畜牧兽医学报  2019, Vol. 50 Issue (9): 1912-1919. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2019.09.020    PDF    
引用本文
裴若男, 杨帆, 廖建昭, 马飞洋, 马欣艳, 林毓茵, 姚启发, 唐兆新, 梁昭平. 高铜日粮对肉鸡肾氧化损伤和Nrf2信号通路相关基因表达的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(9): 1912-1919.  
PEI Ruonan, YANG Fan, LIAO Jianzhao, MA Feiyang, MA Xinyan, LIN Yuyin, YAO Qifa, TANG Zhaoxin, LIANG Zhaoping. The Effect of High Dietary Copper on Oxidative Damage and Expression of Nrf2 Signaling Pathway Related Genes in the Kidneys of Broilers[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2019, 50(9): 1912-1919.  
高铜日粮对肉鸡肾氧化损伤和Nrf2信号通路相关基因表达的影响
裴若男1, 杨帆1,2, 廖建昭1, 马飞洋1, 马欣艳1, 林毓茵1, 姚启发1, 唐兆新1, 梁昭平1     
1. 华南农业大学兽医学院, 广州 510642;
2. 江西农业大学动物群发性疾病监测与防控研究所, 南昌 330045
收稿日期：2019-03-05
基金项目：国家自然科学基金（31572585）；“十三五”国家重点研发计划项目（2016YFD0501205；2017YFD0502200）
作者简介：裴若男(1996-), 女, 硕士, 河南南阳人, 主要从事畜禽营养代谢病与中毒病研究, E-mail:yanguo926486@163.com;
杨帆(1991-), 男, 博士, 江西景德镇人, 主要从事畜禽营养代谢病与中毒病研究, E-mail:yfan2014001@163.com。二人为同等贡献作者.
通信作者：唐兆新, 主要从事畜禽营养代谢病与中毒病研究, E-mail:tangzx@scau.edu.cn; 梁昭平, 主要从事兽医学相关研究, E-mail:liangzhaoping@gzscbm.com.
摘要：为了研究高铜日粮对肉鸡肾氧化损伤和Nrf2信号通路相关基因表达的影响，选用48只1日龄健康白羽肉鸡，随机分为4组，每组12只，分别喂以基础日粮（Cu 11 mg·kg-1，对照组）和高铜日粮（Cu 110 mg·kg-1，高铜Ⅰ组；Cu 220 mg·kg-1，高铜Ⅱ组；Cu 330 mg·kg-1，高铜Ⅲ组），并于49日龄采集肾组织作为样品，制作组织切片观察肾病理变化，检测超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽还原酶（GR）和总抗氧化能力（T-AOC）等指标的变化，并通过实时荧光定量PCR检测核转录相关因子2（Nrf2）、谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）、谷氨酰半胱氨酸合成酶修饰亚基（GCLM）、血红素氧化酶（HO-1）、NAD（P）H醌氧化还原酶1（NQO1）的mRNA相对转录量。结果显示，高铜组肉鸡的肾间质变宽，肾小管上皮细胞出现脱落；高铜Ⅲ组肾的T-AOC、SOD和GR活性与对照组相比显著下降；MDA含量无显著变化；高铜Ⅱ组和高铜Ⅲ组Nrf2和GCLC mRNA相对转录量与对照组相比显著升高，高铜组GCLM和HO-1 mRNA相对转录量与对照组相比显著上调，而NQO1 mRNA的相对转录量则无显著变化。结果表明，高铜日粮可诱导肉鸡肾发生氧化损伤和Nrf2信号通路相关基因的表达。
关键词：铜    氧化损伤    Nrf2信号通路    肾    肉鸡    
The Effect of High Dietary Copper on Oxidative Damage and Expression of Nrf2 Signaling Pathway Related Genes in the Kidneys of Broilers
PEI Ruonan1, YANG Fan1,2, LIAO Jianzhao1, MA Feiyang1, MA Xinyan1, LIN Yuyin1, YAO Qifa1, TANG Zhaoxin1, LIANG Zhaoping1     
1. College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;
2. Institute of Animal Population Disease Surveillance and Prevention & Control, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China
Abstract: In order to investigate the effect of high dietary copper on oxidative damage and expression of Nrf2 signaling pathway related genes in the kidneys of broilers, 48 one-day-old healthy white feather broilers were randomly divided into 4 groups with 12 each in this study. The birds were fed with basal diets (Cu 11 mg·kg-1, the control group), and high-copper diets (Cu 110 mg·kg-1, the high-copper group Ⅰ; Cu 220 mg·kg-1, the high-copper group Ⅱ; Cu 330 mg·kg-1, the high-copper group Ⅲ, respectively). On day 49, the kidneys were collected for histopathology examination. The activities of superoxide dismutase (SOD), glutathione reductase (GR), and total antioxidant capacity (T-AOC); and the content of malondialdehyde (MDA) were detected. Additionally, mRNA levels of nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2), glutamate cysteine ligase catalytic subunit (GCLC), glutamate cysteine ligase modifier subunit (GCLM), hemeoxygenase-1 (HO-1), and NAD (P) H quinone oxidoreducetase 1 (NQO1) were measured using real-time quantitative PCR (RT-qPCR). The results showed that widen renal interstitial and exfoliated renal tubular epithelial cells were observed in the high-copper groups. Additionally, the activities of SOD, GR, and T-AOC in the high-copper group Ⅲ were significantly decreased compared to those in the control group, but there was no significant change in the content of MDA. Moreover, mRNA levels of Nrf2 and GCLC in the high-copper group Ⅱ and the high-copper group Ⅲ were markedly higher than those in the control group, and mRNA levels of GCLM and HO-1 up-regulated with the increase of dietary copper, but NQO1 mRNA level did not significantly changed. The results suggest that high dietary copper can induce oxidative damage and the expression of Nrf2 signaling pathway related genes in the kidneys of broilers.
Key words: copper     oxidative damage     Nrf2 signaling pathway     kidney     broiler    

铜(copper，Cu)是动物机体必需的微量元素之一，参与机体细胞色素C氧化酶以及超氧化物歧化酶等多种酶的构成，在机体造血机能、增强抵抗力、酶的催化反应以及促进生长等方面具有重要作用，但过量铜可诱导机体产生氧化损伤[1]。而超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase，GR)是机体重要的抗氧化酶，常被用以评价机体的抗氧化水平，丙二醛(MDA)常被用于评价机体的氧化损伤[2]。且肾作为铜的主要靶器官之一，过量的铜蓄积会造成肾形态结构变化和正常生理功能降低[3]。正常生理状态下，机体存在的抗氧化防御系统可有效防止脂质过氧化[4]。机体在发生氧化应激时产生大量的活性氧，发生氧化损伤的同时也影响着机体的抗氧化功能[5]。研究表明抗氧化功能可由多种机制进行调控，而在近年来研究发现，核转录相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是机体氧化应激反应中的关键因子，在氧化应激状态下可快速表达继而对抗氧化反应[6]。铜可对机体肾产生氧化损伤，但其是否能影响Nrf2信号通路相关基因的表达尚不清楚。氧化应激效应会导致许多疾病的发生，因此本研究以白羽肉鸡为试验动物，通过饲喂高铜日粮并于49日龄采集肾组织，制作组织切片并检测相关的氧化指标和抗氧化指标以及Nrf2通路上相关基因的表达，从分子和病理变化两个层面上研究铜暴露诱发氧化损伤的机制，进而探讨高铜是否可通过Nrf2信号通路相关基因的表达诱导肉鸡肾的氧化损伤。

1 材料与方法 1.1 试验动物及处理

从某种鸡场购入1日龄白羽肉鸡48只，常规免疫，人工控温，24 h光照，自由采食及饮水。将48只肉鸡随机分为4组，每组12只。选用无水硫酸铜作为铜源，肉鸡基础日粮根据NRC(1994)家禽营养需要配制，其中日粮组成与营养水平见表 1。基础日粮对照组含铜量为前期试验[7]推荐的11 mg·kg-1，试验高铜组日粮含铜量为此标准的10、20和30倍，即110(高铜Ⅰ组)、220(高铜Ⅱ组)、330 mg·kg-1(高铜Ⅲ组)。在相同条件下饲喂49 d，静脉注射戊巴比妥(50 mg·kg-1)麻醉后立即采集肾组织，生理盐水洗去表面血液，一部分经液氮速冻后及时放入-80 ℃冰箱保存待检，一部分切成5 mm×5 mm的方块浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定。

表 1 肉鸡基础日粮组成和营养水平 Table 1 Diet composition and nutrients levels for broilers
1.2 试验试剂和仪器

无水硫酸铜(分析纯)购自天津大茂化学试剂厂；多聚甲醛(paraformaldehyde)购自美国Sigma公司；切片石蜡、中性树胶购自国药集团公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽还原酶(GR)和总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；Trizol、PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser购自日本TaKaRa公司；SYBR GREEN购自美国Vazyme公司；其他试剂均为国产分析纯。

WFJ-2000型可见分光光度计，购自上海洪福仪器仪表有限公司；TDZ5-WS型冷冻离心机，购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；MyCyclerTMThermal型基因扩增仪，购自美国Bio-Rad公司；LightCycler480型荧光定量PCR仪，购自美国Bio-Rad公司；ELx808型酶标仪，购自美国BIOTECK公司；Unique-R10型超纯水仪，购自厦门锐思捷科学仪器有限公司；H-5700型显微镜购自日本日立公司；Nanodrop-2000型微量紫外分光光度计，购自美国Thermo Fisher科技公司。

1.3 制备石蜡切片

将至少固定3 d的肾组织放入包埋盒中，流动自来水冲洗过夜，然后脱水、透明、透蜡、包埋、切片、苏木精-伊红染色、中性树脂封片，用光学显微镜观察肾组织的病理学变化。

1.4 检测肾的氧化指标与抗氧化指标

从-80 ℃冰箱中取质量约100 mg的冻肾样，用生理盐水按照1:9比例在匀浆器中匀浆，在4 ℃离心机中590 g离心10 min，取上清液检测SOD活力、GR活力、MDA含量和T-AOC。测定过程严格按照说明书进行。

1.5 检测Nrf2通路相关基因的转录

采用实时荧光定量PCR方法。总RNA的提取按照Trizol试剂盒说明书进行操作。利用NanoDrop-2000微量核酸测定仪检测RNA的总浓度和纯度。从GenBank中获得所测基因的序列，并选用管家基因GAPDH基因作为内参基因。最终由上海生工生物有限公司合成。引物序列见表 2。

表 2 引物序列 Table 2 Primer sequences

RNA反转录严格按照试剂盒说明书进行。将反转后的cDNA采用染料法进行RT-qPCR反应，反应体系为10 μL：cDNA 1 μL，SYBR premix Ex TaqTM 5 μL，ddH2O 3.2 μL，引物F/R均为0.4 μL。反应条件：预变性95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s；共进行40个循环，检测Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC和GCLM mRNA转录水平。

1.6 统计分析

所测基因的Ct值用2-ΔΔCt法进行初步处理，应用统计学软件SPSS 17.0进行统计分析，用t检验比较其差异显著性。并用Graphpad Prism 6.0软件作图，结果以x±s表示。

2 结果 2.1 肉鸡肾组织病理学观察

由图 1A可看出，在对照组的肾组织中，肾小管的间隙较为致密，细胞形态正常，无变性坏死、脱落现象。而在图 1B可看出，高铜Ⅰ组中的肾小管之间的间隙相比对照组略微变宽，并且有少量的肾小管上皮细胞出现空泡变性、脱落现象。在图 1C中可观察到高铜Ⅱ组的肾小管间的间隙更为稀疏；而在图 1D中可明显观察到，高铜Ⅲ组中的肾小管上皮细胞呈现大面积的脱落，且有空泡变性、坏死现象。

A.对照组；B.高铜Ⅰ组；C.高铜Ⅱ组；D.高铜Ⅲ组；a.肾小管间隙变大；b.肾小管上皮脱落；c.肾小管上皮空泡变性 A. Control group; B. High-copper group Ⅰ; C. High-copper group Ⅱ; D. High-copper group Ⅲ; a. Enlargement of renal tubular space; b. Renal tubular epithelial exfoliation; c. Vacuolar degeneration of renal tubular epithelium 图 1 肾组织病理学观察 Fig. 1 Pathological observation of kidney tissue in broiler
2.2 铜对肉鸡肾氧化指标与抗氧化功能指标的影响

由图 2A可看出，肉鸡肾高铜Ⅱ组和高铜Ⅲ组的T-AOC与对照组相比显著下降(P < 0.05)。由图 2B可看出，高铜组与对照组相比MDA含量无显著变化(P>0.05)。由图 2C和D可看出，高铜Ⅲ组与对照组相比SOD和GR活性下调，且差异显著(P < 0.05)。

A. T-AOC；B. MDA含量；C. SOD活力；D. GR活力。相同字母表示不同组别间差异不显著(P>0.05)，不同字母表示不同组别间较差异显著(P < 0.05) A. T-AOC; B. MDA content; C. SOD activity; D. GR activity. The same letter indicates that there is no significant difference among different groups (P>0.05), the different letters indicate significant differences among different groups (P < 0.05) 图 2 高铜对肉鸡肾氧化与抗氧化指标的影响 Fig. 2 Effect of high-copper on kidney oxidant and antioxidant indices in broilers
2.3 铜对肉鸡肾Nrf2信号通路相关基因相对表达量的影响

由图 3A可看出，随着日粮中铜含量的升高，高铜Ⅱ、Ⅲ组Nrf2 mRNA相对表达量与对照组相比显著上调(P < 0.05)，而高铜Ⅲ组与高铜Ⅱ组相比Nrf2 mRNA相对表达量下降显著(P < 0.05)；由图 3B可看出，高铜Ⅱ组和高铜Ⅲ组GCLC mRNA相对表达量与对照组相比显著上升(P < 0.05)；由图 3C可看出，高铜组GCLM mRNA相对表达量与对照组相比升高，差异显著(P < 0.05)；由图 3D可看出，高铜组与对照组相比HO-1 mRNA相对表达量显著上调(P < 0.05)，而高铜Ⅲ组与高铜Ⅱ组相比下降显著(P < 0.05)；由图 3E可看出，随着日粮中铜含量的升高，NQO1 mRNA相对表达量无显著差异(P>0.05)。

A. Nrf2；B. GCLC；C. GCLM；D. HO-1；E. NQO1。相同字母表示不同组别间差异不显著(P>0.05)，不同字母表示不同组别间较差异显著(P < 0.05) A. Nrf2; B. GCLC; C. GCLM; D. HO-1; E. NQO1. The same letter indicates that there is no significant difference between different groups (P>0.05), the different letters indicate significant differences between different groups (P < 0.05) 图 3 高铜对肉鸡肾Nrf2通路相关基因相对转录量的影响 Fig. 3 Effect of high-copper on the mRNA expression of Nrf2 pathway related genes
3 讨论

动物摄入过量的铜会造成机体铜中毒，而肾作为肉鸡铜中毒的主要靶器官之一，会产生一系列的病理组织学变化，如肾小管上皮细胞发生空泡变性、脱落，肾小管间间隙稀疏等[8]。铜分布于体内各种组织器官，构成细胞色素氧化酶和铜蓝蛋白等多种酶，且参与机体清除自由基、氧化磷酸化等作用。铜对多种酶活力以及抗氧化功能都有影响，高水平的铜会引起组织产生氧化应激，抗氧化酶活性降低，从而影响机体的抗氧化功能[9-10]。作为衡量机体抗氧化系统功能的综合性指标，T-AOC可通过分解自由基和减少脂质过氧化来维持机体氧化还原的平衡状态[11]。SOD为自由基清除剂，它广泛存在于生物体的各种组织中，能清除超氧阴离子自由基(O2-)。O2-具有细胞毒性，可导致脂质过氧化[12-13]。SOD将有害的O2-在酶的作用下转化成无害的水，从而保护机体免受氧化损伤[14]。MDA是氧化应激的终产物，其含量可反映机体脂质过氧化的程度[15]，因此也是常用的过氧化指标。GR是机体抗氧化体系的重要组成部分，可将氧化型谷胱甘肽还原成还原型谷胱甘肽，后者可以清除自由基以及一些过氧化物，防御机体氧化损伤[16]。刘好朋等[17]用高铜饲喂商品代科宝肉鸡50 d，发现当日粮中铜含量为330和550 mg·kg-1时，肉鸡血清SOD、GR和T-AOC显著下降，MDA含量显著上升，提示过量的铜导致抗氧化酶活性的下降，脂质过氧化程度加剧，继而MDA含量增多。本试验中，随着日粮中铜含量的增加，肾的肾小管之间间隙变宽，肾小管上皮细胞出现空泡变性、脱落现象，并且饲喂了高铜日粮的肉鸡肾T-AOC水平下降，GR以及SOD活性显著降低，MDA含量升高，表明饲喂了高铜日粮的肉鸡肾中氧化应激产物增多，与刘好朋等的研究成果相符合。由此可知，高铜日粮诱导了肉鸡肾氧化损伤。

顺式转录调控元件(antioxidant response element，ARE)可与Nrf2结合而激活该序列的基因转录。启动子区域具有顺式作用元件的基因包括：HO-1、GCLC、GCLM和NQO1[18]。

Nrf2介导氧化还原途径调节抗氧化酶及基因的表达，从而增加细胞对氧化应激的抗性。正常生理条件下，Nrf2和细胞骨架相关蛋白Keap 1以二聚体形式存在于细胞质中，使抗氧化物处于基础表达水平[19-20]。血红素氧合酶-1(HO-1)是一种由Nrf2调节的内源性抗氧化酶，可催化生成胆红素，胆红素有清除多种自由基的能力，避免其堆积造成细胞损伤[21-22]。HO-1正常状态下低水平表达，在各种应激刺激下被诱导表达而发挥内源性保护作用，从而减轻组织的氧化应激[23]。NADPH:苯醌氧化还原酶-1(NADPH: quinine oxidoreductase-1, NQO1)，降解醌及其衍生物，从而保护细胞对抗氧化还原，NQO1激活可引起氧化应激[24]。谷氨酸-半胱氨酸连接酶(glutamate-cysteine ligase，GCL)是谷胱甘肽(GSH)合成过程中的限速酶，GCL由催化亚基(GCL catalytic subunit，GCLC)和修饰亚基(GCL modifier subunit，GCLM)组成，前者有催化活性，后者有重要调节功能[25]。吕航等[26]用亚砷酸钠对雄性野生型C57BL/6小鼠进行腹腔注射，发现用5 mg·kg-1亚砷酸钠染毒6 h的小鼠主动脉Nrf2、GCLC、GCLM和NQO1 mRNA相对表达水平呈上升趋势，提示砷可引起小鼠主动脉氧化应激。本试验结果表明，当日粮中铜含量为220和330 mg·kg-1时，Nrf2 mRNA相对表达量与对照组相比显著升高，GCLC、GLCM和HO-1 mRNA相对表达量显著上调，说明肉鸡随着日粮中铜含量增加，机体处于对抗氧化应激的状态，与吕航等的研究成果基本相符。

4 结论

高铜日粮可引起肉鸡肾发生氧化损伤，并诱导肾Nrf2信号通路相关基因的表达。

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