2. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193;
3. 农业部兽用药物与兽医生物技术北京科学观测实验站, 北京 100193;
4. 北京市畜牧总站, 北京 100107
2. Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China;
3. Beijing Observation Station for Veterinary Drug and Veterinary Biotechnology of Ministry of Agriculture, Beijing 100193, China;
4. Beijing Livestock and Veterinary Station, Beijing 100107, China
A型塞内卡病毒(Senecavirus A，SVA)是小RNA病毒科(Picornaviridae)，塞内卡病毒属(Senecavirus)的唯一成员。SVA原型毒株SVV-001对猪无致病性[1]; 在2008和2012年，加拿大和美国的研究人员分别报道了与SVA相关的水疱性疾病[2-4]，证实了其可致猪的水疱性疾病，与口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus, FMDV)、猪传染性水疱病病毒(swine vesicular disease virus, SVDV)、水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)和猪传染性水疱皮疹病毒(vesicular exanthema of swine virus, VESV)并称为5大水疱性疾病病原。目前多个国家和地区均已报道了SVA，包括美国[5]、加拿大[3]、巴西[6]、泰国[7]和中国等。2015年，我国首次从广东地区检测并分离到SVA[8]，且在黑龙江[9]、河南[10]、福建[11]等地区均有SVA的相关报道。
2017年7月，南方某猪场发生不明病原引起的水疱性疾病，且该猪场全群免疫口蹄疫疫苗，因此，为了确定引起该场水疱性疾病的病原，笔者采集发病猪水疱液进行实验室诊断及病毒分离鉴定。
1 材料与方法 1.1 试验材料水疱液样品采集自南方某猪场；BHK21细胞及相关病毒(FMDV、SVDV、VSV、VESV)核酸均为本实验室保存。
1.2 引物设计根据GenBank登录的SVA VP1基因序列(Accession No. KY747515.1)，并利用生物信息学软件Primer 5.0设计VP1基因PCR扩增引物，SVA-VP1F：5′-CGGATCCTCCACCGACAACGC-CGAGACTG-3′，SVA-VP1R：5′-GAGTACTTTGCATCAGCATCTTCTGCTTG-3′，目的片段大小为792 bp。
1.3 RT-PCR检测参照试剂盒说明书对水疱液进行RNA的提取，用TaKaRa M-MLV反转录酶合成cDNA。反转录后的cDNA用检测引物进行RT-PCR检测，检测引物参考Wu等[12-16]的研究。PCR反应体系：10×LA PCR Buffer 12.5 μL，LA Taq酶0.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，dNTP 4 μL，ddH2O 4 μL。PCR反应条件: 95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。PCR结束后，PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测。目的片段胶回收后，连接于pMD18-T载体，鉴定阳性的重组质粒送北京铂尚生物技术有限公司进行测序。
1.4 病毒分离将采集的水疱液，用PBS进行10倍稀释后，0.22 μm滤器过滤除菌，接种BHK21单层细胞，盲传几代，逐代观察细胞病变(CPE)。
1.5 电镜观察将收获的病毒液离心、0.1 μm滤器除细胞碎片后，进行超高速离心，离心前在离心管底部加入20%蔗糖，收获纯病毒，用磷钨酸负染后用电子显微镜进行观察。
1.6 半数组织感染剂量及一步生长曲线的测定在BHK21细胞上，参照文献[17]进行半数组织感染剂量及一步生长曲线的测定。
1.7 VP1基因的序列测定及同源性分析参照“1.3”方法进行RT-PCR扩增，将目的片段胶回收后，连接于pMD18-T载体，鉴定阳性的重组质粒测序；将测序获得的VP1基因的核苷酸序列进行拼接；通过MegAlign软件，同筛选自GenBank中登录的SVA VP1基因序列进行核苷酸和氨基酸的同源性分析。
1.8 SVA VP1遗传演化分析将测序获得的VP1基因序列同GenBank中登录的VP1基因序列，通过MEGA6.0软件以最大似然法构建VP1基因的系统发育树，对VP1基因的遗传演化进行分析。
2 结果 2.1 病毒分离如图 1a所示，水疱液样品RT-PCR检测结果为SVA阳性(326 bp)，将SVA阳性水疱液样品过滤除菌后接种于BHK21细胞进行病毒分离；盲传至第4代，分离病毒在BHK21细胞病变效果较为明显，出现拉丝、变圆、脱落等细胞病变。
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a.猪水疱液RT-PCR检测(M. DNA相对分子质量标准；1.阴性对照；2. SVDV；3. VSV；4. VESV；5. FMDV；6. SVA)；b. SVA电镜负染结果(200 000×) a. The detection of vesicular fluid by RT-PCR(M. DNA marker; 1. Negative control; 2. SVDV; 3. VSV; 4. VESV; 5. FMDV; 6. SVA); b. Viral particle morphology observed by electron microscope (200 000×) 图 1 猪水疱液RT-PCR检测和SVA电镜负染结果 Fig. 1 The detection of vesicular fluid by RT-PCR and viral particle morphology observed by electron microscope |
取BHK21细胞第4代SVA病毒液，进行初步纯化、负染，电镜下可观察到圆形或椭圆形病毒颗粒，粒径为25~30 nm，将分离株命名为CH/FuJ1/2017株(图 1b)。
2.3 半数组织感染剂量及一步生长曲线的测定通过Reed-Muench法计算，第4代BHK21细胞液半数组织感染剂量为10-6.8·0.1 mL-1。按照1:1 000稀释病毒后接种于PK15细胞，收集接毒后2、4、6、8、12、24、36、48、60、72 h的细胞培养上清测定病毒TCID50，并绘制CH/FuJ1/2017株的一步生长曲线。如图 2a所示，在接毒后8~48 h为其对数生长期，48 h后病毒效价处于稳定期，该结果有助于病毒培养条件的优化。
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a. SVA CH/FuJ1/2017株的一步生长曲线；b. VP1基因扩增；M.DNA相对分子质量标准；1.阴性对照；2. CH/FuJ1/2017 a. One step growth curve of SVA CH/FuJ1/2017; b. Amplification of SVA VP1 gene by RT-PCR; M. DNA marker; 1. Negative control; 2. CH/FuJ1/2017 图 2 SVA CH/FuJ1/2017株的一步生长曲线及VP1基因扩增 Fig. 2 One step growth curve of CH/FuJ1/2017 strain and amplification of SVA VP1 gene |
利用常规方法，成功扩增出分离株的VP1基因(图 2b)。连接pMD18-T载体并测序，获得SVA分离株的基因序列。将CH/FuJ1/2017株同筛选自GenBank的SVA VP1基因序列进行序列比对。核苷酸序列同源性分析结果显示，CH/FuJ1/2017株与其他参考毒株间的核苷酸相似性介于91.5%~98.2%。与SVV-001株的相似性最低，达91.5%；与USA-GBI29-2015株VP1基因的核苷酸序列相似性最高，达98.2%，与国内SVA分离株的相似性介于95.2%~97.9%。
SVA VP1基因氨基酸序列的同源性分析结果显示，与其他参考毒株VP1基因的氨基酸序列相似性介于96.2%~99.2%。与SVV-001株的相似性达96.2%。与国内其他分离株间的VP1基因氨基酸序列相似性介于98.1%~99.2%。氨基酸序列比对结果显示，与SVA原型毒株SVV-001相比，本研究分离的CH/FuJ1/2017株在VP1蛋白上存在6个氨基酸的突变，分别为F59L、Q62A、E63T、A93V、G97D、A172T。
2.5 SVA分离株遗传进化分析为了研究SVA分离株同其他参考毒株间的遗传演化关系，使用MEGA6.0软件以最大似然法构建基于SVA VP1基因氨基酸序列的系统发育树(图 3)。遗传演化分析结果显示，试验中所分离的SVA毒株CH/FuJ1/2017位于一个独立的分支中，2015年后分离的SVA分离株与SVA原型毒株SVV-001株的亲缘关系均较远。同时发现，2017年从中国分离得到的SVA分离株聚为一个分支，部分毒株与分离自美国的SVA分离株及加拿大分离株亲缘关系较近，也有部分SVA分离株形成一小的分支，但同其他国内SVA分离株的亲缘关系较远。
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三角形标记毒株为本研究中分离SVA毒株 Triangle labeled strains were isolated in this study 图 3 基于SVA VP1基因氨基酸构建系统发育树 Fig. 3 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of VP1 of SVA strains |
SVA可感染不同年龄段的猪，感染新生仔猪可致死亡，不同日龄的猪发病率不同，介于4%~70%，其对养猪业的生产和经济效益的威胁不容忽视。近年来，世界各地相继报道SVA，这为SVA遗传演化的研究及在不同地区间的传播提供了基因库[18-19]。最初分离的SVA原型毒株对猪没有致病性，近几年分离的SVA的毒株对猪的致病性增强，通过对SVA VP1的比对分析可能提供相关的线索；因此，对SVA VP1基因的分析对于了解SVA的遗传演化及病毒致病性变化具有重要的意义。VP1蛋白与SVA的细胞嗜性具有密切关系，这是由于小RNA病毒科细胞嗜性与病毒衣壳蛋白中暴露环密切相关，而VP1蛋白上具有B-C型环(50—74 aa)、CD-Ⅰ型环(82—87 aa)、CD-Ⅱ型环(94—109 aa)、G-H型环(185—215 aa)四个茎环结构[20]。本研究中，SVA分离株与SVV-001原型毒株在核苷酸和氨基酸相似性上均是最低，而与美国的USA-GBI29-2015株等的相似性最高。基于VP1基因核苷酸序列遗传演化分析显示，本试验SVA分离株形成一个小分支，与其他国内SVA分离株并未处于一个分支当中，而且国内部分SVA分离株与分离自美国、巴西、加拿大毒株亲缘关系较近，这表明我国SVA分离株具有遗传多样性，也有可能与国外SVA分离株间具有密切的相关性。其他研究也显示，我国许多分离株与美国、巴西等国外的分离株具有较近的亲缘关系。据目前已有的研究，国内流行的SVA分离毒株与国际间的种猪贸易有无关系尚不能确定，这需要进一步的回顾性研究来证实。
不同SVA毒株的长期传播和存在将进一步促进SVA的进化和突变。通过对VP1蛋白氨基酸序列的比对，发现与SVV-001株相比，本研究中所分离的SVA分离株VP1蛋白氨基酸序列中存在6个氨基酸位点的突变，其中，59、62、63位的氨基酸突变位于VP1蛋白的B-C环上，93、97位氨基酸突变位于CD-Ⅱ环上，这可能改变SVA的细胞嗜性，增强SVA的致病性，但这需要深入的基础研究来证实。
4 结论通过实验室诊断方法鉴定了SVA引起的水疱性疾病。通过对SVA分离株CH/FuJ1/2017株VP1基因的系统发育分析和变异分析，初步阐述了分离毒株的遗传演化关系及VP1蛋白的氨基酸突变，对了解我国SVA的起源、遗传演化等具有一定的帮助。
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