自2013年CRISPR/Cas9技术问世以来，基因编辑领域的研究呈现爆发式增长。相较于前两代基因编辑技术(ZFN、TALEN)，新一代CRISPR/Cas9原理简单，简便易用，且成本低，效率高，其在功能基因组学方面的应用越来越多[1]。CRISPR/Cas9系统中的向导RNA(sgRNA)引导核酸酶活性的Cas9蛋白与目标序列结合进行靶向切割，造成DNA双链断裂(DSB)，断裂后的DNA利用细胞的非同源末端连接(NHEJ)或同源末端重组(HDR)进行修复，大部分情况下会发生NHEJ，引起碱基的随机插入或缺失(indels)，破坏基因的编码区从而实现功能缺失(loss-of-function)。在进行碱基修复的时候需要利用外源的同源供体模板(donor)，在sgRNA、Cas9和Donor同时存在的情况下，细胞利用HDR实现同源重组来进行基因敲入或碱基替换，但是HDR介导的同源修复发生概率很低(仅在细胞周期的S和G2期)，而且, 其插入/置换的效率也不高，往往达不到预期目的[2]。同时, CRISPR/Cas9还存在脱靶现象，所以会造成基因编辑的不准确性。
2016年, Komor等[3]研发出了能够在不引起DNA双链断裂的情况下进行单碱基置换的胞嘧啶碱基编辑器(CBE)，该工具能够实现C·G到T·A的置换。其在分裂不活跃的细胞中编辑效率比HDR高200多倍，且不受细胞周期的影响[4]。2017年, Gaudelli等[5]又研发出能够将A·T置换为G·C的腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，这两项工具将基因编辑精确到了高分辨率的单碱基水平，为基于CRISPR/Cas9同源重组的单碱基突变提供了另一种更为简单高效的方法。更为重要的是，人类大多数遗传疾病都是由单碱基水平的突变造成的[3]，碱基编辑器的出现恰好能够纠正一定比例的致病性SNP，因此，其在以后生命科学领域的应用前景十分广阔。本文重点对最先出现的胞嘧啶碱基编辑器(CBE)进行综述。
1 胞嘧啶碱基编辑器(CBE)系统的原理与发展胞嘧啶碱基编辑器(CBE)系统主要由sgRNA、Cas9蛋白和胞嘧啶脱氨酶(cytidine deaminase)3个原始组件构成。如图 1所示，该系统的基本原理可概括为胞嘧啶脱氨酶与Cas9蛋白(nCas9/Cas9n)融合形成复合体，在sgRNA的引导下，该复合体靶向结合到基因组特定位点，在特定窗口内将非互补链上的胞嘧啶(cytosine, C)脱氨基形成尿嘧啶(uracil, U)，再通过DNA的复制/修复过程形成胸腺嘧啶(thymine, T)，最终实现由C到T的转换。
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图 1 CBE系统工作原理示意图 Fig. 1 Schematic diagram of the CBE system working |
研究人员对CBE系统中的各个组件进行不断的改造升级，基本开发出了4代CBE系统(CBE1-CBE4)。CBE1系统由来源于大鼠的胞苷脱氨酶(rat apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide 1, rAPOBEC1)、连接蛋白(XTEN)和无核酸内切酶活性的dCas9构成。第2代CBE2比CBE1多了一个尿嘧啶糖苷酶抑制剂(uracil DNA glycosylase inhibitor, UGI)，其能够抑制DNA糖基化酶(uracil DNA glycosylase，UDG)对U的移除作用从而使编辑效率提高3倍。第3代CBE3中，研究人员采用具有单链切口酶活性的Cas9n来替换dCas9，使其含有G的非编辑链被切开，通过细胞的错配修复机制(mis-match repair，MMR)使CBE3的编辑效率提升至37%左右。CBE3还存在一定的缺点，即编辑产物不纯，C不仅会变成T还会变成G或A，原因是UDG会催化U从DNA上移除而形成无嘌呤或无嘧啶位点(apurinic or apyrimidinic site，AP)进而被裂合酶识别，然后切开互补链，加上Cas9n会切开非互补链，从而造成双链断裂引起细胞的NHEJ随机修复。第4代CBE4中的UGI为2个拷贝，进一步抑制了UDG的作用，使其编辑效率提高了1.5倍左右，非目标产物降低了50%左右。除了Nishida等[6]研发的4代CBE外，其他实验室也相继开发了类似的胞嘧啶碱基编辑器。Ma等[7]采用了人源的激活诱导性胞苷脱氨酶(activation induced cytidine deaminase，AID)突变体AIDx来代替rAPOBEC1，开发出dCas9-AIDx系统[6]。
为了增加编辑产物的特异性和提高编辑效率，科研人员也开发出了许多改良版的CBE系统。Komor等[8]发现，来源于噬菌体Mu的Gam蛋白能够结合在双链断裂位点的末端起保护作用，因此，他们将Gam融入CBE系统，开发出了CBE4-Gam，将Indel率降低了1.5~2.0倍。Wang等[9]开发出了增强版的碱基编辑器eCBE-S1和eCBE-S3(enhanced CBE)，eCBE-S1系统是由1个载体共表达sgRNA和1个拷贝的UGI-2A-UGI组成；而eCBE-S3系统中的UGI-2A-UGI增加为3个拷贝，他们以FT292和HeLa细胞为试验对象，结果发现，这两个系统的编辑效率都比之前的CBE3至少增加了6倍，而且非预期的C>A和C>G突变显著下降。除了上面的增强版CBE，还有高保真碱基编辑器HF-CBE(high-fidelity)相继被开发出来。和普通CBE不同的是，HF-CBE中的Cas9蛋白为突变体(HF-Cas9)，例如，Cas9-HF1包含4个突变体N497A、R661A、Q695A和Q926A；Cas9-HF2包含1个突变体D1135A，他们都能实现碱基编辑的高特异性[10-11]。Liang等[12]在小鼠胚胎上对Tyr基因测试了HF-CBE2系统的编辑效率，成功获得了目标基因突变的后代，发现其能够使C高效地突变为T，突变效率高达100%，并且还能在互补链上进行碱基置换。Rees等[13]利用HF-CBE3系统在哺乳动物细胞系HEK293T和斑马鱼胚胎中都实现了高效且特异的C>T突变。Kim等[14]为了缩小编辑窗口，增加编辑产物的特异性，对胞苷脱氨酶APOBEC1进行了突变，开发了4种新的编辑器：YE1-BE3(催化位点W90Y+结合位点R126E突变体)、YE2-BE3(催化位点W90Y+结合位点R132E突变体)、EE-BE3(结合位点R126E+结合位点R132E突变体)、YEE-BE3(催化位点W90Y+结合位点R126E+结合位点R132E突变体)。它们都能够在基本上不影响编辑效率的情况下缩小编辑窗口，其中YEE-BE3的编辑窗口精确到了1个胞嘧啶核苷酸，而其编辑效率只比CBE3系统稍低。Zafra等[15-16]将CBE3系统进行了密码子优化以使其在哺乳动物细胞中更好的表达，而且还在Cas9蛋白的N端添加了NLS核定位信号，其编辑效率比普通的CBE3系统高约50倍。Coelho等[17]在传统CBE的基础上开发出了基于荧光标记的CBE-FLARE(base editing fluorescent activity reporter)系统，利用该系统可以通过荧光筛选快速富集发生了碱基突变的阳性细胞。Jiang等[18]基于SunTag(信号放大系统)开发出了CBE-PLUS(programming larger C to U (T) scope)系统，该系统拥有更宽的编辑窗口，大大增加了其在基因组上的打靶范围。Gehrke等[19]采用经过改造的人胞苷脱氨酶eA3A (engineered human APOBEC3A)开发出eA3A-CBE3系统，该系统比传统的CBE3系统更加精准(其编辑效率比CBE3高40倍)，另外，靶点附近的非目的突变也显著降低。Wang等[20]通过筛选APOBEC和AID突变体发现，以人源共价结合的APOBEC3A拥有更好的特异性，并且能够在高甲基化区进行编辑，最终开发出了hA3A-BE3系统。Koblan等[21]发现，碱基编辑器的表达程度影响着最终的编辑效率，他们通过密码子优化，修饰核定位信号和改造脱氨酶，最终构建了效率更高的BE4max和AncBE4max系统，成功在多种哺乳动物细胞中纠正了致病性SNP。
2 胞嘧啶碱基编辑器(CBE)的应用 2.1 胞嘧啶碱基编辑器(CBE)在基因敲除上的应用CBE系统能够在编辑窗口内实现C·G到T·A的碱基置换，可以将基因翻译区内编码氨基酸的密码子CGA (Arg)、CAG (Gln)、CAA (Gln)置换为终止密码子TGA、TAG、TAA，或将TGG(Trp)变为TGA、TAG、TAA，从而实现基因敲除，这比传统CRISPR/Cas9介导的NHEJ方式更加安全。Kuscu等[22]利用HEK293T细胞开发出了基于CBE3的基因敲除系统CRISPR-Stop，成功实现了目的基因终止密码子的提前出现，而且其安全性优于传统的CRISPR/Cas9。Billon等[23]开发的iSTOP(introducing stop codon)系统具有同样的功能。Jia等[24]利用高效的BE4max系统结合多对sgRNA在小鼠胚胎中实现i-STOP，成功敲除了Tyr和Pdcd1基因。Li等[25]在家蚕上系统研究了碱基编辑系统，利用CBE3敲除内源和外源基因，效率高达66.2%。Yang等[26]在小鼠组蛋白Hist1/2H3上引入R17H点突变，同时，在CARM1催化结构域上引入提前终止密码子，结果发现了与早期胚胎发育相关的Yap信号通路。Gapinske等[27]基于CBE3开发出了CRISPR-SKIP系统，该系统能够破坏剪接受体进而实现pre-RNA剪接异常，导致mRNA中外显子拼接失调，最终使蛋白功能异常。Webber等[28]以人的T细胞为研究对象，利用CBE系统在PDCD1、TRAC、B2M 3个基因的剪接供体(splice donor, SD)和剪接受体(splice acceptor, SA)上同时实现了终止密码子的提前出现-pmSTOP(premature stop)，破坏了基因功能，这为多基因的同时编辑提供了借鉴。除了对基因的编码区进行编辑外，Lee等[29]还利用碱基编辑器在基因的非编码区(增强子)进行突变，结果发现增强子区的碱基突变会选择性影响临近基因的功能。这说明CBE等碱基编辑工具不仅能研究某个基因的具体功能还能用来研究其相关调控序列的功能。
2.2 胞嘧啶碱基编辑器(CBE)在疾病模型中的应用人类致病性SNP中有55%左右是由C>T和A>G碱基突变造成的[30]。这意味着碱基编辑器在修正人类致病性遗传突变上的应用前景十分广阔。Kim等[31]以小鼠受精卵为试验对象，利用CBE3系统成功突变了抗肌萎缩蛋白基因(Dmd)和酪氨酸酶基因(Tyr)，成功建立了杜兴氏肌营养不良症和白化病模型。Park等[32]以非洲爪蟾的早期胚胎为试验对象，也利用CBE3系统成功突变了Tyr，突变效率在21%左右，且没有脱靶现象。Liu等[33]利用CBE3和CBE4-Gam系统在兔囊胚中模拟了Tia1(P362L)和Lmna(G608G)突变，构建了肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral aclerosis, ALS)、额颞痴呆(frontotemporal dementia, FTD)、早年衰老综合征(hutchinson-gilford progeria syndrome, HGPS)等疾病模型。Li等[34]以单倍体胚胎干细胞为试验对象，利用增强型CBE系统(融合数个NLS)和针对Dnd1基因的sgRNA文库鉴定出Dnd1基因中4个对原始生殖细胞正常发育起关键作用的氨基酸位点。Qin等[35]在斑马鱼上模拟了人TWIST2基因突变(E78K)，建立了先天性眼睑缺损-巨口综合征(ablepharon-macrostomia syndrome, AMS)模型。Zhang等[36]利用CBE3系统在小鼠胚胎中同时编辑了与听力相关的3个基因(vGlut3、Otoferlin、Prestin)，最终建立了听力缺陷模型。总而言之，利用碱基编辑器构建的疾病模型极大地突破了现有CRISPR/Cas9的弊端，越来越多的模型正在被建立。
2.3 胞嘧啶碱基编辑器(CBE)在疾病治疗中的应用人类大约有10 000种遗传病被鉴定，这些遗传病让世界各地的家庭备受伤害。然而，其中仅有不到6%的遗传病有确切的治疗手段[37]。目前已知的大部分遗传病都是由单碱基水平的突变造成的，在这些致病性SNP中有接近1 000种是可以通过CBE系统进行校正的[3]。β-地中海贫血症大部分是因为HBB基因发生了-28(A>G)突变。Liang等[38]利用CBE3系统在患者的皮肤细胞和人早期胚胎中进行了碱基修复，修复效率分别为20%和40.9%。APOE4的突变会导致迟发性阿尔兹海默症，Komor等[3]以小鼠星形胶质细胞为材料利用CBE3对致病性APOE突变进行了纠正，纠正效率高达74.9%，而利用ssODN(single strand oligonucleotide donor)进行同源修复的效率仅为0.3%；他们同样利用CBE3和ssODN对与癌症相关的P53基因进行了修复，修复效率分别为7.6%和0，这说明基于同源重组的碱基置换效率远不如碱基编辑器。携带ANGPTL3基因自然突变的人往往具有低水平的甘油三酯和胆固醇，Chadwick等[39]利用CBE3系统在患高血脂病的小鼠上模拟了人ANGPTL3自然突变，突变效率约为35%，最终使血液中的胆固醇水平显著降低了大约50%，该结果为高胆固醇血症的治疗提供了有力支持。类似的，PCSK9 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 9)基因突变的人同样不容易患高血脂症，Carreras等[40]将人的hPCSK9基因敲入到小鼠Rosa 26位点，建立了人高血脂疾病模型，然后利用CBE3系统对人hPCSK9基因进行突变，最终也成功使胆固醇恢复到正常水平。Zeng等[41]利用CBE3系统在人胚胎中对马凡综合征(marfan syndrome, MS)患者的FBN1基因致病性突变T7498C进行修复，其修复效率高达89%，而且，通过全基因组高通量深度测序并未发现脱靶现象。Villiger等[42]对CBE系统进行了内含肽剪切(intein-split)改造并通过腺相关病毒(AAV)结合静脉注射在患代谢性肝病苯丙酮尿症(phenylketonuria, PKU)的成年小鼠上纠正了Pah基因的致病性突变(T835C)，纠正效率达63%。人1型遗传性酪氨酸血症(hereditary tyrosinaemia type 1, HT1)由FAH基因突变导致，其表型为酪氨酸分解代谢通路受阻，毒性代谢物在肝脏积累导致肝衰竭，通过抑制HPD酶活性可暂时缓解发病症状，该病的小鼠模型(Fah-/-)会在出生后20 d内死亡。Rossidis等[43]利用腺病毒载体介导的子宫静脉注射CBE系统在16天的小鼠胚胎中对编码HPD酶的Hpd基因进行了突变，成功纠正了其致死的表型，出生的幼崽至少活至3个月。综上，单碱基编辑工具的出现为多种遗传疾病的治疗带来了曙光。
2.4 胞嘧啶碱基编辑器(CBE)在畜牧生产及大动物模型构建中的应用CBE系统在小鼠、大鼠、人、斑马鱼、非洲爪蟾、家蚕、兔子等物种上报道较多，但对于猪、牛、羊等大家畜的研究相对较少。2018年6月，Li等[44]在《bioRxiv》上发文，他们以羊为研究对象率先在大动物上开展了CBE系统的研究，他们利用CBE3系统对山羊FGF5基因的第一外显子进行了无义突变，突变效率达39%，且存在少量的插入/缺失，通过原核胚微注射最终生产出了5只阳性后代，阳性后代表现出多毛性状。随后，2018年12月，Li等[45]在《Cell Discovery》上发文，他们将CBE3系统结合体细胞核移植技术对TWIST2和TYR基因进行碱基编辑，生产出了单碱基突变猪，成功建立了先天性眼睑缺损-巨口综合征(AMS)和1型眼皮肤白化病(oculocutaneous albinism type 1, OCA1)的大动物疾病模型。2019年2月, Zhou等[46]又在《Frontiers in Genetics》上发文，他们在绵羊上利用CBE3系统模拟了SOCS2(suppressor of cytokine signaling 2)基因的自然突变(R96C)，该基因的突变会使个体产生体重增加/体型增大的表型。通过原核注射共出生3只阳性后代，表型明显，突变效率为25%左右。最近，2019年7月，Yuan等[47]利用体细胞核移植技术结合CBE4-Gam系统生产出了B4galNT2、GGTA1、CMAH 3个异体抗原相关基因同时敲除的克隆猪，该克隆猪表现出优良的低免疫排斥性，这为人类器官移植的研究提供了新的材料。总之，碱基编辑器的出现将会为大动物的分子育种、遗传改良及模型构建提供有力的支持。
2.5 胞嘧啶碱基编辑器(CBE)在植物中的应用在农业生产中，很多重要的性状来自于基因组编码区和非编码区的单核苷酸多态性，碱基编辑器的出现对植物育种和作物改良等意义重大[48]。研究人员通过CBE系统对乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS)基因进行了单碱基突变，使得小麦[49]、拟南芥[50]、西瓜[51]、番茄和马铃薯[52]等突变体植株获得了磺酰脲或咪唑啉酮类除草剂抗性。除了研究除草剂抗性植株外，研究人员还将注意力放在了抗病性状的改良上，在农业生产中因疾病造成的损失所占比例并不小。Bastet等[53]在拟南芥上通过CBE系统模拟了能够抗病毒(potyviruses)的elF4E基因自然突变(N176K)，该研究为植物病原体抗性的研究提供了参考。另外，对于植物遗传改良[54]，可变剪接[55]，基因敲除[56]，植物碱基编辑器开发、优化及突变效率[57-59]等相关研究也越来越多。
3 胞嘧啶碱基编辑器(CBE)系统存在的问题对于CBE系统来说最大的限制因素有以下常见的几点。
受PAM(protospacer adjacent motif)序列的限制，很多目的位点附近并没有合适的PAM序列。为了扩大基因组上碱基编辑的靶向范围，Kim等[14, 60]对常用的spCas9(PAM：NGG或NGA)和saCas9(PAM：NNGRRT)蛋白进行了升级改造，获得了EQR、VQR、VRER、SaKKH和Xcas9等许多优化突变体，提供了多种可选择的PAM序列。Nishimasu等[61]筛选的spCas9突变体能够识别比NGG更大范围的NG PAM。除了Cas9蛋白外，相对小巧的Cas12a蛋白也得到了研究人员的青睐。Li等[62]采用毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)的Cpf1(Cas12a)蛋白取代了传统的spCas9蛋白，开发出了dCpf1-CBEs系统，该系统在人类细胞中实现了高GC含量PAM序列(TTTV)附近的目的突变，其编辑产物比较纯，而且没有非T碱基的替换和脱靶。Kleinstiver等[63]试图通过蛋白质工程筛选氨基酸球菌(Acidaminococcus sp.)的Cas12a突变体，最终筛选出了增强型突变体enAsCas12a，其不仅能识别传统的TTTV PAM，还能识别VTTV、TTTT和TTCN/TATV序列，极大地扩展了基因组上可进行碱基编辑的范围(6 bp DNA中就有一个打靶位点)，而且，其在传统TTTV PAM靶点的编辑效率是野生型Cas12a的2倍。
编辑窗口过宽，在编辑窗口内所有的C都可能突变为T，因此会出现非靶点的编辑。Tan等[64]通过对Cas蛋白与脱氨酶结构域之间的连接序列进行改造，同时，将脱氨酶上不必要的序列进行删除，结果大大缩小了碱基编辑的窗口，显著提高了碱基编辑的特异性。
产物特异性不佳，CBE系统有时会出现碱基编辑产物不纯的现象，即会有C到非T产物的出现，还会有碱基的随机插入和缺失，即出现脱靶现象。2019年2月28日，中国科学家在《Science》上发表了两篇背靠背文章，发现无论是在小鼠还是在水稻中CBE系统都出现了脱靶现象[65-66]，因此，还需要对其进行更加细致的研究。
4 展望自2016年单碱基编辑系统问世以来，其在动物、植物、微生物等多个物种上都展开了大量的研究。比腺嘌呤碱基编辑器(ABE)更早出现的胞嘧啶碱基编辑器(CBE)已被越来越多的研究者熟知和利用。虽然CBE系统还存在一定的效率不稳定、特异性不高等问题。可以预期，研究者们的联合攻关，通过对CBE系统进行结构生物学的升级改造，定会将CBE系统改造地更加高效和安全。总之，基于单碱基突变的碱基编辑器已经在疾病模型构建，纠正致病性SNP，基因功能研究，动、植物遗传改良等方面显示出巨大的应用前景，该技术的变革将会对生命科学和农、牧业发展产生重大影响。
| [1] | ZHAO J G, LAI L X, JI W Z, et al. Genome editing in large animals:current status and future prospects[J]. Natl Sci Rev, 2019, 6(3): 402–420. DOI: 10.1093/nsr/nwz013 |
| [2] | EID A, ALSHAREEF S, MAHFOUZ M M. CRISPR base editors:genome editing without double-stranded breaks[J]. Biochem J, 2018, 475(11): 1955–1964. DOI: 10.1042/BCJ20170793 |
| [3] | KOMOR A C, KIM Y B, PACKER M S, et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage[J]. Nature, 2016, 533(7603): 420–424. DOI: 10.1038/nature17946 |
| [4] | YEH W H, CHIANG H, REES H A, et al. In vivo base editing of post-mitotic sensory cells[J]. Nat Commun, 2018, 9(1): 2184. DOI: 10.1038/s41467-018-04580-3 |
| [5] | GAUDELLI N M, KOMOR A C, REES H A, et al. Programmable base editing of A·T to G·C in genomic DNA without DNA cleavage[J]. Nature, 2017, 551(7681): 464–471. DOI: 10.1038/nature24644 |
| [6] | NISHIDA K, ARAZOE T, YACHIE N, et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems[J]. Science, 2016, 353(6305): aaf8729. DOI: 10.1126/science.aaf8729 |
| [7] | MA Y Q, ZHANG J Y, YIN W J, et al. Targeted AID-mediated mutagenesis (TAM) enables efficient genomic diversification in mammalian cells[J]. Nat Methods, 2016, 13(12): 1029–1035. DOI: 10.1038/nmeth.4027 |
| [8] | KOMOR A C, ZHAO K T, PACKER M S, et al. Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:a base editors with higher efficiency and product purity[J]. Sci Adv, 2017, 3(8): eaao4774. DOI: 10.1126/sciadv.aao4774 |
| [9] | WANG L J, XUE W, YAN L, et al. Enhanced base editing by co-expression of free uracil DNA glycosylase inhibitor[J]. Cell Res, 2017, 27(10): 1289–1292. DOI: 10.1038/cr.2017.111 |
| [10] | KLEINSTIVER B P, PREW M S, TSAI S Q, et al. Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition[J]. Nat Biotechnol, 2015, 33(12): 1293–1298. DOI: 10.1038/nbt.3404 |
| [11] | KLEINSTIVER B P, PATTANAYAK V, PREW M S, et al. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects[J]. Nature, 2016, 529(7587): 490–495. DOI: 10.1038/nature16526 |
| [12] | LIANG P P, SUN H W, SUN Y, et al. Effective gene editing by high-fidelity base editor 2 in mouse zygotes[J]. Protein Cell, 2017, 8(8): 601–611. DOI: 10.1007/s13238-017-0418-2 |
| [13] | REES H A, KOMOR A C, YEH W H, et al. Improving the DNA specificity and applicability of base editing through protein engineering and protein delivery[J]. Nat Commun, 2017, 8: 15790. DOI: 10.1038/ncomms15790 |
| [14] | KIM Y B, KOMOR A C, LEVY J M, et al. Increasing the genome-targeting scope and precision of base editing with engineered Cas9-cytidine deaminase fusions[J]. Nat Biotechnol, 2017, 35(4): 371–376. DOI: 10.1038/nbt.3803 |
| [15] | ZAFRA M P, SCHATOFF E M, KATTI A, et al. An optimized toolkit for precision base editing[J]. bioRxiv, 2018. DOI: 10.1101/303131 |
| [16] | ZAFRA M P, SCHATOFF E M, KATTI A, et al. Optimized base editors enable efficient editing in cells, organoids and mice[J]. Nat Biotechnol, 2018, 36(9): 888–893. DOI: 10.1038/nbt.4194 |
| [17] | COELHO M A, LI S Y, PANE L S, et al. BE-FLARE:a fluorescent reporter of base editing activity reveals editing characteristics of APOBEC3A and APOBEC3B[J]. BMC Biol, 2018, 16(1): 150. DOI: 10.1186/s12915-018-0617-1 |
| [18] | JIANG W, FENG S J, HUANG S S, et al. BE-PLUS:a new base editing tool with broadened editing window and enhanced fidelity[J]. Cell Res, 2018, 28(8): 855–861. DOI: 10.1038/s41422-018-0052-4 |
| [19] | GEHRKE J M, CERVANTES O, CLEMENT M K, et al. An APOBEC3A-Cas9 base editor with minimized bystander and off-target activities[J]. Nat Biotechnol, 2018, 36(10): 977–982. DOI: 10.1038/nbt.4199 |
| [20] | WANG X, LI J A, WANG Y, et al. Efficient base editing in methylated regions with a human APOBEC3A-Cas9 fusion[J]. Nat Biotechnol, 2018, 36(10): 946–949. DOI: 10.1038/nbt.4198 |
| [21] | KOBLAN L W, DOMAN J L, WILSON C, et al. Improving cytidine and adenine base editors by expression optimization and ancestral reconstruction[J]. Nat Biotechnol, 2018, 36(9): 843–846. DOI: 10.1038/nbt.4172 |
| [22] | KUSCU C, PARLAK M, TUFAN T, et al. CRISPR-STOP:gene silencing through base-editing-induced nonsense mutations[J]. Nat Methods, 2017, 14(7): 710–712. DOI: 10.1038/nmeth.4327 |
| [23] | BILLON P, BRYANT E E, JOSEPH S A, et al. CRISPR-mediated base editing enables efficient disruption of eukaryotic genes through induction of STOP codons[J]. Mol Cell, 2017, 67(6): 1068–1079. DOI: 10.1016/j.molcel.2017.08.008 |
| [24] | JIA K, LU Z Y, ZHOU F, et al. Multiple sgRNAs facilitate base editing-mediated i-stop to induce complete and precise gene disruption[J]. Protein Cell, 2019. DOI: 10.1007/s13238-019-0611-6 |
| [25] | LI Y F, MA S Y, SUN L, et al. Programmable single and multiplex base-editing in Bombyx mori using RNA-guided cytidine deaminases[J]. G3 (Bethesda), 2018, 8(5): 1701–1709. DOI: 10.1534/g3.118.200134 |
| [26] | YANG G, ZHOU C Y, WANG R, et al. Base-editing-mediated R17H substitution in histone H3 reveals methylation-dependent regulation of Yap signaling and early mouse embryo development[J]. Cell Rep, 2019, 26(2): 302–312e. DOI: 10.1016/j.celrep.2018.12.046 |
| [27] | GAPINSKE M, LUU A, WINTER J, et al. CRISPR-SKIP:programmable gene splicing with single base editors[J]. Genome Biol, 2018, 19: 107. DOI: 10.1186/s13059-018-1482-5 |
| [28] | WEBBER B R, LONETREE C L, KLUESNER M G, et al. Highly efficient multiplex human T cell engineering without double-strand breaks using Cas9 base editors[J]. bioRxiv, 2018. DOI: 10.1101/482497 |
| [29] | LEE H K, WILLI M, SMITH H E, et al. Simultaneous targeting of linked loci in mouse embryos using base editing[J]. Sci Rep, 2019, 9(1): 1662. DOI: 10.1038/s41598-018-33533-5 |
| [30] | GAUDELLI N M, KOMOR A C, REES H A, et al. Programmable base editing of A·T to G·C in genomic DNA without DNA cleavage[J]. Nature, 2017, 551(7681): 464–471. DOI: 10.1038/nature24644 |
| [31] | KIM K, RYU S M, KIM S T, et al. Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos[J]. Nat Biotechnol, 2017, 35(5): 435–437. DOI: 10.1038/nbt.3816 |
| [32] | PARK D S, YOON M, KWEON J, et al. Targeted base editing via RNA-guided cytidine deaminases in Xenopus laevis embryos[J]. Mol Cells, 2017, 40(11): 823–827. |
| [33] | LIU Z Q, CHEN M, CHEN S Y, et al. Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit[J]. Nat Commun, 2018, 9(1): 2717. DOI: 10.1038/s41467-018-05232-2 |
| [34] | LI Q, LI Y J, YANG S M, et al. CRISPR-Cas9-mediated base-editing screening in mice identifies DND1 amino acids that are critical for primordial germ cell development[J]. Nat Cell Biol, 2018, 20(11): 1315–1325. DOI: 10.1038/s41556-018-0202-4 |
| [35] | QIN W, LU X C, LIN S. Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system[J]. Methods, 2018, 150: 19–23. DOI: 10.1016/j.ymeth.2018.07.010 |
| [36] | ZHANG H, PAN H, ZHOU C Y, et al. Simultaneous zygotic inactivation of multiple genes in mouse through CRISPR/Cas9-mediated base editing[J]. Development, 2018, 145(20): dev168906. DOI: 10.1242/dev.168906 |
| [37] | AUSTIN C P, DAWKINS H J S. Next decade's goals for rare diseases[J]. Nature, 2017, 548(7666): 158. |
| [38] | LIANG P P, DING C H, SUN H W, et al. Correction of β-thalassemia mutant by base editor in human embryos[J]. Protein Cell, 2017, 8(11): 811–822. DOI: 10.1007/s13238-017-0475-6 |
| [39] | CHADWICK A C, EVITT N H, LV W J, et al. Reduced blood lipid levels with in vivo CRISPR-Cas9 base editing of ANGPTL3[J]. Circulation, 2018, 137(9): 975–977. DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.117.031335 |
| [40] | CARRERAS A, PANE L S, NITSCH R, et al. In vivo genome and base editing of a human PCSK9 knock-in hypercholesterolemic mouse model[J]. BMC Biol, 2019, 17(1): 4. DOI: 10.1186/s12915-018-0624-2 |
| [41] | ZENG Y T, LI J N, LI G L, et al. Correction of the Marfan Syndrome pathogenic FBN1 mutation by base editing in human cells and heterozygous embryos[J]. Mol Ther, 2018, 26(11): 2631–2637. DOI: 10.1016/j.ymthe.2018.08.007 |
| [42] | VILLIGER L, GRISCH-CHAN H M, LINDSAY H, et al. Treatment of a metabolic liver disease by in vivo genome base editing in adult mice[J]. Nat Med, 2018, 24(10): 1519–1525. DOI: 10.1038/s41591-018-0209-1 |
| [43] | ROSSIDIS A C, STRATIGIS J D, CHADWICK A C, et al. In utero CRISPR-mediated therapeutic editing of metabolic genes[J]. Nat Med, 2018, 24(10): 1513–1518. DOI: 10.1038/s41591-018-0184-6 |
| [44] | LI G W, ZHOU S W, LI C, et al. Base pair editing of goat embryos:nonsense codon introgression into FGF5 to improve cashmere yield[J]. bioRxiv, 2018. DOI: 10.1101/348441 |
| [45] | LI Z F, DUAN X Y, AN X M, et al. Efficient RNA-guided base editing for disease modeling in pigs[J]. Cell Discov, 2018, 4: 64. |
| [46] | ZHOU S W, CAI B, HE C, et al. Programmable base editing of the sheep genome revealed no genome-wide off-target mutations[J]. Front Genet, 2019, 10: 215. DOI: 10.3389/fgene.2019.00215 |
| [47] | YUAN H M, YU T T, WANG L Y, et al. Efficient base editing by RNA-guided cytidine base editors (CBEs) in pigs[J]. Cell Mol Life Sci, 2019. DOI: 10.1007/s00018-019-03205-2 |
| [48] | CHEN K L, WANG Y P, ZHANG R, et al. CRISPR/Cas genome editing and precision plant breeding in agriculture[J]. Annu Rev Plant Biol, 2019, 70: 667–697. DOI: 10.1146/annurev-arplant-050718-100049 |
| [49] | ZONG Y, SONG Q N, LI C, et al. Efficient C-to-T base editing in plants using a fusion of nCas9 and human APOBEC3A[J]. Nat Biotechnol, 2018, 36(10): 950–953. DOI: 10.1038/nbt.4261 |
| [50] | CHEN Y Y, WANG Z P, NI H W, et al. CRISPR/Cas9-mediated base-editing system efficiently generates gain-of-function mutations in Arabidopsis[J]. Sci China Life Sci, 2017, 60(5): 520–523. DOI: 10.1007/s11427-017-9021-5 |
| [51] | TIAN S W, JIANG L J, CUI X X, et al. Engineering herbicide-resistant watermelon variety through CRISPR/Cas9-mediated base-editing[J]. Plant Cell Rep, 2018, 37(9): 1353–1356. DOI: 10.1007/s00299-018-2299-0 |
| [52] | VEILLET F, PERROT L, CHAUVIN L, et al. Transgene-free genome editing in tomato and potato plants using Agrobacterium-mediated delivery of a CRISPR/Cas9 cytidine base editor[J]. Int J Mol Sci, 2019, 20(2): 402. DOI: 10.3390/ijms20020402 |
| [53] | BASTET A, ZAFIROV D, GIOVINAZZO N, et al. Mimicking natural polymorphism in eIF4E by CRISPR-Cas9 base editing is associated with resistance to potyviruses[J]. Plant Biotechnol J, 2019, 17(9): 1736–1750. DOI: 10.1111/pbi.13096 |
| [54] | GUPTA P K. Beyond CRISPR:single base editors for human health and crop improvement[J]. Curr Sci India, 2019, 116(3): 386–397. DOI: 10.18520/cs/v116/i3/386-397 |
| [55] | XUE C X, ZHANG H W, LIN Q P, et al. Manipulating mRNA splicing by base editing in plants[J]. Sci China Life Sci, 2018, 61(11): 1293–1300. DOI: 10.1007/s11427-018-9392-7 |
| [56] | LI Z X, XIONG X Y, WANG F Z, et al. Gene disruption through base editing-induced messenger RNA missplicing in plants[J]. New Phytol, 2019, 222(2): 1139–1148. DOI: 10.1111/nph.15647 |
| [57] | REN B, YAN F, KUANG Y J, et al. Improved base editor for efficiently inducing genetic variations in rice with CRISPR/Cas9-guided hyperactive hAID Mutant[J]. Mol Plant, 2018, 11(4): 623–626. DOI: 10.1016/j.molp.2018.01.005 |
| [58] | HUA K, TAO X P, ZHU J K. Expanding the base editing scope in rice by using Cas9 variants[J]. Plant Biotechnol J, 2019, 17(2): 499–504. DOI: 10.1111/pbi.12993 |
| [59] | SHAN Q W, VOYTAS D F. Editing plant genes one base at a time[J]. Nat Plants, 2018, 4(7): 412–413. DOI: 10.1038/s41477-018-0177-y |
| [60] | HU J H, MILLER S M, GEURTS M H, et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity[J]. Nature, 2018, 556(7699): 57–63. DOI: 10.1038/nature26155 |
| [61] | NISHIMASU H, SHI X, ISHIGURO S, et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space[J]. Science, 2018, 361(6408): 1259–1262. DOI: 10.1126/science.aas9129 |
| [62] | LI X S, WANG Y, LIU Y J, et al. Base editing with a Cpf1-cytidine deaminase fusion[J]. Nat Biotechnol, 2018, 36(4): 324–327. DOI: 10.1038/nbt.4102 |
| [63] | KLEINSTIVER B P, SOUSA A A, WALTON R T, et al. Engineered CRISPR-Cas12a variants with increased activities and improved targeting ranges for gene, epigenetic and base editing[J]. Nat Biotechnol, 2019, 37(3): 276–282. DOI: 10.1038/s41587-018-0011-0 |
| [64] | TAN J J, ZHANG F, KARCHER D, et al. Engineering of high-precision base editors for site-specific single nucleotide replacement[J]. Nat Commun, 2019, 10(1): 439. DOI: 10.1038/s41467-018-08034-8 |
| [65] | JIN S, ZONG Y, GAO Q, et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice[J]. Science, 2019, 364(6437): 292–295. |
| [66] | ZUO E W, SUN Y D, WEI W, et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos[J]. Science, 2019, 364(6437): 289–292. |