2. 勃林格殷格翰国际贸易(上海)有限公司, 上海 200131
2. Boehringer-Ingelheim, Shanghai 200131, China
牛支原体能够引起牛的支原体肺炎、关节炎、乳腺炎以及角膜炎等[1]，动物感染后治愈困难，在以呼吸道综合征为临床表现的犊牛中最为典型。1961年首次在美国从患有乳腺炎的病牛中分离到牛支原体[2]，1983年国内首次报道从患有乳腺炎的病牛中检出[3]，2008年辛九庆等[4]从患肺炎的犊牛肺中分离出该病原。牛支原体在世界范围内普遍存在，且传染性强，对欧美养牛业造成了巨大的经济损失，严重阻碍了全球养牛业的发展[5-7]。
目前关于牛支原体的分型方法有很多种，如扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)分析[8]、随机扩增多态性DNA技术(randomly amplified polymorphic DNA, RAPD)分析[9]、脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis, PFGE)分析[10]及多位点数目可变串联重复序列分析(multiple locus variable numbers tandem repeat analysis, MLVA)[11]等，但以上方法缺乏分型的普遍性、命名的统一性以及明确的解释，因此无法广泛应用于牛支原体分型[12]。多位点序列分型技术(multilocus sequence typing, MLST)是对多个管家基因的核酸序列进行分析，通过判断菌株管家基因核苷酸序列是否变异进行多样性比较分析。因其具有高分型率、高重现性、操作简便且有利于实验室之间交流比较等诸多优势，已被广泛应用于微生物流行病学检测和进化研究中[13]。作者主要对分离自黑龙江、河北、江苏、安徽、内蒙古等地区患呼吸道综合征犊牛的20株牛支原体进行MLST分析并与数据库中的牛支原体分离株进行比对，为牛支原体的流行和预防提供参考。
1 材料与方法 1.1 菌株来源2017—2018年采集黑龙江、河北、江苏、安徽、内蒙古等地规模化牛场327头病牛样品，检测分离出20株牛支原体(表 1)。
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表 1 牛支原体多位点序列分型 Table 1 The detection of MLST for M. bovis |
样品离心后经0.45 μm一次性针式滤器过滤，离心、弃上清、充分振荡混匀，接种于牛支原体液体和固体培养基。放置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养48~72 h。
参考石磊等[14]报道的方法合成检测牛支原体的引物序列及配制牛支原体培养基。PCR反应在40 μL体系中进行：Green Taq Mix 20 μL，ddH2O 14 μL，上游及下游引物各2 μL，模板DNA 2 μL。反应程序：94 ℃预变性10 min，94 ℃变性1 min，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环，72 ℃终延伸7 min。扩增产物使用10 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检测后通过凝胶成像系统扫描照相, 并送往金斯瑞生物科技有限公司测序。
1.3 多位点序列分型(MLST)分析目前，牛支原体多位点序列分型报道的管家基因体系有所差异。Register等[15]采用管家基因adh1、gltX、gpsA、gyrB、pta2、tdk、tkt作为分型体系；Rosales等[12]设计管家基因dnaA、metS、recA、tufA、atpA、ropD、tkt分型；Manso-Silván等[16]采用4种管家基因fusA、gyrB、lepA、rpoB分型。其中Register的分型体系报道较多[1, 17-18]，建立的开源数据库信息全面，数据量丰富，拟作为本次研究的分型参考。
参考Register等[15]的方法选取7个管家基因(adh1、gltX、gpsA、gyrB、pta2、tdk、tkt)设计引物并对本试验的分离株进行MLST分型。PCR反应在40 μL体系中进行：Green Taq Mix 20 μL，ddH2O 14 μL，上游及下游引物各2 μL，模板DNA 2 μL。反应程序如下：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃终延伸5 min, 并将扩增产物送往金斯瑞生物科技有限公司测序。将测序结果在数据库(https://pubmlst.org)中找出并沿用与测序基因组相同的等位基因号，在数据库中输入7个管家基因的等位基因号得到其对应的ST型并使用MEGA7软件进行进化树分析。
1.4 最小生成树(MST)分析对来自中国、美国、以色列、加拿大4个国家共105株牛支原体的MLST分型采用PHYLOViZ及geoBURST(eBURST)建立MST分析数列，分析我国牛支原体分离株与其他国家菌株的种群结构演化关系。
2 结果 2.1 分离培养与鉴定固体培养基经48~72 h培养后可见针尖状菌落，低倍显微镜下可见密集的“煎蛋”样菌落，中间厚四周薄(图 1)。液体培养在48 h后由红色变为黄色且澄清无浑浊。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳(图 2), 并将测序结果与NCBI中牛支原体的核酸序列进行同源性分析，综合鉴定为牛支原体特异性序列。
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图 1 牛支原体菌落形态(左.40×；右.100×) Fig. 1 Colony of the isolate MycbPAN005(left. 40×; right. 100×) |
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M. Trans2K DNA相对分子质量标准；1. MycbPAN001；2. MycbPAN003；3. MycbPAN004；4. MycbPAN005；5. MycbPAN006；6. MycbPAN007；7. MycbPAN008；8. MycbPAN009; 9. MycbPAN013；10. MycbPAN014；11. MycbPAN015；12. MycbPAN016；13. MycbPAN017；14. MycbPAN018；15. MycbPAN020；16. MycbPAN021；17. MycbPAN022；18. MycbPAN023；19. MycbPAN024；20. MycbPAN025；P.阳性对照；N.阴性对照 M. Trans2K DNA marker; 1. MycbPAN001; 2. MycbPAN003; 3. MycbPAN004; 4. MycbPAN005; 5. MycbPAN006; 6. MycbPAN007; 7. MycbPAN008; 8. MycbPAN009; 9. MycbPAN013; 10. MycbPAN014; 11. MycbPAN015; 12. MycbPAN016; 13. MycbPAN017; 14. MycbPAN018; 15. MycbPAN020; 16. MycbPAN021; 17. MycbPAN022; 18. MycbPAN023; 19. MycbPAN024; 20. MycbPAN025; P. Positive control; N. Negative control 图 2 牛支原体PCR电泳图 Fig. 2 Colony of M. bovis in liquid media |
MLST通过分析多个管家基因核心片段的核酸序列，对菌株的等位基因进行多样性比较，不同的菌株对应不同的序列型，从而判断菌株的变异情况[19]。本研究对牛支原体的7个管家基因进行MLST分析(表 1)。ST-10型在本次检测中占95%(19/20)，其管家基因按照“adh1、gltX、gpsA、gyrB、pta2、tdk、tkt”顺序排序分别为“4、3、2、3、5、3、4”。分离株MycbPAN005为ST-6型，其管家基因按上述顺序排序为“4、3、3、3、2、3、4 ”。根据UPMGA分析亲缘关系(图 3)，大部分菌株可分为A和B两大系。A系占全部菌株的92%(23/25)。B系仅包含ST-6型MycbPAN005分离株，而美国标准株PG45则处于A和B两个株系之外。
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图 3 多位点序列UPMGA进化树 Fig. 3 UPGMA dendrogram of MLST |
为研究我国牛支原体与其他国家相关分离株的关系，对美国、以色列、加拿大以及中国的105株牛支原体所提供的11种不同的ST型进行MST分析(图 4)。这些菌株可被分为2个克隆复合体(CC1、CC2)。克隆复合体是指一组相似的分离株，其中每个分离株至少与组中一个分离株的ST型共享7个等位基因中的5个[20]。CC1是主要克隆复合体，105株菌株中有103株属于该复合体。包括ST-10型以色列、美国、中国分离株；ST-32、ST-26和ST-43型中国分离株；ST-1、ST-30、ST-4型美国分离株；ST-2型加拿大分离株以及ST-6型中国、美国分离株。其余2株属于CC2克隆复合体，分别为ST-31型美国分离株和ST-17型美国标准株。
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图 4 最小生成树(MST)分析 Fig. 4 Minimum spanning tree |
牛支原体是一类无细胞壁，以二分裂或芽生方式进行繁殖的细菌，是目前已知能自行繁殖的最小的原核微生物[21]，在固体培养基上形成特征性的“煎蛋”样菌落。该病原通常存在于病牛的呼吸道，可以通过空气传播，导致健康牛群呼吸困难、呼吸抑制甚至窒息[22]。目前对于牛支原体的致病机制尚不明确，对其毒力因子的研究也十分缺乏[23]。但在牛的病原性支原体中，牛支原体的致病力仅次于丝状支原体丝状亚种，是导致牛呼吸道疾病综合征的重要病原之一[24-25]。据报道近年来在我国广西、甘肃、宁夏、江西、湖北、安徽、福建、湖南、河南、内蒙古、广州、山东等地均分离到致病性牛支原体[26-28]，提示由牛支原体感染导致的牛呼吸道疾病综合征在我国分布广泛，给我国养牛业带来了巨大的危害。本研究从黑龙江、河北、江苏、安徽、内蒙古等地患呼吸道疾病综合征病牛中成功采集、分离、培养出20株牛支原体，并对其种群结构和亲缘关系进行分析，其中ST-6型牛支原体中国株为首次报道，为中国牛支原体的流行病数据库研究提供了新的资料。
通过对牛支原体分离株7个管家基因的检测并结合我国目前报道的其他ST型对我国牛支原体的种群结构进行分析。绝大多数分离株属于ST-10型(20/24)，与Menghwar等[28]报道(42/44)基本一致，提示ST-10型是我国牛支原体的主要流行型。除ST-6型外，CQ-W70属于ST-32型，仅在gltX基因上与ST-10型存在差异；Hubei-1属于ST-26型，仅在tdk基因上与ST-10型存在差异；NHD0986属于ST-43型，仅在gyrB基因上与ST-10型存在差异，表明我国牛支原体的种群结构相对稳定单一。猜测我国牛支原体的这种高度同源性可能与国内北繁南养的肉牛饲养模式以及菌株的耐药性有关。由于牛支原体没有细胞壁，其致病性主要依赖膜蛋白，膜蛋白具有高度变异性，使牛支原体在面对来自宿主的不同选择压力时，不断变异以提高生存能力，具有逃避宿主免疫机制的能力，即使宿主产生了特异性免疫应答仍存在慢性或持续性感染的可能，从而导致牛支原体病不易被治愈[29]。β-内酰胺类抗生素对无细胞壁的牛支原体治疗无效，临床上常用大环内酯类、氟喹诺酮类和四环素类等抗生素对其进行治疗，由于不同地区对抗生素药物使用存在差异，除对大环内酯类药物耐药性比较普遍外，不同国家和地区分离的牛支原体的耐药谱均有不同[30]。我国牛支原体种群结构相对稳定且ST-10型为主要流行型这一结论，有利于牛支原体遗传进化的研究以及流行病学调查，对制定和实施我国牛支原体的长期监测及预防有参考作用。本文对牛支原体分离株的种群结构和亲缘关系进行分析，有助于掌握国内牛支原体基因型的分布情况，进一步完善牛支原体的种群结构及流行病数据库，以期对牛支原体相关疾病的快速诊断和有效防控措施的制定提供一定的帮助。
为了判断我国与其他国家牛支原体的亲缘关系，对中国、美国、以色列、加拿大4个国家共105株牛支原体进行MST分析。其中我国和以色列的牛支原体分型均集中于ST-10型，提示可能与两国之间地域、菌株流行趋势的相关性或畜群的贸易有关[12]。值得注意的是，此次在中国江苏检测分离到的ST-6型牛支原体，其管家基因按“adh1、gltX、gpsA、gyrB、pta2、tdk、tkt”排列为“4、3、3、3、2、3、4”，与流行型ST-10型相比gpsA和pta2两个管家基因存在差异。虽然早在2002年的美国便检测分离出ST-6型牛支原体[28]，但目前还未有已发表的文章声明分离出ST-6型牛支原体中国株。猜测ST-6型牛支原体中国株的出现可能与中美两国的畜群贸易有关。
4 结论采集黑龙江、河北、江苏、安徽和内蒙古等地的样品分离鉴定出20株牛支原体。采用Register的分型体系对分离株进行多位点序列分型(MLST)，MycbPAN005为ST-6型，其余分离株为ST-10型。结合我国目前报道的其他ST型以及来源于4个国家共105株牛支原体的MST分析结果对我国牛支原体的种群结构进行分析，ST-10型牛支原体是我国的主要流行型；除ST-6型外，ST-32、ST-26和ST-43型与ST-10型仅有一个管家基因存在差异，我国牛支原体种群结构相对稳定单一。其中ST-6型中国株MycbPAN005是我国首次分离报道，与ST-10型在gpsA和pta2基因上存在差异。
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