哺乳动物附睾是精子成熟、运输和储存的重要器官，由起始部、附睾头、附睾体和附睾尾组成，每部分都具有不同的形态特征和生理学功能[1-2]。精子在附睾中运输可能需要几天到几周的时间，在此期间，附睾上皮细胞分泌的多种细胞因子对精子运动能力和受精能力的获得起重要作用，并且附睾液中存在的一些特定蛋白质有助于精子成熟[3-4]。目前，本实验室已成功分离培养出绒山羊原代附睾上皮细胞[5]和绵羊原代附睾上皮细胞。但是，体外培养的原代附睾上皮细胞寿命短，第6代开始衰老死亡，不利于进行长期试验。因此，需要建立可长期传代并具有正常生理特性的附睾上皮细胞系用于后续研究。目前已知的促使细胞永生化的方法很多，常用的有EB、SV40、HPV等病毒转染和hTERT基因转染等[6]。病毒感染建立的细胞系常出现细胞形态异常，核型不稳定，发生致瘤性，失去部分原代细胞特性等情况，因而运用端粒酶来延长细胞的生命期是近年来常用的方法。
端粒是一段重复的DNA序列，可以保护核DNA免受降解[7]。端粒随细胞分裂逐渐缩短，激活端粒酶可延长端粒，维持端粒的稳定性。端粒酶逆转录酶(TERT)是端粒酶的催化成分，是端粒酶活性的决定因子[8]。人端粒酶至少包含2个核心成分：逆转录酶催化亚基酶(hTERT)和反义RNA模板(hTERC)[9]。将hTERT转染到细胞基因组中重新激活端粒酶，延长端粒，可使体外培养的细胞寿命延长并保留正常的特性和功能[10]。运用该方法已建立了山羊子宫内膜基质细胞系[11]、猪小肠上皮细胞系[12]、人输卵管上皮细胞系[13]、猪脐静脉内皮细胞系[14]、牛乳腺上皮细胞系[15]、猪肾永生化细胞系[16]等多种永生化细胞系。但关于永生化绵羊附睾上皮细胞系的研究尚未见报道。
本试验通过脂质体转染质粒pCI-neo-hTERT建立永生化绵羊附睾上皮细胞系，旨在为后续附睾功能研究提供一定基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料选择呼和浩特屠宰场10~12月龄健康的绵羊，采集完整白膜的睾丸置于含有PBS(200 IU·mL-1青霉素和200 μg·mL-1链霉素)的冰壶中冷藏保存，1~2 h内带回实验室。
1.2 主要试剂RPMI 1640、G418、青霉素和链霉素、0.25%胰酶(含EDTA)购自Gibco公司；DAPI、Triton X-100、胶原酶Ⅳ购自Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)购自ExCell公司；角蛋白18抗体购自Abcam公司；兔源TERT抗体购自博士德公司；FITC兔抗鼠二抗、FITC羊抗兔二抗购自博奥森公司；胎牛血清FBS、CCK-8购自全式金公司；lipofectamineTM 3000 Reagent购自Introvergen公司；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I购自BD公司；DNA含量检测试剂盒购自索莱宝公司；反转录试剂盒购自TaKaRa公司；ELISA试剂盒购自上海宝曼生物有限公司；pCI-neo-hTERT由西北农林科技大学的靳亚平实验室惠赠。
1.3 原代绵羊附睾上皮细胞分离培养与转染原代绵羊附睾上皮细胞分离培养参考范晓梅等[5]培养绒山羊附睾上皮细胞的方法，并在此基础上进行改进。将附睾取出后剪掉白膜，将其剪碎，PBS清洗去除精子，置于0.1%胶原酶Ⅳ中37 ℃水浴震荡40 min，100目钢筛过滤，此时组织会消化为细管状，将过滤后的管状组织用PBS清洗后，再次置于0.1%胶原酶Ⅳ中，消化5 min，使用基础培养基清洗3次，加入完全培养基于37 ℃，5% CO2培养箱中培养。传代纯化后将第2代细胞接种于六孔板，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养附睾上皮细胞，细胞汇合至60%~70%后，PBS冲洗3次，用lipofectamineTM 3000 Reagent将pCI-neo-hTERT进行转染，未转染的细胞做对照，培养24 h后，用含500 μg·mL-1 G418、10%FBS的RPMI 1640筛选，每3 d换1次培养基，待对照孔细胞全部死亡，将培养液中G418浓度减半继续培养，直至转染孔中出现阳性克隆，胰酶消化后扩大培养，选出的阳性细胞命名为hTERT Sheep Epidydimis Epithelial Cells(hTERT-SEECs)。
1.4 hTERT-SEECs和SEECs角蛋白18免疫荧光鉴定分别使用传至第45代的hTERT-SEECs和原代第3代的SEECs制作细胞爬片，预冷甲醇溶液固定爬片细胞5 min，0.2% Triton X-100通透15 min，3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶，5% BSA封闭，滴加鼠源角蛋白18(1:100)抗体孵育，4 ℃过夜，再滴加FITC标记的抗小鼠二抗(1:100)，37 ℃孵育1 h，清洗后滴加DAPI避光孵育15 min，使用抗荧光淬灭剂封片，共聚焦显微镜观察照相。使用PBS代替一抗作为对照，染色过程同上。
1.5 hTERT-SEECs外源hTERT基因的检测RT-PCR检测外源性hTERT的表达，采用TRIzol法提取原代第3代细胞和第15、25、45代hTERT-SEECs总RNA，微量紫外分光光度计检测RNA的浓度和纯度，选择完整性好的RNA，按照PrimeScriptTM RT Master Mix kit试剂盒操作说明进行反转录合成cDNA，保存于-20 ℃冰箱。质粒为阳性对照，使用PCR仪扩增hTERT序列，循环条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带。引物由上海生工有限公司合成，引物序列和退火温度见表 1。
|
表 1 RT-PCR引物序列 Table 1 The sequence of primers used for RT-PCR |
免疫荧光检测hTERT的表达，过程同1.4，一抗和二抗分别为：兔源hTERT多克隆抗体(1:400)，FITC标记的羊抗兔二抗(1:400)。
1.6 hTERT-SEECs的染色体核型分析在培养的第45代hTERT-SEECs中添加秋水仙素，使其浓度达到0.1 μg·mL-1，放入37 ℃恒温培养箱中培养3 h之后，胰酶消化，分离的细胞全部转移到15 mL离心管中，1 000 r·min-1离心5 min，去上清，收集细胞。将0.075 mol·L-1氯化钾溶液预热至37 ℃，加入7 mL氯化钾溶液，轻打均匀，放入37 ℃培养箱中孵育18 min。再向管中加入1 mL现配的固定液，吹打均匀，1 000 r·min-1离心10 min后，去上清。再加入7 mL固定液，吹打均匀，置于室温下30 min。同上操作，去上清后再加入0.5 mL固定液，吹打均匀。用吸管在预冷载玻片上迅速滴加2~3滴细胞悬液，快速过火3次，置于室温下干燥。之后用吉姆萨工作液染色，15 min后用水清洗，晾干镜检。
1.7 SEECs和hTERT-SEECs的生长曲线绘制增殖能力是永生化细胞最重要的特征之一[17]。取第3代SEECs和第45代hTERT-SEECs，96孔板中每孔接种100 μL细胞悬液，包含2×103个细胞，每隔24 h，两种细胞各取3个孔，每孔中加入10 μL CCK-8，37 ℃培养箱中孵育3 h，再用酶标仪测定样液在450 nm的OD值，测6 d，对照为不含细胞的培养液。所有培养基每48 h更换1次。试验重复3次，取其平均值绘制生长曲线。
1.8 SEECs和hTERT-SEECs的细胞周期和细胞凋亡检测按照DNA含量检测试剂盒，收集第3代SEECs和第45代hTERT-SEECs，PBS洗涤2次，调整细胞密度至1×106个·mL-1，加入200 μL预冷PBS，加入500 μL预冷70%乙醇4 ℃固定过夜，3 000 r·min-1离心5 min，去除固定液，加入RNaseA溶液100 μL重悬细胞，37 ℃水浴30 min。400 μL碘化丙啶(PI)染色液混匀，4 ℃避光孵育30 min。流式细胞仪检测细胞周期。
细胞凋亡按照FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I说明书进行检测。胰酶消化收集对数生长期细胞，PBS洗涤2次，加入400 μL 1×Annexin V结合缓冲液，然后依次加入2.5 mL Annexin V，5 mL PI，避光孵育15 min，同时设立对照组。流式细胞仪检测凋亡情况。
1.9 RT-PCR和ELISA检测SEECs和hTERT-SEECs的GPX5和AR表达使用1.5反转录得到的cDNA，按照相同步骤扩增GPX5、AR和β-actin。通过GenBank查找羊源相关基因序列，使用Primer5.0进行引物设计。引物由上海生工有限公司合成，引物序列及退火温度见表 1。
6孔板细胞经PBS清洗3次，加入150 μL蛋白提取剂(含1.5 μL PMSF)后移入1.5 mL离心管，12 000 r·min-1离心10 min，然后按照ELISA试剂盒说明书检测GPX5和AR蛋白浓度。
1.10 数据统计与分析试验重复3次，采用SAS 9.2软件中的ANAVO进行单因素方差分析，试验结果用“平均数±标准差”表示，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。
2 结果 2.1 原代SEECs的分离和培养利用酶消化法将附睾组织消化成小组织块，贴壁培养至第5天时细胞大面积爬出，生长状态良好(图 1A)。汇合到80%~90%时细胞形态呈铺路石状，细胞界限清晰，连接紧密(图 1B~1E)，原代细胞可传6代，第6代细胞扁平衰老(图 1F)。
|
A.上皮组织培养5天；B.原代细胞生长近融合状态；C.第1代细胞生长近融合状态；D.第2代上皮细胞；E.第4代上皮细胞；F.第6代衰老的上皮细胞 A. Epithelial tissue cultured for 5 days; B. Primary cells near confluence; C.Epididymal epithelial cells at passage 1 near confluence; D.Epididymal epithelial cells at passage 2; E.Epididymal epithelial cells at passage 4; F.Epididymal epithelial cells at passage 6 in senescent state 图 1 酶消化法分离原代绵羊附睾上皮细胞和成纤维细胞(200×) Fig. 1 Primary sheep epididymal epithelial cells and fibroblasts isolated by enzymatic digestion(200×) |
原代培养的SEECs汇合至60%~70%时转染pCI-neo-hTERT质粒，转染24 h后将培养液换为含500 μg·mL-1G418、10%胎牛血清的RPMI 1640培养液进行筛选培养。筛选培养至第14天时对照组细胞全部死亡，培养液换为G418减半培养基，继续培养，直至有阳性细胞出现。hTERT-SEECs经过45代后仍具有与SEECs相似的形态(图 2)。
|
A.转染hTERT 16 d得到的阳性细胞；B.第45代hTERT-SEECs A. Positive cells obtained for 16 d after transfected hTERT; B. The hTERT-SEECs at passage 45 图 2 阳性细胞培养(100×) Fig. 2 Positive cell culture(100×) |
CK18是上皮细胞特异性标记物，使用激光共聚焦检测显示，原代第3代SEECs和第45代hTERT-SEECs绝大多数细胞胞质发出绿色荧光，蓝色为细胞核(图 3)，细胞界限清晰，大小均一，培养的原代细胞纯度较高，hTERT-SEECs表现上皮细胞特性。PBS替换一抗得到的对照CK18呈阴性。
|
图 3 角蛋白18染色(200 ×) Fig. 3 Keratin 18 staining (200×) |
RT-PCR检测hTERT mRNA的表达，hTERT-SEECs扩增的特异性片段长度为384 bp，结果表明，hTERT基因在第15、25代和45代hTERT-SEECs内均能稳定表达(图 4)。
|
M. DNA相对分子质量标准；1.第15代hTERT-SEECs；2.第25代hTERT-SEECs；3.第45代hTERT-SEECs；4.阳性对照；5.第3代SEECs M. 1 000 bp DNA marker; 1. The hTERT-SEECs at passage 15; 2. The hTERT-SEECs at passage 25; 3. The hTERT-SEECs at passage 45; 4. Positive control; 5. The SEECs at passage 3 图 4 hTERT-SEECs中hTERT mRNA表达 Fig. 4 hTERT mRNA expression in hTERT-SEECs |
细胞免疫荧光结果表明，第45代hTERT-SEECs的hTERT蛋白表达呈阳性，且阳性信号集中在细胞核内，表明基因整合进基因组，而原代附睾上皮细胞中无hTERT蛋白表达(图 5)。
|
图 5 hTERT-SEECs中的hTERT蛋白免疫荧光检测(400×) Fig. 5 Immunofluorescence detection of hTERT in hTERT-SEECs(400×) |
对培养至第45代的hTERT-SEECs进行染色体核型分析(图 6)，hTERT-SEECs染色体数是54条，具有哺乳动物细胞的二倍体核型。结果表明hTERT-SEECs细胞没有发生变异。
|
A.染色体排列图；B. hTERT-SEECs核型图 A. Chromosome arrangement; B. hTERT-SEECs karyotype 图 6 hTERT-SEECs核型分析(400×) Fig. 6 Karyotype analysis of hTERT-SEECs (400×) |
第3代SEECs生长曲线近似“S”型，从第2天开始细胞进入对数生长期，第5天时到达最高值，然后进入平台期。第45代hTERT-SEECs生长曲线形态与原代第3代细胞相似，但其增殖能力高于SEECs(图 7)。
|
图 7 hTERT-SEECs和SEECs生长曲线 Fig. 7 hTERT-SEECs and SEECs growth curves |
SEECs和hTERT-SEECs细胞周期检测结果见图 8，第3代SEECs处于S期的细胞为(23.22±1.02)%，第45代hTERT-SEECs处于S期的细胞为(33.36±1.54)%；SEECs处于GI期的比例为(58.31±2.14)%，第45代hTERT-SEECs处于G1期的比例为(45.11±1.80)%。该结果表明，hTERT-SEECs在G1期的生长停滞比例显著低于SEECs的G1期比例(P＜0.05)，而hTERT-SEECs中S期细胞占比显著高于SEECs(P＜0.05)，说明hTERT-SEECs比原代细胞具有更高的增殖活性。
|
图 8 SEECs和hTERT-SEECs细胞周期检测 Fig. 8 SEECs and hTERT-SEECs growth cycle |
细胞凋亡分析结果表明(图 9)，第3代SEECs的活细胞率为(78.13±0.22)%，第45代hTERT-SEECs的活细胞率为(90.81±0.52)%，二者差异显著(P＜0.05)；第3代SEECs凋亡率为(14.06±0.30)%，hTERT-SEECs凋亡率为(2.54±0.61)%，hTERT-SEECs凋亡率显著低于原代SEECs(P＜0.05)。综上结果表明，hTERT-SEECs具有更高的细胞活力。
|
PI/Annexin V-FITC荧光染色：Q1区表示死细胞；Q2区表示凋亡细胞；Q3区表示活细胞；Q4区表示早期凋亡细胞 PI/Annexin V-FITC fluorescent staining:Q1. dead cells; Q2. apoptotic cells; Q3. living cells; Q4. early apoptotic cells 图 9 SEECs和hTERT-SEECs凋亡检测 Fig. 9 Apoptosis detection of SEECs and hTERT-SEECs |
通过RT-PCR检测第45代hTERT-SEECs中GPX5和AR的mRNA表达，β-actin作为内参(图 10a)。ELISA检测GPX5和AR蛋白表达量。结果如图 10b所示，hTERT-SEECs的GPX5和AR蛋白表达量与SEECs相比差异不显著(P＞0.05)，hTERT-SEECs正常表达AR和GPX5。
|
a.AR和GPX5 mRNA表达；b. AR和GPX5蛋白表达 a.AR and GPX5 mRNA expression; b. AR and GPX5 protein expression 图 10 hTERT-SEECs和SEECs中AR和GPX5的表达 Fig. 10 Expression of AR and GPX5 in hTERT-SEECs and SEECs |
分离和培养细胞的方法主要有两种，分别是酶消化法和组织块培养法[19]。酶消化法得到的细胞数量大，贴壁快，但细胞状态不如组织块法获得的细胞，而且酶消化法培养的上皮细胞和成纤维细胞混杂在一起，不利于后续纯化。为得到状态良好的原代绵羊附睾上皮细胞，笔者参考了范晓梅等[5]和Bassols等[20]培养原代上皮细胞的方法。用0.1%胶原酶Ⅳ将附睾头消化成为小组织块，组织块贴壁后第5天细胞大面积爬出，直至长满培养瓶底，此时细胞纯度高，混杂的成纤维细胞很少，培养的细胞呈卵圆形，传代后细胞呈岛屿状生长，连接紧密，立体感强，形状如铺路石样[21]。CK18是上皮细胞特异性标记物[22-23]，CK18高表达证明培养的细胞为纯化附睾上皮细胞。
体外培养的细胞获得持续增殖能力即为细胞永生化。正常体细胞经若干次的有丝分裂后，开始进入衰老期M1，此时端粒还较长，细胞开始衰老，但并不死亡，细胞持续分裂，进入危机期M2，此时细胞染色体已短致极限，染色体变异率、细胞死亡率增加，如果细胞在一定条件下能够突破M2期抑制，端粒酶被重新激活，端粒长度能够被维持从而获得体外无限分裂和增殖的能力，进而实现永生化。运用端粒酶逆转录酶是近年来最为常用的一种方法，是目前被认为接近生理途径的一种永生化方法[24]。本试验通过转染hTERT基因建立的hTERT-SEECs细胞系经过45次传代依然具备上皮细胞典型的形态和生理特征。
细胞系培养过程中各项生长指标对于判定永生化特性非常重要，任何细胞生长特性的变化都会对后续的试验结果产生显著影响[25]。hTERT的RT-PCR和免疫荧光染色结果显示，hTERT已成功转入细胞，并且在基因组中稳定表达。hTERT-SEECs角蛋白18染色仍呈阳性，表明该细胞系有正常上皮细胞的表型特征。增殖活力是永生化细胞系最重要的特性之一。转染前后细胞增殖曲线形态均近似“S”型，hTERT-SEECs具有更高的生长速率。使用流式细胞仪进行细胞周期和细胞凋亡分析，结果显示，与SEECs相比，hTERT-SEECs处于S期的细胞比例、活细胞率均显著升高(P < 0.05)，处于G1期的细胞比例、凋亡率均显著降低(P < 0.05)。综上所述，本研究所建立的hTERT-SEECs具有很强的增殖能力和细胞活力。细胞在传代的过程中会丢失或增加染色体，从而使体外培养的细胞无法发挥正常功能，因此，染色体核型鉴定是必不可少的关键步骤。倍体分析结果显示，hTERT-SEECs染色体数目仍是54条，具有典型的二倍体核型，保留了稳定的细胞生物学功能。
雄激素是调节雄性生殖活动的主要激素之一，雄激素经AR介导调节附睾发育，维持附睾的正常功能，并对附睾内精子成熟具有决定性作用。AR是类固醇激素受体家族的一员，在整个附睾上皮细胞中均有表达[26-28]。附睾作为精子成熟、运输和储存的器官，维持附睾管腔内环境氧化还原平衡对于精子免受氧化损伤至关重要。GPX5是雄性哺乳动物附睾特异性蛋白，占附睾液中总GPX的95%以上[29]。已在小鼠[30]和猪[31]等多种动物附睾中证明了GPX5的抗氧化功能和对维持附睾管腔微环境稳定的重要性。本研究中，培养至45代的hTERT-SEECs仍可以稳定表达GPX5和AR，ELISA结果表明45代hTERT-SEECs中GPX5和AR蛋白表达浓度与SEECs中没有明显差异(P＞0.05)，综上说明，与原代附睾上皮细胞相比，hTERT-SEECs同样受雄激素调节，且保留了重要的特异性抗氧化酶的分泌功能，可以作为附睾发育及其抗氧化调节等相关研究的理想模型。
4 结论本试验获得了形态良好，纯度较高的原代绵羊附睾上皮细胞，并通过转染pCI-neo-hTERT质粒成功建立了永生化绵羊附睾上皮细胞系，该细胞系经长期培养后仍具有典型的附睾上皮细胞形态，增殖能力强，并保留了重要的附睾上皮细胞生理功能，可为进一步研究附睾功能及其调节机制提供基础。
| [1] | GERVASI M G, VISCONTI P E. Molecular changes and signaling events occurring in spermatozoa during epididymal maturation[J]. Andrology, 2017, 5(2): 204–218. DOI: 10.1111/andr.12320 |
| [2] |
肖娟, 王讯, 罗毅, 等. 附睾小体功能蛋白及sRNA研究进展[J]. 遗传, 2018, 40(3): 197–206.
XIAO J, WANG X, LUO Y, et al. Research progress in sRNAs and functional proteins in epididymosomes[J]. Hereditas, 2018, 40(3): 197–206. (in Chinese) |
| [3] | SUlLIVAN R, MIEUSSET R. The human epididymis:its function in sperm maturation[J]. Hum Reprod Update, 2016, 22(5): 574–587. DOI: 10.1093/humupd/dmw015 |
| [4] | ADAM C, CYR D G. Role of specificity protein-1 and activating protein-2 transcription factors in the regulation of the gap junction protein beta-2 gene in the epididymis of the rat[J]. Biol Reprod, 2016, 94(6): 120. |
| [5] |
范晓梅, 张通, 粟瑞兰, 等. 绒山羊附睾上皮细胞培养方法的建立及其生长特性[J]. 畜牧兽医学报, 2017, 48(7): 1212–1220.
FAN X M, ZHANG T, LI R L, et al. Establishment of culture method and growth characteristics for epididymal epithelial cells from cashmere goats[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2017, 48(7): 1212–1220. (in Chinese) |
| [6] | KIM C W, GO R E, LEE G A, et al. Immortalization of human corneal epithelial cells using simian virus 40 large T antigen and cell characterization[J]. J Pharmacol Toxicol Methods, 2016, 78: 52–57. DOI: 10.1016/j.vascn.2015.11.005 |
| [7] | DE LANGE T. Shelterin:the protein complex that shapes and safeguards human telomeres[J]. Genes Dev, 2005, 19(18): 2100–2110. DOI: 10.1101/gad.1346005 |
| [8] | CHILTON W, O'BRIEN B, CHARCHAR F. Telomeres, aging and exercise:guilty by association?[J]. Int J Mol Sci, 2017, 18(12): 2573. DOI: 10.3390/ijms18122573 |
| [9] | WU X Q, HUANG C, HE X, et al. Feedback regulation of telomerase reverse transcriptase:new insight into the evolving field of telomerase in cancer[J]. Cell Signal, 2013, 25(12): 2462–2468. DOI: 10.1016/j.cellsig.2013.08.009 |
| [10] | QIN S Q, KUSUMA G D, Al-SOWAYAN B, et al. Establishment and characterization of fetal and maternal mesenchymal stem/stromal cell lines from the human term placenta[J]. Placenta, 2016, 39: 134–146. DOI: 10.1016/j.placenta.2016.01.018 |
| [11] |
盛宏霞, 吴庆侠, 靳亚平, 等. 山羊子宫内膜基质细胞永生化研究[J]. 畜牧兽医学报, 2009, 40(6): 818–823.
SHENG H X, WU Q X, JIN Y P, et al. Immortalization of goat endometrial stromal cells by telomerase reverse transcriptase transfection[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2009, 40(6): 818–823. DOI: 10.3321/j.issn:0366-6964.2009.06.006 (in Chinese) |
| [12] | WANG J, HU G D, GAO W J, et al. Immortalized porcine intestinal epithelial cell cultures susceptible to porcine rotavirus infection[J]. J Virol Methods, 2014, 202: 87–94. DOI: 10.1016/j.jviromet.2014.03.007 |
| [13] |
高雯, 臧荣余, 王雁, 等. 人类输卵管上皮永生化细胞系的建立及鉴定[J]. 中国癌症杂志, 2013, 23(4): 241–247.
GAO W, ZANG R Y, WANG Y, et al. Immortalization of human fallopian tube epithelial cells[J]. China Oncology, 2013, 23(4): 241–247. DOI: 10.3969/j.issn.1007-3969.2013.04.00X (in Chinese) |
| [14] | HONG H X, ZHANG Y M, XU H, et al. Immortalization of swine umbilical vein endothelial cells with human telomerase reverse transcriptase[J]. Mol Cells, 2007, 24(3): 358–363. |
| [15] |
李吉霞.牛乳腺上皮细胞永生化及其多能性的研究[D].杨凌: 西北农林科技大学, 2010.
LI J X.Immortalization of bovine mammary epithelial cell with multipotency[D].Yangling: Northwest A&F University, 2010.(in Chinese) http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10712-2010147418.htm |
| [16] | KWAK S, JUNG J E, JIN X, et al. Establishment of immortal swine kidney epithelial cells[J]. Anim Biotechnol, 2006, 17(1): 51–58. DOI: 10.1080/10495390500461070 |
| [17] | FURIHATA T, ITO R, KAMⅡCHI A, et al. Establishment and characterization of a new conditionally immortalized human astrocyte cell line[J]. J Neurochem, 2016, 136(1): 92–105. DOI: 10.1111/jnc.13358 |
| [18] | HE Y L, WU Y H, HE X N, et al. An immortalized goat mammary epithelial cell line induced with human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene transfer[J]. Theriogenology, 2009, 71(9): 1417–1424. DOI: 10.1016/j.theriogenology.2009.01.012 |
| [19] | LI Z H, KREINER M, EDRADA-EBEL R A, et al. Perfusion culture enhanced human endometrial stromal cell growth in alginate-multivalent integrin α5β1 ligand scaffolds[J]. J Biomed Mater Res A, 2011, 99(2): 211–220. |
| [20] | BASSOLS J, KÁDÁR E, BRIZ M D, et al. In vitro culture of epithelial cells from the caput, corpus, and cauda epididymis of Sus domesticus[J]. Theriogenology, 2004, 62(5): 929–942. DOI: 10.1016/j.theriogenology.2003.12.015 |
| [21] | ARAKI Y, SUZUKI K, MATUSIK R J, et al. Immortalized epididymal cell lines from transgenic mice overexpressing temperature-sensitive simian virus 40 large T-antigen gene[J]. J Androl, 2002, 23(6): 854–869. |
| [22] | HU H, ZHENG N, GAO H N, et al. Immortalized bovine mammary epithelial cells express stem cell markers and differentiate in vitro[J]. Cell Biol Int, 2016, 40(8): 861–872. DOI: 10.1002/cbin.10624 |
| [23] | PARK H J, LEE W Y, JEONG H Y, et al. Regeneration of bovine mammary gland in immunodeficient mice by transplantation of bovine mammary epithelial cells mixed with matrigel[J]. Int J Stem Cells, 2016, 9(2): 186–191. DOI: 10.15283/ijsc16044 |
| [24] |
吴庆侠, 董海龙, 刘忠艳, 等. 永生化山羊子宫内膜上皮细胞系的建立及其生物学特性[J]. 中国农业大学学报, 2017, 22(2): 73–79.
WU Q X, DONG H L, LIU Z Y, et al. Establishment of goat immortalised endometrium epithelial cell line and study on its biological characteristics[J]. Journal of China Agricultural University, 2017, 22(2): 73–79. (in Chinese) |
| [25] | LI J X, SAID A, GE X G, et al. Development and validation of immortalized bovine mammary epithelial cell line as an in vitro model for the study of mammary gland functions[J]. Cytotechnology, 2017, 70(1): 67–82. |
| [26] | GUCALP A, TRAINA T A. The androgen receptor:is it a promising target?[J]. Ann Surg Oncol, 2017, 24(10): 2876–2880. DOI: 10.1245/s10434-017-5961-9 |
| [27] | LEIR S H, BROWNE J A, EGGENER S E, et al. Characterization of primary cultures of adult human epididymis epithelial cells[J]. Fertil Steril, 2015, 103(3): 647–654. DOI: 10.1016/j.fertnstert.2014.11.022 |
| [28] | O'HARA L, WELSH M, SAUNDERS P T K, et al. Androgen receptor expression in the caput epididymal epithelium is essential for development of the initial segment and epididymal spermatozoa transit[J]. Endocrinology, 2011, 152(2): 718–729. DOI: 10.1210/en.2010-0928 |
| [29] | LI R L, FAN X M, ZHANG T, et al. Expression of selenium-independent glutathione peroxidase 5 (GPx5) in the epididymis of Small Tail Han sheep[J]. Asian-Australas J Anim Sci, 2018, 31(10): 1591–1597. DOI: 10.5713/ajas.18.0015 |
| [30] | TAYLOR A, ROBSON A, HOUGHTON B C, et al. Epididymal specific, selenium-independent GPX5 protects cells from oxidative stress-induced lipid peroxidation and DNA mutation[J]. Hum Reprod, 2013, 28(9): 2332–2342. DOI: 10.1093/humrep/det237 |
| [31] | BARRANCO I, TVARIJONAVICIUTE A, PEREZ-PATIÑO C, et al. Glutathione peroxidase 5 is expressed by the entire pig male genital tract and once in the seminal plasma contributes to sperm survival and in vivo fertility[J]. PLoS One, 2016, 11(9): e0162958. DOI: 10.1371/journal.pone.0162958 |