脓毒血症(sepsis)是由炎症感染引起的全身性炎症反应综合征，其特征是伴随炎症、凝血和纤维蛋白溶解级联反应发生[1]。在临床兽医学领域，动物脓毒血症主要继发于犬、猫子宫蓄脓、脓皮症及严重外科感染等过程中，如不及时治疗将导致多器官衰竭，最终致使患畜死亡。近年来，由革兰阴性菌细胞壁中的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)为主要致病因素引起的脓毒血症的发病率逐年上升，造成机体多组织、器官继发性损伤[2]，心脏是主要受侵害的靶器官之一[3-5]。相关研究表明，心脏功能障碍是脓毒血症病情加重及影响预后的重要因素之一，发生脓毒血症的动物超过70%会出现心脏功能障碍，随着病情恶化，导致死亡率升高[6]。
右美托咪定(dexmedetomidine, DEX)是一种新型的高选择性α2肾上腺素能受体激动剂，是美托咪定的活性右旋异构体[7]。DEX不仅具有镇静、镇痛、抗焦虑、抗交感、稳定血流动力学的作用，还具有心脏保护作用[8-11]。研究表明，DEX在心脏缺血再灌注损伤中通过抑制心血管手术中的交感神经反应，稳定血流动力学，降低患畜术后心肌梗死的发生率[12]。此外，DEX可减轻内毒素引起的氧自由基的产生和促炎因子的释放，并进一步抑制炎症介质的放大效应[13]。然而其在脓毒血症致心脏损伤中是否通过抑制NOX2的表达降低NLRP3炎症小体的活化尚有待研究。
1 材料与方法 1.1 实验动物及饲养饲养健康雄性SD大鼠30只，体重180~220 g，购自哈尔滨医科大学，进行标准化饲养管理，饲养温度控制在22~24 ℃，相对湿度50%~60%，保持室内光照12 h/12 h昼夜交替，保持通风良好，自由饮食饮水，所有大鼠饲养1周后进入正式试验。
1.2 主要试剂脂多糖(LPS，Sigma-Aldrich)，右美托咪定(DEX，Pfizer pharmaceutical Ltd.，U.S.)；血清心肌酶——肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。NOX2、NLRP3、IL-1β、IL-18抗体购自沈阳万类生物科技有限公司。
1.3 仪器设备3K-15高速低温离心机购自德国Sigma公司，Epoch2酶标仪购自美国BioTek公司，KD-3358组织切片机购自金华科尔诺电子科技有限公司，A101441通用型电泳仪、电泳及转膜装置均购自美国Bio-Rad公司，Tanon 5200化学发光分析系统购自上海天能生物科技有限公司，Forma(-80 ℃)超低温冰箱购自美国Thermo Fisher Scientific公司，Beckman 255型自动pH计购自美国Beckman公司，METTLER TOLEDO高压蒸汽灭菌器购自瑞士METTLER公司，ZE260微量电子天平购自杭州汇尔仪器设备有限公司，恒温培养摇床购自上海一恒科技有限公司，玻璃匀浆器购自南通市卫宁实验器材有限公司等。
1.4 实验动物分组及处理将30只健康SD大鼠随机均分为3组，分别是空白对照组(CON组)、模型组(LPS组)、DEX干预组(DEX组)。
LPS组腹腔注射10 mg·kg-1脂多糖；CON组腹腔注射与LPS组等容量的灭菌生理盐水；DEX组腹腔注射30 μg·kg-1右美托咪定，30 min后腹腔内再注射10 mg·kg-1 LPS。
1.5 取材及处理造模4 h后将所有大鼠放置于内充1.5%异氟醚和氧气自制透明麻醉箱进行化学保定。麻醉确实后，剖开腹腔，经腹主动脉采血4 mL，1 500 r·min-1离心15 min后收集血清，置于-80 ℃保存；麻醉确实后，剖开大鼠腹腔，显露心脏，沿主动脉根部分离心脏，用0.9%生理盐水灌洗心脏直至灌注液为清亮透明液体。除去心脏周围血管及结缔组织，沿房室沟剪去左心室和右心房，沿室间隔剪去右心室游离壁，沿垂直于心脏近心底区三分之一处剪取心肌组织，其中一部分浸入10%福尔马林溶液中，4 ℃固定48 h，乙醇梯度脱水，使用二甲苯透明，之后石蜡包埋，切片厚4~5 mm，HE染色，光学显微镜下进行观察；另一部分置于-80 ℃用于蛋白含量检测。
1.6 血清生化指标检测取血清液按试剂盒说明书分别检测CK、LDH的含量。
1.7 Western blot法测定炎症蛋白含量称取50 mg大鼠心脏组织，匀浆后取上清液备用，向蛋白质样本中按比例加入PAGE loading buffer，充分混匀，置于100 ℃沸水煮10 min使蛋白发生变性。通过制备分离胶和浓缩胶、电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育和化学自发光操作对NOX2、NLRP3、IL-1β及IL-18等相关蛋白表达量进行检测。
1.8 统计学处理采用SPSS 23.0统计学软件进行显著性分析。结果采用平均值±标准误(x+sx)表示，P＞0.05差异不显著，P < 0.05认为差异有统计学意义，P＜0.01差异极显著。
2 结果 2.1 血清中CK和LDH含量对血清中CK和LDH检测结果表明：与CON组比较，LPS组中该两项指标极显著升高(P < 0.01或P < 0.001)；与LPS组相比，DEX组CK、LDH含量显著降低(P < 0.05或P < 0.01)，CON组与DEX组比较，无统计学差异(P＞0.05)，具体试验结果见图 1。
|
与对照组(CON)比较，*. P < 0.05；**. P < 0.01；***. P < 0.001。与LPS组比较，#. P < 0.05；##.P < 0.01；###. P < 0.001。下图同 Compared with control group(CON), *. P < 0.05;**. P < 0.01;***. P < 0.001.Compared with LPS group, #. P<0.05;##. P < 0.01;###. P < 0.001. The same as below 图 1 血清CK、LDH水平 Fig. 1 Biochemical indicators of CK and LDH |
大鼠心肌组织病理学观察结果显示：与CON组相比，LPS组大鼠心肌细胞排列紊乱，间质水肿，心肌纤维间隔增宽(蓝色箭头所示)，心肌纤维断裂(绿色箭头所示)，红细胞渗出(黄色箭头所示)；DEX组与LPS组比较大鼠心肌组织损伤程度明显减轻，心肌细胞结构完整，心肌纤维排列整齐。结果见图 2。
|
a. CON组；b. LPS组；c. DEX组 a. Control group; b. LPS group; c. DEX group 图 2 心肌组织HE染色(400×) Fig. 2 HE staining of myocardial tissue(400×) |
试验结果显示，与CON组比较，LPS组大鼠心肌组织中NOX2表达量极显著增加(P < 0.001)，NLRP3炎症小体(P < 0.001)及IL-1β(P < 0.05)、IL-18 (P < 0.01)表达量显著或极显著增加；与LPS组比较，DEX组大鼠心肌组织NOX2(P < 0.01)、NLRP3 (P < 0.001)和IL-1β(P < 0.01)表达量极显著降低，IL-18表达量显著降低(P < 0.05)。结果见图 3。
|
图 3 NOX2、NLRP3、IL-1β和IL-18蛋白表达量 Fig. 3 Changes in proteins expression of NOX2, NLRP3, IL-1β and IL-18 |
脓毒血症是由多种感染因素导致的炎症反应综合征，LPS是其中的主要致病因素，并可导致心功能障碍，主要表现为心肌细胞炎症损伤[14]。本次试验发现，对大鼠注射LPS后，血清CK和LDH含量显著增高，同时心肌组织切片也观察到心肌纤维间隔增宽，心肌纤维断裂和红细胞渗出等现象，这表明LPS引起大鼠心脏功能改变和器质性损伤，脓毒血症致大鼠心脏损伤模型制造成功[15-16]。以往研究表明，氧化应激和炎症反应是脓毒血症致心脏损伤的主要致病机制。心脏发生损伤时常伴有大量的活性氧产生，另有研究表明，NADPH氧化酶的激活可导致ROS生成增多[17]。ROS大量积聚引发机体内源性氧化应激反应，并进一步促进炎性因子的释放，加剧炎症反应。在体外试验，LPS可诱导原代小胶质细胞NLRP3炎症小体的活化[18]。另外，中性粒细胞内NADPH氧化酶在脑缺血再灌注损伤引起的NLRP3活化过程中发挥了重要作用[19]。NOX2作为NADPH家族的重要亚型，在心脏组织中高度表达[20]。课题组在试验中观察到，使用LPS后，在大鼠心脏中NOX2、NLRP3、IL-18及IL-1β表达量显著增加，说明NOX2可能参与NLRP3的活化，进而增加炎症因子IL-18和IL-1β表达水平，介导炎症放大效应。综上所述，NOX2和NLRP3在LPS致心脏损伤的过程中发挥着重要的作用。
DEX是医学和兽医学临床中常用的药物，除具有镇静、止疼作用外，还具有抑制交感兴奋、调节免疫、抗感染等多重作用。本试验结果表明，DEX预处理后，LPS组大鼠血清中CK、LDH含量显著降低，心肌病理损伤也明显减轻，证明DEX可改善LPS诱导的心肌损伤。以往研究表明，DEX可通过下调NOX2表达量减轻糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤中的氧化损伤和炎症反应[21]。同时，DEX还能通过阻断NLRP3炎性小体的形成和活化在小鼠肺缺血-再灌注损伤模型中发挥抗炎作用[22]。本次试验进一步证实DEX预处理可显著降低NOX2、NLRP3、IL-1β及IL-18的表达量。综上所述，DEX在LPS诱导的心脏损伤中可能通过降低NOX2表达，进而抑制NLRP3炎症小体活化及下游IL-18、IL-1β炎症因子的表达，从而发挥心脏保护作用。
4 结论DEX可能通过抑制氧化应激相关酶NOX2介导的NLRP3炎症小体的激活，发挥抗氧化和抗炎作用，从而减轻LPS诱导的心肌损伤。
| [1] | KOCA U, OLGUNER Ç G, ERGÜR B U, et al. The effects of dexmedetomidine on secondary acute lung and kidney injuries in the rat model of intra-abdominal sepsis[J]. Sci World J, 2013, 2013: 292687. |
| [2] |
张录.右美托咪定对脓毒症大鼠炎症反应的作用及机制的研究[D].南昌: 南昌大学, 2018.
ZHANG L. The effect and the responding mechanism of dexmedetomidine on inflammatory response in rats with sepsis[D]. Nanchang: Nanchang University, 2018. (in Chinese) http://d.wanfangdata.com.cn/Thesis/y2422531 |
| [3] |
胡海涛, 胡衍辉. 脓毒血症对心肌损害的研究进展[J]. 实用临床医学, 2016, 17(10): 102–104.
HU H T, HU Y H. Research progress on myocardial damage caused by sepsis[J]. Practical Clinical Medicine, 2016, 17(10): 102–104. (in Chinese) |
| [4] |
李丹丹. 脓毒血症时心肌损伤和心肌标志物的研究进展[J]. 医学叙述, 2016, 22(2): 223–226.
LI D D. Research progress in cardiac marker of myocardial injury in sepsis[J]. Medical Recapitulate, 2016, 22(2): 223–226. (in Chinese) |
| [5] |
夏继辉, 徐世荣, 夏文胜, 等. 右旋美托咪定对脓毒血症大鼠心功能障碍的影响[J]. 中国循证心血管医学杂志, 2015, 7(6): 843–845.
XIA J H, XU S R, XIA W S, et al. Influence of dexmedetomidine on cardiac dysfunction in rats with sepsis[J]. Chinese Journal of Evidence-Based Cardiovascular Medicine, 2015, 7(6): 843–845. DOI: 10.3969/j.issn.1674-4055.2015.06.37 (in Chinese) |
| [6] | RUSSELL J A. Management of sepsis[J]. N Engl J Med, 2006, 355(16): 1699–1713. DOI: 10.1056/NEJMra043632 |
| [7] | DELLINGER R P, CARLET J M, MASUR H, et al. Surviving sepsis campaign guidelines for management of severe sepsis and septic shock[J]. Intensive Care Med, 2004, 30(4): 536–555. DOI: 10.1007/s00134-004-2210-z |
| [8] | MENDA F, KÖNER O, SAYIN M, et al. Dexmedetomidine as an adjunct to anesthetic induction to attenuate hemodynamic response to endotracheal intubation in patients undergoing fast-track CABG[J]. Ann Card Anaesth, 2010, 13(1): 16–21. DOI: 10.4103/0971-9784.58829 |
| [9] | SANDERS R D, SUN P, PATEL S, et al. Dexmedetomidine provides cortical neuroprotection: impact on anaesthetic-induced neuroapoptosis in the rat developing brain[J]. Acta Anaesthesiol Scand, 2010, 54(6): 710–716. |
| [10] | KOCOGLU H, OZTURK H, OZTURK H, et al. Effect of dexmedetomidine on ischemia-reperfusion injury in rat kidney: a histopathologic study[J]. Ren Fail, 2009, 31(1): 70–74. DOI: 10.1080/08860220802546487 |
| [11] | YANG C H, TSAI P S, WANG T Y, et al. Dexmedetomidine-ketamine combination mitigates acute lung injury in haemorrhagic shock rats[J]. Resuscitation, 2009, 80(10): 1204–1210. DOI: 10.1016/j.resuscitation.2009.06.017 |
| [12] |
钱何布. 右美托咪定的抗炎及器官保护作用研究进展[J]. 医学综述, 2015, 21(15): 2706–2709.
QIAN H B. Research advances in the anti-inflammatory and organ protection of dexmedetomidine[J]. Medical Recapitulate, 2015, 21(15): 2706–2709. DOI: 10.3969/j.issn.1006-2084.2015.15.007 (in Chinese) |
| [13] |
邓福谋, 张炳辉, 连芳, 等. 右美托咪定预处理对大鼠肠缺血再灌注损伤的保护效应[J]. 江西医药, 2018, 53(12): 1385–1387.
DENG F M, ZHANG B H, LIAN F, et al. Effect of dexmedetomidine pretreatmenton intestinal ischemia-reperfusion injury in mice[J]. Jiangxi Medical Journal, 2018, 53(12): 1385–1387. DOI: 10.3969/j.issn.1006-2238.2018.12.009 (in Chinese) |
| [14] |
周明明, 蒋正英, 李蕊, 等. 白藜芦醇对脓毒血症所诱导大鼠心肌损伤的保护作用及其机制研究[J]. 免疫学杂志, 2018, 34(12): 1053–1058.
ZHOU M M, JIANG Z Y, LI R, et al. Protective effects and mechanism of resveratrol on myocardial injury induced by sepsis in rats[J]. Immunological Journal, 2018, 34(12): 1053–1058. (in Chinese) |
| [15] |
李健玲, 朱小青, 李学敏, 等. 七氟醚预处理对LPS诱导的小鼠心功能障碍的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2012, 28(8): 1410–1414.
LI J L, ZHU X Q, LI X M, et al. Effects of sevoflurane preconditioning on myocardial dysfunction in lipopolysaccharide-challenged mice[J]. Chinese Journal of Pathophysiology, 2012, 28(8): 1410–1414. DOI: 10.3969/j.issn.1000-4718.2012.08.013 (in Chinese) |
| [16] |
刘海峰, 谢田田, 刘婷婷, 等. 黄芪多糖抑制IL-1β表达及改善脓毒症小鼠心功能研究[J]. 中国热带医学, 2018, 18(8): 757–760.
LIU H F, XIE T T, LIU T T, et al. Astragalus polysaccharides inhibits the expression IL-1β protein and improves the cardiac function of mice with sepsis[J]. China Tropical Medicine, 2018, 18(8): 757–760. (in Chinese) |
| [17] |
韩勇, 贺滟, 郭立荣, 等. 心肌缺血再灌注损伤大鼠中20-HETE对ROS生成及NADPH氧化酶活性的影响[J]. 现代医药卫生, 2016, 32(18): 2781–2784.
HAN Y, HE Y, GUO L R, et al. Effect of 20-HETE on ROS production and NADPH oxidase activity in rats with myocardial ischemia reperfusion injury[J]. Journal of Modern Medicine & Health, 2016, 32(18): 2781–2784. DOI: 10.3969/j.issn.1009-5519.2016.18.001 (in Chinese) |
| [18] |
刘富群, 高崎, 王丹丹, 等. 银杏酮酯抑制LPS/ATP诱导原代小胶质细胞NLRP3炎症小体的激活机制研究[J]. 中国中药杂志, 2018, 43(16): 3346–3352.
LIU F Q, GAO Q, WANG D D, et al. Effects of GBE50 on LPS/ATP induced NLRP3 inflammasome activation in primary rat microglia[J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2018, 43(16): 3346–3352. (in Chinese) |
| [19] |
任洪梁, 席宏杰. NADPH氧化酶2在脑缺血再灌注损伤中作用机制研究进展[J]. 现代药物与临床, 2017, 32(6): 1161–1164.
REN H L, XI H J. Research progress on mechanism of NADPH oxidase 2 in cerebral ischemia reperfusion injury[J]. Drugs & Clinic, 2017, 32(6): 1161–1164. (in Chinese) |
| [20] |
叶心怡, 陈刚领, 刘晗, 等. 中性粒细胞NADPH氧化酶与组织缺血再灌注关系的研究进展[J]. 现代生物医学进展, 2017, 17(32): 6380–6385.
YE X Y, CHEN G L, LIU H, et al. Advances in study on relationship between neutrophil nadph oxidase and tissue ischemia reperfusion[J]. Progress in Modern Biomedicine, 2017, 17(32): 6380–6385. (in Chinese) |
| [21] | ZENG X Z, WANG H L, XING X C, et al. Dexmedetomidine protects against transient global cerebral ischemia/reperfusion induced oxidative stress and inflammation in diabetic rats[J]. PLoS One, 2016, 11(3): e0151620. DOI: 10.1371/journal.pone.0151620 |
| [22] |
梁磊, 邓林, 谢冕, 等. 右美托咪定通过Toll样受体4减轻小鼠肺缺血/再灌注损伤[J]. 基础医学与临床, 2018, 38(7): 967–972.
LIANG L, DENG L, XIE M, et al. Dexmedetomidine decreases TLR4 expression to alleviate lung ischemia/reperfusion injury in mice[J]. Basic & Clinical Medicine, 2018, 38(7): 967–972. DOI: 10.3969/j.issn.1001-6325.2018.07.013 (in Chinese) |