 6 转染Wnt2 siRNA后绵羊颗粒细胞中Wnt2和CTNNB1 mRNA的相对表达量 Fig. 6 Relative expression of Wnt2 and CTNNB1 mRNA in ovine granulosa cells after transfection of Wnt2 siRNA |
本试验对转染72 h的Wnt2 siRNA、Negative siRNA(NC)及空白对照组颗粒细胞进行凋亡检测，并设置阳性对照和阴性对照(图 7)，细胞凋亡率的结果如图 8所示, Wnt2 siRNA组细胞凋亡率显著高于Negative siRNA(NC)及空白对照组(P < 0.05)，但Negative siRNA(NC)及空白对照组间无显著差异(P>0.05)，总体凋亡细胞很少。
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A. Wnt2干扰RNA组；B.无义序列组；C.空白对照组；D.阴性对照组；E.阳性对照组 A. Wnt2 siRNA; B. Negative siRNA; C. Blank control; D. Negative control; E. Positive control 图 7 羊颗粒细胞凋亡检测(400×) Fig. 7 Apoptosis detection of ovine granulosa cells (400×) |
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图 8 羊颗粒细胞凋亡百分率 Fig. 8 Percentage of apoptotic granulosa cells of ovine |
WNTs是一类信号分子，可有效调控雌性动物的生殖系统发育[18-20]，而WNT2作为WNTs蛋白家族的重要成员，已有研究证实其在不同发育阶段的颗粒细胞、卵丘细胞均有表达[21-22]，提示WNT2对卵巢发育过程有着积极的调节作用。本研究发现，WNT2蛋白在绵羊卵泡的内膜细胞、颗粒细胞以及卵丘细胞均有表达，这与Wang等[14]在小鼠中的研究结果一致，说明WNT2也在绵羊卵泡发育过程中扮演着重要角色。
绵羊卵泡特定的直径大小与其发育时期相关。即直径为3 mm以下的卵泡为募集期卵泡，直径3~5 mm的卵泡是选择期卵泡，也认为是卵泡继续发育成优势卵泡或走向闭锁的关键阶段，直径5 mm以上的大卵泡为优势和排卵期卵泡[16]。为探究WNT2在卵泡发育过程中的作用，本试验进一步研究了WNT2在不同发育阶段绵羊卵泡颗粒细胞中的表达模式，结果表明，Wnt2 mRNA及蛋白在不同大小卵泡颗粒细胞中均有表达且差异显著，并随卵泡直径的增大表达量呈上升趋势，推测从卵泡的募集期直至优势排卵期的整个过程中，WNT2均可促进颗粒细胞的增殖，以推动卵泡发育。
前期研究表明，WNT2可基于WNT信号通路发挥调控作用，其中WNT2/CTNNB1信号通路已证实对人、大鼠、小鼠及牛卵巢颗粒细胞的增殖具有促进作用[23-26]。而CTNNB1作为该通路中最为关键的信号转导因子，当胞外没有WNT2时，CTNNB1会被由腺瘤息肉蛋白(APC)、AXIN蛋白、酪蛋白激酶(CK1)及GSK-3β蛋白形成的复合物磷酸化，随后被β-TrCP识别并泛素化，从而导致细胞质中有少量或者几乎没有游离CTNNB1。当胞外有WNT2时，复合物中的CTNNB1去磷酸化，使CTNNB1在胞内增加，并转移到细胞核，与多种转录子结合，调控下游基因转录[27-28]。本研究对Wnt2基因沉默后颗粒细胞中Wnt2、CTNNB1的表达量进行检测，结果表明，CTNNB1与Wnt2 mRNA的表达量均显著降低，提示Wnt2基因的表达水平可对CTNNB1产生一定影响。基因沉默后的细胞凋亡检测结果显示，沉默组的细胞凋亡率显著高于对照组，但总体凋亡细胞很少。有研究发现，干扰Wnt2基因可诱发恶性黑色素瘤和结直肠癌细胞凋亡[29-30]，但在小鼠颗粒细胞中，干扰Wnt2基因破坏了其G1期向S期的进展[31]，抑制颗粒细胞增殖，而在本研究中，干扰Wnt2基因引起细胞凋亡是何种机制有待进一步研究。
4 结论WNT2蛋白在绵羊卵泡内膜细胞、颗粒细胞以及卵丘细胞内均有表达；WNT2是通过经典WNT信号通路对绵羊卵泡颗粒细胞生物学功能具有促进作用。
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