2. 宁夏回族自治区中卫山羊保种场, 宁夏 755000;
3. 黑龙江省农业科学院畜牧研究所, 哈尔滨 150086
2. Ningxia Hui Autonomous Region Zhongwei Goat Farm, Ningxia 755000, China;
3. Institute of Animal Science, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086, China
羊毛是具有天然卷曲的动物纤维，其弯曲度是评价羊毛品质和工艺价值的重要依据。在自然状态下，羊毛纤维沿着它的纵轴方向有规则的卷曲，通常称为羊毛弯曲。毛发开始发生弯曲后，从皮肤毛囊生长，形成波浪形弯曲和环状螺旋，从而形成羊毛弯曲的表型(图 1)。羊毛天然卷曲的纤维决定着羊毛与其他纤维的区别。这种特殊的纤维影响着羊毛的工艺价值和羊毛产量，而且卷曲度也是评判不同绵羊品种和个体之间毛品质等级的重要标准，并可作为对品种选育的依据之一。羊毛的弯曲度是羊毛加工和制造工业非常关注的羊毛品质特性之一。因此，阐明毛纤维弯曲性状产生机制以及挖掘影响该性状的基因、调控通路、蛋白等，对于加快优异羊种资源保护利用，加快具有优质毛纤维品质羊的育种具有重要的科学意义和经济价值。
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A.中卫山羊羊毛弯曲表型；B. A中F区放大8倍，弯曲的羊毛纤维 A. Curved phenotype of Zhongwei goat wool; B. F in the A area is 8 times larger, curved wool fiber 图 1 中卫山羊羊毛形态 Fig. 1 The appearance of Zhongwei goat wool |
羊毛纤维的基本结构是毛发形态根本的表现形式。毛囊是一种特定的皮肤附属器官，具有周期性生长的能力，是组织再生研究的有效模型。毛发的形状、类型和颜色等性状不仅在胚胎发生期间确定，而且在每个毛发生长周期中重复确定。Wnt/β-catenin、TGF-β/ BMP、FGF、JAK-STAT、Notch等信号通路构成复杂的网络结构来控制毛囊的形成及毛囊周期性发育，从而产生毛发弯曲表型。差异基因的出现使得羊毛弯曲分子机制模型更加充实，然而基因本身不能直接行使功能，其功能的发挥需要通过蛋白质表达。因此, 从蛋白定性、定量到蛋白修饰等，蛋白质组学的深入研究一步一步地揭示了毛发弯曲现象的本质。本文通过对羊毛纤维的形态结构以及与羊毛弯曲和毛囊发育相关的基因、重要调控信号通路以及蛋白的研究进展的总结，为以后毛发弯曲及毛囊发育的相关分子机制的研究提供参考，也为改良羊毛弯曲性状的工作提供理论依据。
1 羊毛纤维的形态特征羊毛的弯曲具有复杂的调控机制和结构现象，这些现象包括简单的单一弯曲以及较复杂的螺旋扭曲(图 2)。羊毛弯曲分大、中、小3种类型，以羊毛长度每1 cm内的弯曲数来判断，大弯曲是指每1 cm毛纤维包含3个以下弯曲；中弯曲是指每1 cm毛纤维包含4~5个弯曲；小弯曲是指每1 cm毛纤维包含6个弯曲以上。羊毛纤维的结构特点对毛发弯曲性状的产生有很大影响。哺乳动物的毛发纤维在结构上可分为以下主要成分：角质层、皮质层，部分还有髓质层。皮质层约占86%~90%，由轴向排列的梭形细胞组成，在羊毛中分为正皮质层、中皮层和副皮质层。皮质层是决定羊毛纤维物理、化学以及机械性能的部分，是影响羊毛弯曲性状的重要因素。与羊毛曲率有关的理论主要有两个假说：其一，曲率的产生是因为在纤维最接近弯曲的一侧或凸边上存在较多的细胞而导致纤维产生弯曲；其二，纤维曲率与正皮层细胞和副皮质细胞的比例相关，多为检测平均单纤维曲率下的平均细胞类型分布。尽管这两种理论都没有完全解释卷曲，但细胞类型起着关键作用。
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A.螺旋扭曲；B.波浪形弯曲；C.复合型卷曲 A. Spiral twist; B. Wavy bend; C. Composite curl 图 2 羊毛弯曲的形态 Fig. 2 The shape of the curve wool |
在对大鼠锯齿形毛纤维结构的研究中发现，弯曲的毛纤维各个毛囊横截面中正皮质独立收缩，而在弯曲凸面处发现的副皮质没有变化(图 3)[1]。与羊毛纤维相比，大鼠正、副皮质弯曲之间的中间区域没有区别，而内根鞘层扩大以保持毛囊均匀整体横截面。内根鞘在羊毛的弯曲形成中具有重要的作用，内根鞘细胞的增长使得轴角质层围绕皮层自转，从而将皮质移位到毛发的一侧。这种位移和细胞层的齿轮作用最终切断了皮质周围的内根鞘细胞和角质层的流动。Harland等[2]提出了细胞类型分布模型，即由皮层和皮质细胞长度的差异引起的内在纤维曲率模型：每种细胞类型的绝对长度因位置而异，但两种细胞类型的相对长度差异支撑着曲率是动态的，因为细胞长度在纤维之间变化并且可能还沿着纤维伸展的方向变化。这种曲率有助于纤维的整体3D形状，形成了弯曲和扭转，该发现普遍适用于哺乳动物角蛋白毛发。Plowman等[3]发现，派伦代尔羊(Perenedale sheep)的突变型直毛纤维具有正常的角质层且与野生型弯曲状羊毛具有相同的皮质蛋白和超微结构，不同的是派伦代尔羊弯曲的野生型羊毛纤维具有双侧排列的正皮质和副皮质；英国莱斯特绵羊弯曲羊毛纤维在正皮质上具有副皮质的散布，但是突变的直毛纤维通常具有围绕副皮质核心的完整或部分正皮质环，并且有时具有中心正皮质。该发现说明，具有相似纤维形态的直毛突变可以具有不同的基质结构和蛋白质组学特征，通过控制内部纤维结构可以对毛发曲率的发生有多种解释，并且其变化可能会对机械表型产生不同的影响。一般来说，在品种之间和品种内，随着直径的增加，正皮层细胞的比例相对于中皮层和副皮质层细胞的比例增加，通常是由中皮层部分替代副皮质层，特别是在低卷曲纤维中[4]。最新研究认为，中皮层不是作为细胞类型，而是局部包裹模式覆盖在正、副皮质层细胞表面，从而影响纤维曲率[3]。毛纤维蛋白质和其微观结构水平与单纤维曲率联合分析目前还没有深入的研究报道，毛囊纤维不对称性的成因也需要进一步研究。
2 毛囊发育相关因子及信号通路与毛发弯曲
毛囊是调控毛发生长的皮肤附属器官，对于毛发弯曲形状的形成具有重要作用。毛囊是一种特定的微型器官，具有周期性生长的能力，是组织再生研究的有效模型。通常，出生后的毛囊发育分为3个阶段：生长期(anagen)、退行期(catagen)、终止期(telogen)[5-6]。毛发的形状、类型和颜色等性状不仅在胚胎发生期间确定，而且在每个毛发生长周期中重复确定。Wnt/β-catenin、Tgf-β/BMP、成纤维细胞生长因子(FGF)、JAK-STAT、Notch等信号通路构成复杂的网络结构控制毛囊的形成及毛囊周期性发育，从而产生毛发弯曲表型。
Wnt配体蛋白是脂质修饰的细胞外糖蛋白，可以在无蛋白的激活中分泌[7]。Wnt信号传导途径是由配体蛋白质Wnt和膜蛋白受体结合激发的一组多下游通道的信号转导途径。经此途径，通过细胞表面受体在细胞内的活化过程将细胞外的信号传递到细胞内。β-catenin是上皮细胞之间的重要黏附分子，是诱导毛囊基板和成年动物毛囊角质形成细胞产生所必需的[8]。胚胎发育期的β-catenin突变将导致毛囊基质形成受阻。在不存在β-catenin的情况下，干细胞不能分化成毛囊角质形成细胞[9]。β-catenin通常通过激活Wnt途径的下游基因和增强角蛋白基因及相关蛋白基因的表达而在羊的毛囊发育中起重要作用[10]。据Lim等[11]报道，抑制Wnt/ β-catenin通路的分泌性卷曲相关蛋白-1(sFRP1)水平在外根鞘细胞的退行期阶段上调。除了Wnt/β-catenin之外，Wnt信号通路中Wnt/Ca2+、Wnt/PCP(planar cell polarity)等被发现与毛发弯曲性状相关。桥粒细胞需要Ca2+来维持细胞-细胞黏附[12]，Wnt/Ca2+途径起到调节细胞内Ca2+浓度作用于随后的细胞生长和分化，诱导氧环结合酶(Cox2)、连接蛋白43(Cx43)和前列腺素受体-2(EP-2)表达，并通过影响毛发弯曲的EDA/EDAR进一步调节下游信号通路[13-14]。PCP参与上皮细胞集体迁移，趋同延伸和小管的形成[15]。这需要外部细胞的自主调节，以及在平面轴上产生不对称细胞分裂，从而形成毛发的弯曲。
TGF-β是神经/间充质干细胞的维持和增殖因子[16]，属于TGF超家族的BMP，可通过与细胞膜上的跨膜受体(骨形态发生蛋白受体)结合而实现信号转导。BMP家族成员主要在毛囊形态发生中起抑制作用[17]。Noggin是BMP信号传导的重要组成部分，对毛囊的生长发育同样重要[18]。在牦牛中，BMP2和BMPR-IA在休止期的低表达支持了BMP2和BMPR-IA对牦牛毛囊细胞生长的抑制作用，而生长发育初期Noggin表达的增加表明其促进了毛囊细胞生长，而这3种蛋白质通过影响皮肤上皮细胞活性而起作用[19]。BMP6和Wnt10b分别是主要的抑制剂和激活剂，它们的平衡调节毛囊的毛发生长终期转变[20]。BMP信号通路的激活上调卵巢癌免疫反应抗原结合域2(OCIAD2)表达，并刺激次级毛囊控制细胞增殖。核心蛋白聚糖(DCN)基因通过促进TGF-β和BMP信号传导途径影响毛囊形态发生和周期性变化。OCIAD2和DCN基因对TGF-β信号传导途径具有相反的作用，并且相互抑制以影响毛发生长[21]。TGFβ-mTOR通路交叉通过mTOR激活SMAD发生，解释了结缔组织肿瘤经常出现在具有上皮-mTOR功能障碍的毛囊周围[22]。一些药物治疗中描述了可逆的毛发形式改变，与mTOR途径部分相关。如Bessis等[23]研究干扰素α(IFNα) /利巴韦林联合治疗在慢性乙型肝炎中引起的头发拉直。
FGF主要参与血管生成、胚胎发育、细胞生长和组织修复的调节。FGF是作为Wnt、BMP和Hedgehog家族等分泌性信号分子的分泌性拮抗剂，通过信号和拮抗剂的双调节作用精细而准确地控制各自的信号系统，从而对毛发形态发生和毛发生长周期进行调节。Li等[24]利用CRISPR-Cas9技术在细羊毛中成功地产生了一组功能丧失的成纤维细胞生长因子5(FGF5)修饰，观察到细长的羊毛短纤维长度变长和羊毛油脂重量增加，该研究结果强调通过基因靶向阻断FGF5活性可以促进羊毛生长并导致羊毛纤维长度和油脂羊毛产量的增加。绒山羊皮肤毛囊特别是次级毛囊具有自我更新和周期性生长的特点，整个过程是多基因参与、紧密联系且相互制约的复杂生理生化过程，受多种因子调控。毛囊的周期性再生及相关分子调节控制着绒毛的生长发育，直接决定着产绒量及绒毛品质。蛋白酶体成熟蛋白(POMP)在毛囊内根鞘中强烈表达，与初级和次级毛囊的发育有关；此外，通过添加FGF5/IGF-1或干扰Noggin表达来调节POMP的表达，从而控制辽宁绒山羊绒的生长[25]。通过CRISPR / Cas9技术产生的3个FGF5基因编辑绵羊的毛发长度和平均生长速率显著增加，这与在其他物种上的研究结果相似[26]。FGF5中的FGF超家族结构域中的1 bp缺失导致叙利亚仓鼠中的雄性显性长毛[27]。旱莲草(EP)降低了C57/BL6小鼠中FGF5的水平，增加了成纤维细胞生长因子7(FGF7)的表达，激活了毛乳头细胞中的mTOR信号传导，表明EP具有增强毛囊生长的作用，通过调节FGF7和FGF5促进毛发生长[28]。在毛囊周期中，FGF10和sFRP1之间的平衡会影响毛发从生长初期到生长中期的转变，FGF10促进了毛囊的循环，同时被sFRP1阻断，两种因素之间的相互作用通过竞争性调节β-catenin信号控制毛囊的发育[29]。吴晋强等[30]发现，FGF21对参与毛囊形成的成纤维细胞的增殖和分化具有重要作用，诱导毛囊由生长期进入退化期；FGFR1对内外根鞘细胞的增殖、分化有着明显作用，诱导毛囊由退化期进入静止期。
3 毛发弯曲相关蛋白和基因羊毛弯曲在科学研究和生产实践中一直是人们关注的热点，关于羊毛弯曲形成的相关蛋白及基因的研究报道日益增加。并且以模式动物小鼠为重点的哺乳动物毛发弯曲分子机制的研究也为探索羊毛弯曲形成的分子机理奠定了基础。
绵羊和山羊毛发纤维中新发现的许多蛋白质属于角蛋白或角蛋白相关蛋白，毛发纤维的主要结构成分在羊毛的角蛋白中间丝之间形成基质。已经在物种间鉴定了100多种角蛋白关联蛋白(KAP)，它们被分为27个KAP家族，在已被发现的这些KAP家族中：1~3、10~16和23~27是HS-KAP，4、5、9和17是UHS-KAPs，6~8和18~22是HGT-KAPs[31-32]。有研究报道，绵羊缺乏KRTAP25-1，但发现了KRTAP25-1染色体区域中的新HS-KAP(命名为KRTAP28-1)，发现该蛋白的变异与羊毛纤维直径相关，这些结果可用于开发影响羊毛纤维直径的基因标记[33]。通过单核苷酸多肽性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点的突变发现，KRTAP20-2在次级毛囊中表达，但在心、肝、肺、肾、脾或背最长肌中不表达，且在突变位点中A的存在与羊绒纤维重量的增加有关，而B的存在与羊绒纤维重量和卷曲纤维长度的减少有关。具有基因型AA的山羊比AB或BB型山羊具有更高的羊绒纤维重量和更高的卷曲纤维长度。这些结果表明，山羊KRTAP20-2变异可能具有改善羊绒纤维重量的遗传标记的价值[34]。绵羊KRTAP20-2中的无义突变也已被证明会影响羊毛纤维的曲率[35]。HGT-KAP类的蛋白广泛变异表明HGT-KAPs在羊毛纤维中可能具有重要作用，不同羊毛中HGT-KAP蛋白的比例含量均较高[36]。同样通过角蛋白SNP位点的突变，绵羊KRTAP22-1变异可改善羊毛曲率或羊毛产量[37]。而KRTAP26-1不同SNP位点的突变分析也说明其与羊毛产量和平均纤维长度的变化相关[38]。在KRTAP20-1中发现了与平均纤维直径、油脂羊毛重量和降低的羊毛产量有关的突变，这表明KRTAP20-1影响羊毛产量和平均纤维直径相关性状[39]。虽然山羊中只发现了少量KRTAPs，但据报道，两种KRTAPs(KRTAP13-1和KRTAP8-2)与羊绒质量和数量性状有关，包括纤维直径、重量和卷曲纤维长度[40-41]。通过对卷毛马使用全基因组关联研究(GWAS)和全基因组测序方法鉴定因果变异，结果鉴定出KRT25：p.R89H突变体作为形成卷曲性状的主要原因，但第2个主要位点也可能参与了北美卷毛马毛发形状的形成[42]。KRT71是一种成熟的卷发基因，2009年，Cadieu等[43]报道，狗皮毛变异的主要特征受3种基因变异的影响，在具有卷曲或波浪形皮毛的狗中发现了KRT71的错义突变(c.451C> T)p.Arg151Trp。抑制性消减杂交(SSH)是揭示不同发育阶段基因差异表达的有效方法，Kang等[44]利用这个方法确定了20个与卷曲羊毛性状相关的潜在基因，随后的功能分析进一步证实，KRT71是参与卷曲羊毛形成和发育调节的重要基因之一，KRT71 mRNA表达可能受骨髓蛋白锌指结构域1(MZF1)的调控，其调控机制可能有助于中国羔羊的卷曲羊毛表型形成，而KRT71基因的克隆和表达分析是揭示绵羊不同羊毛表型的分子基础的重要步骤，也可能增强对角蛋白基因与人类毛发相关生理疾病之间关系的认识。Liu等[45]选取比较不同组织和不同发育阶段中国滩羊成体之间KRT83的表达，结果表明，环化酶相关肌动蛋白细胞骨架调节蛋白1(CAP1)是参与滩羊皮KRT83表达负调控的关键转录因子，并进一步暗示了KRT83在绵羊卷曲羊毛中的关键作用。
Dickkopf-1(DKK1)是经典Wnt信号通路的抑制剂，可调节毛囊形态发生和循环。美利奴绵羊DKK1基因编码序列的克隆结果表明，其与羊毛产量、质量和均匀性等性状显著相关。DKK1基因内鉴定了11个单核苷酸多态性(SNP)，且全基因关联分析显示，其SNP位点9与羊毛卷曲率相关[46]。研究表明，桥粒芯蛋白4(DSG4)基因与羊毛长度和曲率有关[47]。有研究通过一组扩展的候选SNP预测因子，并使用一组独立的样本进行模型验证来评估基于DNA的头发形状预测的能力，开发了基于32个SNPs位点的直发与非直发预测的BLR模型，并且首次建立了基于33个SNPs位点的直线、波浪形与卷发的MLR模型[48]。对于人类头发形状，来自欧洲和其他地区的总共26 964名受试者的一系列GWAS分析和复制研究发现了12个基因位点，其中8个位点参与毛发弯曲调控机制[49]。毛透明蛋白(TCHH)与欧洲人的头发形态显著相关，且Wnt家庭成员10A(Wnt10A)和弗雷泽细胞外基质复合物亚基1(FRAS1)的关联性较弱。一项研究集中在位于这3个基因的6个SNPs，证实了rs11803731(TCHH)、rs7349332(Wnt10A)和rs1268789(FRAS1)SNP与毛发形态有关联[50]。测序分析鉴定了来自中国美利奴羊的5-甲基四氢叶酸-高半胱氨酸甲基转移酶(MTR)中总共13个SNPs，SNP4~11与纤维直径性状的CV显著相关(P<0.05)，SNP5~12与羊毛卷曲弱相关[51]。全基因组关联分析在毛发弯曲方向的研究大多集中在人和小鼠上，但这为羊毛弯曲机制的研究提供了新方向。
4 蛋白质组学调控毛囊发育的研究进展蛋白质组学是研究细胞、组织或生物体中蛋白质组成、定位、变化及其相互作用规律的科学，其研究的内容包括对蛋白质表达模式和蛋白质组功能模式的研究。基于质谱技术的比较蛋白质组学方法(如Label-free、iTRAQ、SWATH等)可以大规模发现特定条件下表达量显著变化的蛋白质，是近年来研究的热点。蛋白质组学、蛋白质翻译后修饰、蛋白质组学与其他组学联合分析等方法的使用为研究毛发弯曲和毛囊发育的相关机制提供了多个方向。
付雪峰等[52]建立了细毛羊皮肤毛囊的双向电泳差异蛋白谱图，并对相同年龄的超细型和细型毛羊的皮肤毛囊、超细型毛羊不同年龄段的皮肤毛囊进行了2-DE分析，发现了94种差异表达蛋白质，并对这些差异蛋白进行了生物信息学分析。刘玉芳等[53]对FGF21的研究发现，FGF21可能是对滩羊毛发卷曲度具有调控作用的候选基因之一。杨佐青[54]对滩羊1周岁内的4个生长阶段构建了2-DE蛋白谱图，通过两两之间比对分析发现了19个差异蛋白点，利用质谱鉴定出了其中15个蛋白点匹配13种蛋白；并且推测，角蛋白25、14-3-3蛋白б亚型、微管蛋白α、链膜联蛋白A2等可能与滩羊皮肤的生长调控有关，并且利用iTRAQ联用LC-MS/MS技术在滩羊、中卫山羊、内蒙古苏尼特羊和新吉细毛羊等4种羊的皮肤中总共鉴定到1 161个蛋白，其中与羊毛的粗细和弯曲度有关的蛋白为TCHH、KRTAP6、KRTAP11.1、KRT25、KRT34和KRT83；杨佐青[54]应用iTRAQ联合LC-MS/MS技术对多种花型滩羊的皮肤进行蛋白差异表达研究，共鉴定到2 886个总蛋白，从而筛选出了与花色相关的差异蛋白。于梦然[55]利用iTRAQ标记技术与LC-MS/MS的结合，对内蒙古绒山羊生长期和休止期毛的侧皮肤总蛋白进行了标记定量和蛋白鉴定。结果筛选得到了158个生长期和休止期差异表达的蛋白质，其中72个蛋白在生长期上调表达，86个下调表达，差异蛋白中包含了9种角蛋白，这一研究为筛选绒毛生长性状相关蛋白提供了数据基础，进一步完善了绒山羊的基础蛋白数据库。基于iTRAQ的蛋白质组学研究绵羊和山羊在不同纤维范围内的18个样本中蛋白质丰度的差异，鉴定发现具有不同丰度的蛋白质与纤维特征的变化相关，具有不同丰度的蛋白质主要是角蛋白或角蛋白相关蛋白(KRTAP11-1、KRT6A、KRT38)，或与毛发生长(DSC2、DSG3、EEF2、CALML5、TCHH、SELENBP1)和脂肪酸合成(FABP4、FABP5)有关的蛋白，利用RNA-seq进一步验证了DSC2是影响山羊毛直发表型的关键基因[56]。利用安捷伦绵羊基因表达微阵列和蛋白质组学技术研究敖汉细毛羊(中国本土品种)羊毛毛囊的毛纤维生长初期的体侧皮肤(更多的羊毛生长)与腹股沟皮肤(没有羊毛生长)的基因表达模式，推测一些潜在的基因家族可能参与毛发生长调节，包括FGF、WNTs、胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮生长因子等；此外，还发现了196个差异表达的蛋白质点，其中121个被鉴定为单个蛋白质点[57]。蛋白质组学分析鉴定出人和小鼠的胚胎期皮肤富含3种分泌蛋白，分别是apolipoprotein-A1、galectin-1和lumican，它们可以共同诱导新的毛囊，这3种蛋白质在周围胚胎真皮中显示出阶段特异性的共富集，3种蛋白质的组合将基因表达改变为诱导性毛囊真皮乳头成纤维细胞样特征，并激活了IGF和Wnt信号传导，这对于毛囊再生过程是至关重要的[58]。
5 总结与展望羊作为一种重要的农业经济动物，羊毛纤维的弯曲特性对羊毛产业的经济价值和市场需求具有很大影响。基于当前有关羊毛及其他动物毛发弯曲性状的研究表明，毛纤维弯曲性状的形成受许多因素协同作用，调控其生长发育的分子机制目前仍不明确。笔者就未来羊毛弯曲性状研究方向提出几点思路：1)羊毛纤维结构的调控主要在细胞层面上，各种毛囊细胞是产生羊毛弯曲性状的内在原因，因此毛囊干细胞的分化与否是改变毛发弯曲的重要因素。2)毛囊生长发育的信号通路影响着毛囊周期性变化，羊毛弯曲在周期性生长发育中不断重复，将与羊毛弯曲形状相关的毛囊细胞与这些细胞在毛囊周期性生长发育过程中的变化情况相关联，分析这些通路对毛发弯曲的影响。3)目前的研究主要停留在与羊毛弯曲性状相关的基因、分子标记及蛋白质的挖掘上，随着多组学技术的的发展以及CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用，未来可以在动物活体上验证这些影响毛发弯曲性状重要基因的调控功能并应用于生产实践。相信今后将会有更多影响羊毛弯曲和毛囊生长发育因子及调控机制被发现和阐明，可为动物绒毛产业和人类临床治疗提供帮助。
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