弓形虫又称刚地弓形虫(Toxoplasma gondii,T. gondii),是一种专性细胞内寄生原虫[1],能够感染几乎所有的温血动物,包括人和鸟类[2]。弓形虫病是由弓形虫感染所引起的食源性人兽共患寄生虫病,全世界大约有三分之一的人口感染此病[3-6]。在正常情况下,人感染弓形虫多为隐性感染,但免疫缺陷病人(如HIV感染者、器官移植患者和恶性肿瘤患者等)感染弓形虫常造成严重的危害[2, 7-8]。另外,孕妇怀孕期间初次感染弓形虫可能会引起流产、畸胎、死胎等和儿童神经系统发育障碍等情况[9]。同时,弓形虫病对畜牧业生产也造成了严重的经济损失[10]。
弓形虫SAG1,又称P30,是仅表达于弓形虫速殖子阶段的表面抗原,在介导弓形虫速殖子入侵细胞过程中具有重要的作用[11]。氨基葡聚糖(glycosaminoglycans,GAGs)是广泛分布于脊椎动物细胞表面的无支链多糖[12],可分为肝素/硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)、软骨素/硫酸软骨素(chondroitin sulfuric acid,CSA)及透明质酸等。研究发现,HS可抑制弓形虫在细胞内的发育[13],且弓形虫分泌蛋白质(微线体蛋白质、棒状体蛋白质和致密颗粒蛋白质)能够与宿主细胞表面肝素/HS结合并参与弓形虫对宿主细胞的入侵[14-16]。在本研究中,原核表达并纯化重组蛋白质GST-SAG1,分析其与宿主细胞表面的硫化肝素黏附的特性,验证这种黏附可否被外源肝素竞争抑制,进而阻断弓形虫对宿主细胞的入侵,拟揭示弓形虫表面抗原SAG1作为弓形虫入侵的重要因子在虫体入侵过程中与宿主细胞表面硫化肝素的互作关系,同时也为进一步阐明肝素在弓形虫入侵过程中的分子机制奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 载体、虫株、细胞和小鼠pGEX-4T-1载体、弓形虫ME49株、HEK293A和Vero细胞系均由本实验室保存;SPF级BALB/c小鼠购自辽宁长生生物技术有限公司。
1.1.2 主要试剂GST-Tag Mouse Monoclonal Antibody和AP-labeled Goat Anti-Mouse IgG (H+L)购自碧云天公司;Alexa FlourTM 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)购自Thermo Scientific公司;Gluthathione-SepharoseTM 4B购自GE Healthcare公司;Heparin购自Solarbio公司;DMEM培养基购自Hyclone;胎牛血清购自以色列BI公司。
1.2 方法 1.2.1 引物的设计与合成根据弓形虫专业网站ToxoDB查找SAG1基因序列(基因号:TGME49_233460),设计扩增SAG1基因全长的特异性引物,SAG1-F:5′-GGAATTCATGTCGGTT-TCGCTGCACCAC-3′(EcoRⅠ),SAG1-R:5′-CC-GCTCGAGCGCGACACAAGCTGCGATACA-3′ (XhoⅠ),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.2.2 SAG1基因的克隆将弓形虫ME49株接种Vero细胞,传三代,待毒力稳定后收集虫体,提取DNA。利用设计的特异性引物,以DNA为模板,PCR扩增SAG1基因,采用25 μL反应体系:10 μL 2×PCR Taq Mix Buffer,1 μL SAG1-F,1 μL SAG1-R,2 μL DNA,11 μL ddH2O;反应程序:94 ℃预变性4 min;94 ℃变性30 s,68 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,30个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。胶回收PCR产物,将获取的目的片段与克隆载体pMD19-T进行连接、转化,挑取单克隆菌株,菌落PCR并测序。将测序正确的单克隆菌株命名为pMD-SAG1。
1.2.3 原核表达载体pGEX-SAG1的构建pMD-SAG1和pGEX-4T-1分别用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切,切胶回收目的片段和载体片段,使用T4连接酶16 ℃连接过夜;将连接产物转化、筛选单克隆并测序,获得阳性单克隆菌pGEX-SAG1;再将pGEX-SAG1质粒转化至大肠杆菌BL21 CodonPlus-RIPL表达感受态细胞中,获得原核表达菌pGEX-SAG1。
1.2.4 重组蛋白质GST-SAG1的表达与纯化将原核表达菌pGEX-SAG1划线接种至含Amp抗性的固体培养基中培养,再挑取单克隆菌液体摇菌、扩大再培养并进行诱导表达。利用0.5 mmol·L-1 IPTG在16 ℃条件下过夜诱导菌体表达重组蛋白质,收集菌体并超声破碎,使用Gluthathione-SepharoseTM 4B磁珠纯化可溶性重组蛋白质GST-SAG1。纯化的重组蛋白质使用1×PBS透析并对其进行SDS-PAGE和Western blot验证。
1.2.5 肝素结合和竞争抑制试验分别将40 μL Heparin-sepharose和Sepharose与纯化的5 nmol GST-SAG1混合在1 mL 1×PBS体系中,4 ℃感作1 h;GST蛋白质作为阴性对照,进行同样处理。用1×PBS将上述处理的珠子洗涤4次,500×g离心5 min,弃上清;加入40 μL 1×SDS-PAGE loading buffer,混匀后煮沸10 min,5 000 r·min-1离心5 min,取上清进行Western blot分析。GST-Tag Mouse Monoclonal Antibody(1:5 000)为一抗,AP-labeled Goat Anti-Mouse IgG (H+L)(1:5 000)为二抗。
分别将不同浓度的肝素/硫酸软骨素(终浓度10、1、0.1、0.01、0.001和0.000 1 mg·mL-1)与纯化的5 nmol GST-SAG1混合在1 mL 1×PBS体系中,4 ℃感作30 min。再各加40 μL Heparin-sepharose,4 ℃感作1 h。随后,处理珠子和Western blot分析方法同上述操作。
1.2.6 细胞黏附试验分别将铺至爬片上的HEK293A和Vero细胞与纯化的5 nmol GST-SAG1和GST室温感作1 h,1×PBS洗涤3遍,冷甲醇固定20 min,3% BSA 37 ℃封闭1 h,随后用GST-Tag Mouse Monoclonal Antibody(1:5 000)孵育1 h,1×PBS洗涤3遍,再用Alexa FlourTM 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)(1:500)孵育30 min,DAPI染色,封片晾干后观察细胞荧光情况。
分别将刮下的HEK293A和Vero细胞与5 nmol GST-SAG1和GST室温感作1 h,1×PBS洗涤3遍,弃上清;加入40 μL 1×SDS-PAGE loading buffer,混匀后煮沸10 min,5 000 r·min-1离心5 min,取上清进行Western blot分析。GST-Tag Mouse Monoclonal Antibody(1:5 000)为一抗,AP-labeled Goat Anti-Mouse IgG (H+L)(1:5 000)为二抗。
1.2.7 肝素阻断虫体入侵试验分别将收集的活力良好的弓形虫RH株虫体与10 mg·mL-1肝素、10 μg·mL-1肝素和等体积1×PBS室温感作1 h。将2×105个上述虫体分别加至90%汇合度的Vero细胞爬片的6孔板中,每组3个重复。将上述细胞置于CO2培养箱中37 ℃培养4 h,用1×PBS将相应组孔中未入侵的虫体全部洗去;继续培养12 h后用冷甲醇固定。用吖啶橙(母液1:2 000稀释)染色10 s,弃去染色液,用1×PBS洗1遍,吸干PBS,封片后置于荧光显微镜下分别计数视野中细胞数和纳虫空泡数,计算和统计虫体的入侵率。虫体入侵率=纳虫空泡数/细胞数。
同时,将40只BALB/c小鼠随机分成4组,每组10只,按100个·只-1(200 μL)的剂量腹腔注射不同浓度肝素孵育的虫体(按照上述体外处理的条件),并设置注射10 mg·mL-1(200 μL)肝素为阴性对照组;观察并统计小鼠的存活时间。
2 结果 2.1 弓形虫SAG1基因的克隆利用设计的SAG1基因的特异性引物,以弓形虫ME49株DNA为模板,经PCR扩增并连接至pMD19-T载体进行测序。1%琼脂凝胶电泳结果可见特异性条带(图 1),片段大小为1 011 bp,与预期片段相符且无碱基突变、缺失或增添。结果表明,已成功将弓形虫SAG1基因克隆至pMD19-T载体,获得pMD-SAG1载体。
通过酶切连接,将目的基因SAG1连接至pGEX-4T-1。经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切、PCR扩增和测序验证(图 2),结果表明已成功将SAG1基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,获得重组原核表达载体pGEX-SAG1。
利用IPTG诱导表达菌pGEX-SAG1表达重组蛋白质并进行纯化,经SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示:重组蛋白质GST-SAG1在70~100 ku之间出现特异性新条带(图 3),表明已获得重组蛋白质GST-SAG1。
Heparin-sepharose和Sepharose分别与GST-SAG1和GST室温感作并通过Western blot分析。结果显示GST-SAG1能够和Heparin-sepharose发生结合但不能与Sepharose结合,而GST不能与肝素结合(图 4A);竞争抑制试验发现,随着肝素浓度的增加,GST-SAG1与肝素的结合量逐渐减少(图 4B);但CSA浓度增加时,未发现GST-SAG1与肝素的结合有明显的变化(图 4C)。
分别将HEK293A和Vero细胞与GST-SAG1和GST室温感作并通过IFA(indirect immunofluorescence assay)和Western blot分析。IFA结果显示:与GST-SAG1感作的HEK293A(或Vero)细胞表面有特异性绿色荧光,与GST感作的HEK293A(或Vero)细胞未发现有荧光(图 5A、6A);Western blot结果显示:与GST-SAG1感作的HEK293A(或Vero)细胞检测出特异性目的条带,而与GST感作的HEK293A(或Vero)细胞未检测出条带(图 5B、6B)。结果表明SAG1能黏附HEK293A细胞和Vero细胞表面。
为探究弓形虫SAG1黏附宿主细胞表面的硫化肝素对虫体入侵宿主细胞的影响,进一步利用外源肝素封闭SAG1与硫化肝素的结合位点,并分析其对弓形虫入侵的阻断效果。体外试验结果显示,10 mg·mL-1肝素组弓形虫对宿主细胞入侵率极显著低于PBS组(P<0.01;图 7A、B),显著低于10 μg·mL-1肝素组(P<0.05;图 7A、B);10 μg·mL-1肝素组弓形虫对宿主细胞入侵率极显著低于PBS组(P<0.01;图 7A、B)。小鼠体内的肝素抑制试验结果显示,10 mg·mL-1肝素处理虫体组的小鼠存活时间比PBS处理虫体组小鼠显著延长(P<0.05;图 7C);腹腔注射肝素组的小鼠均存活且状态良好(图 7C)。结果提示,外源肝素可竞争抑制SAG1与宿主细胞表面硫化肝素结合,进而阻断弓形虫的入侵。
弓形虫入侵宿主细胞是一个快速(15~40 s)而复杂的过程,包括接触、滑翔运动、形成移动连接(MJ)及形成和修饰纳虫空泡膜(PVM)等[14, 17]。与弓形虫入侵相关的蛋白质主要有表面抗原、微线体蛋白质、棒状体蛋白质和致密颗粒蛋白质等。当弓形虫入侵宿主细胞时,虫体表面抗原与宿主细胞表面受体低亲和力结合,进而激活虫体内的磷脂酶C和核苷酸二磷酸核糖环化酶[18-19],引起虫体细胞质内的Ca2+浓度迅速升高[20],从而激发微线体蛋白质分泌[21],致使虫体继续进行一系列的入侵步骤。因此,接触是弓形虫入侵宿主细胞的第一步,且表面抗原在此过程中发挥着关键作用。氨基葡聚糖途径和唾液酸途径是顶复门原虫入侵宿主细胞的主要途径[22]。研究发现,硫化的氨基葡聚糖(如HS)是弓形虫入侵宿主细胞的主要受体[23]。弓形虫SAG1为速殖子主要表面抗原之一,推测其可能参与弓形虫与宿主细胞表面受体互作的过程,因此,本研究对SAG1黏附宿主细胞表面的HS进行了探讨。
本研究为了探索SAG1的肝素结合与细胞黏附功能,原核表达并纯化了重组蛋白质GST-SAG1,进行功能验证时,以GST蛋白质为阴性对照。弓形虫SAG1基因无内含子,开放阅读框核苷酸序列全长1 011 bp,预测编码的蛋白质相对分子质量大小约为37 ku,预测重组蛋白质GST-SAG1的相对分子质量大小约为63 ku。但本研究通过SDS-PAGE和Western blot检测,发现表达纯化出的重组蛋白质实际大小在70~100 ku且蛋白质能够被GST-Tag Mouse Monoclonal Antibody特异性识别。因为蛋白质是大肠杆菌原核表达,所以不存在糖基化等翻译后修饰,存在原因可能有:蛋白质趋向于二聚体形式导致相对分子质量增加,带负电荷氨基酸过多导致迁移率偏小,或者蛋白质的等电点PI小于缓冲液pH等。
目前,弓形虫入侵相关蛋白质与肝素/HS结合已被多次报道[24-25],本研究对弓形虫表面抗原(SAGs)与宿主细胞表面HS相互作用进行分析。通过肝素竞争抑制试验发现,肝素能够以浓度依赖的方式抑制SAG1与肝素结合,但CSA同样作为GAGs家族的一员,却未能抑制SAG1与肝素的结合,此结果表明,SAG1能够特异性地结合肝素。细胞黏附试验进一步证实了SAG1能够黏附到宿主细胞表面的硫化肝素。另外,通过外源肝素竞争与弓形虫SAG1的结合,可降低弓形虫对宿主细胞的入侵率,且肝素浓度越高,弓形虫的入侵率越低;小鼠体内试验也再次证明了肝素可抑制弓形虫的入侵,进而延长了小鼠的存活时间。研究结果提示,在弓形虫入侵过程中,SAG1参与黏附宿主细胞表面硫化肝素,这种黏附可被外源肝素竞争抑制,进而阻断弓形虫对宿主细胞的入侵;另外,肝素可能是弓形虫入侵宿主细胞的重要靶标。
4 结论弓形虫表面抗原SAG1参与黏附宿主细胞表面的硫化肝素并促进弓形虫的入侵。研究进一步揭示了弓形虫表面抗原SAG1作为弓形虫入侵的重要因子在虫体入侵过程中与宿主细胞表面硫化肝素的互作关系,同时也为进一步阐明肝素在弓形虫入侵过程中的分子机制奠定基础。
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