2. 新疆哈密地区畜牧工作站, 哈密 839000
2. Hami Animal Husbandry Workstation, Hami 839000, China
超数排卵是重要的动物繁殖技术,其对于家畜繁殖潜力挖掘、快速扩群、种质资源保护以及新品种培育都具有重要意义[1-3]。在生产实践中,家畜超数排卵效果并不稳定,个体间往往具有较大离散性。以萨福克绵羊为例,在不同超数排卵操作中获得的可用胚胎数分别为(7.96±7.05)[4]、(7.06±6.26)[5]、(5.1±7.3)枚[6],各结果均具有较大标准差。超数排卵时较大的离散性往往给后续家畜繁殖育种工作带来很大困扰。例如,在MOET育种体系中,因为很难与供体数量准确配套,往往需要准备更多受体,进而带来额外的生产成本。而对于胚胎保种和转基因等工作,也会因为超数排卵结果的不确定性打乱后续工作计划。
影响家畜超数排卵效果的因素是多方面的,包括品种、年龄、季节、激素、超数排卵方案、个体遗传差异等[4, 7-9]。在众多因素中,个体遗传差异或者个体对超数排卵激素的敏感性被认为是影响超数排卵效果的重要内因[10]。奶牛超数排卵时获得总胚胎数的遗传力为0.27左右,说明从遗传角度提高超数排卵效果具有可行性[11]。相关关联分析结果表明,水牛OPN(osteopontin)基因启动子区突变[12]、奶牛IGF1R基因G404T突变[13]和RFRP基因突变[14]均与超数排卵时获得的胚胎数显著相关。免疫组化分析表明,不同绵羊品种卵巢上FSH受体分布规律与其对FSH敏感性及超数排卵效果相关联[15]。总体上,目前与超数排卵相关的功能基因和遗传标记多采用候选基因法分析获得,进一步从基因组水平筛选影响家畜超数排卵效果的关键基因具有更大意义。
本研究以萨福克绵羊为试验动物,在超数排卵基础上,分别构建超数排卵高产群体和低产群体基因组混池。通过对混池重测序,鉴定群体中SNPs分布,进而通过对SNPs的选择消除分析,鉴定多个影响萨福克绵羊超数排卵效果的候选基因。预期试验结果对于理解绵羊卵泡发育对外源激素响应机制,以及指导未来超数排卵操作中供体选择和供受体配套都具有重要价值。
1 材料与方法 1.1 试验动物试验用萨福克绵羊由澳大利亚纯种引进,年龄在2~3岁之间,健康状况良好,分别饲养在新疆哈密牧祥农业养殖专业合作社和新疆哈密巴里坤建坤牧业公司,饲养方法参考《萨福克种羊》地方标准(DB65/T 2775-2013)。
1.2 主要药品、试剂及仪器设备超数排卵相关药品与试剂:FSH(宁波三生药业)、CIDR(澳大利亚)、氯前列腺素(宁波三生药业)、VADE复合维生素、静松灵、盐酸普鲁卡因、肾上腺素、PBS缓冲液、75%酒精、生理盐水等。DNA提取相关试剂:血液基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖、1×TBE等。超数排卵相关仪器设备:体视显微镜、恒温加热台、恒温水浴锅、烘箱、高压灭菌锅、酒精灯、手术车、创布、毛剪、手术刀、止血钳、肠钳等。DNA提取相关仪器设备:台式低温高速离心机、移液器、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、紫外分光光度计等。
1.3 超数排卵流程及胚胎鉴定标准超数排卵供体萨福克绵羊共93只。将供体羊埋植CIDR后记为第0天,在第9天每头供体注射VADE复合维生素3 mL。从第10~13天,每天减量肌肉注射FSH 2次,每次间隔12 h。在第13天第1次注射FSH后,肌肉注射PG并撤去CIDR。第14~15天准确观察发情并及时配种,第1次配种12 h后复配1次,直至发情结束。第20天所有供体绵羊禁食禁水。第21天用手术法收集胚胎。
收集胚胎后,一方面统计每头供体采集的胚胎数,另一方面通过对胚胎进行等级鉴定统计可用胚胎数。胚胎分级标准:A级:胚胎发育阶段与胚龄一致,透明带光滑无缺陷,胚胎细胞团形态完整,轮廓清晰,卵裂球大小均匀,结构紧凑、色泽和透明度适中,无游离细胞或很少,变性细胞比例少于10%。B级:胚胎发育阶段与胚龄基本一致,轮廓清晰,胚胎细胞团形态较完整,卵裂球大小基本一致,色泽和细胞透明度良好,变性及游离细胞约占10%~30%。C级:胚胎发育阶段与胚龄不太一致,且胚胎细胞团轮廓不清,色泽和透明度变暗,卵裂球较松散游离,变性及游离细胞约占30%~50%,此级胚胎可用作鲜胚移植。D级:未受精卵,或发育停滞变性、卵裂球不规则、少而散,D级胚胎淘汰不可用。其中A、B和C级胚胎总和为可用胚胎。
1.4 测序群体的选择根据每头供体收集的胚胎数和可用胚胎数,选取了30头总胚胎数大于等于15枚的个体构建高产群体,同时选取了30头总胚胎数小于等于9枚的个体构建低产群体。构建的高产群体和低产群体将用于进一步的基因组混池重测序分析。
1.5 血液样品的采集与基因组DNA的提取每个待测序个体颈静脉采集血样2 mL,并置于-80 ℃保存。使用血液基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。使用1%琼脂糖凝胶和紫外分光光度计鉴定基因组DNA完整性和纯度,然后用TE缓冲液将各DNA样品浓度调整至50 ng·μL-1。
1.6 样品的建库与测序流程将高产群体基因组DNA等量混合后构建高产混池(高产池,high-yield pool),将低产群体基因组DNA等量混合后构建低产混池(低产池,low-yield pool)。每个混池使用1.5 μg DNA进行建库。首先将DNA样品用超声波破碎仪随机打断成长度为350 bp的片段,经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。文库构建完成后,稀释文库至1 ng·μL-1,然后使用Agilent 2100对文库的插入片段长度进行检测,插入片段长度符合预期后,使用q-PCR方法对文库有效浓度进行准确定量(文库有效浓度>2 nmol·μL-1),以保证文库质量。库检合格后,把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求进行Illumina HiSeq 4000双端(paired-end)测序。建库与测序工作委托北京诺禾致源科技股份有限公司完成。
1.7 测序数据的分析方法原始数据(raw data)经过初步质量控制后得到干净数据(clean data)。使用BWA软件将干净数据比对到绵羊参考基因组(Ovis aries 4.0)后,统计测序数据覆盖深度和覆盖度。使用SAMTOOLS软件检测测序样本的单核苷酸多态性(SNP)。使用ANNOVAR软件对检测到的SNP进行注释,包括SNP所在染色体、起始位点、终止位点、基因信息等。
候选基因筛选方法1(M1):基于杂合率(Hp)的选择消除分析。通过计算窗口内SNP位点的杂合性,进而对样品的选择消除(selective sweep)进行评估。具体方法为以100 kb区间作为滑动窗口,取50%重叠区间作为滑动步长,分别计算每个位点最大、最小等位基因个数,进而计算每个窗口的杂合率Hp。对各混池杂合率转化为标准正态分布后得到ZHp。对于100 kb窗口得到的ZHp值,选取-5为临界值,分别得到2个混池候选区域列表,进而分别获得候选基因列表。
候选基因筛选方法2(M2):基于群体固定系数(Fst)的选择消除分析。群体固定系数反映了群体等位基因杂合性水平,用于估计亚种群间平均杂合性大小与整个种群平均杂合性大小差异。具体方法为以100 kb区间作为滑动窗口,取50%重叠区间作为滑动步长,计算每个窗口的Fst值。对Fst转化为标准正态分布后得到ZFst。以100 kb为窗口,50 kb为步长,以ZFst=5.5为阈值,挑选ZFst大于该值的窗口,作为候选窗口。并对候选窗口进行合并统计,获得候选基因。
候选基因筛选方法3(M3):基于Hp和Fst的选择消除分析筛选差异候选基因。在计算得到每个窗口(100 kb)ZHp和ZFst值的基础上,选取ZHp和ZFst的前2.5%区域作为受选择区域,进而分别筛选得到high-yield pool和low-yield pool的候选基因。
候选基因筛选方法4(M4):在M1、M2和M3的基础上,统计3种方法获得基因的交集,从而进一步提高选择标准,缩小候选基因范围。
2 结果 2.1 萨福克绵羊超数排卵的效果分析对93头供体萨福克绵羊超数排卵后,共收集胚胎1 167枚,其中可用胚胎741枚,头均总胚胎数为(12.55±7.97)枚,头均可用胚胎数为(7.76±7.43)枚。超数排卵效果良好的供体在其卵巢上能够看到多个黄体(图 1a),相反,超数排卵效果不良的供体在其卵巢上仅能看到少量或看不到黄体(图 1b)。
根据超数排卵效果分别组建了高产群体和低产群体,其中重点排除了拥有许多黄体却仅得到少量胚胎的个体,因为它们的低产不能排除是由于冲胚过程失败造成的。构建的高产群体和低产群体平均可用胚胎分别为(14.97±8.38)和(2.27±2.10)枚,差异极显著(P < 0.001, 表 1)。
测序共产生原始数据232.588 G,经过质量控制后得到干净数据231.892 G。测序数据的Q20 ≥ 96.92%,Q30≥92.43%,GC含量在43.14%~43.35%之间,说明样本测序质量合格,GC分布正常,建库测序成功。参考基因组大小为2.6 G,将测序数据比对到基因组上之后表明,高产池共比对上714 084 661条reads,比对率为97.45%。低产池共比对上805 313 084条reads,比对率为99.03%。高产池和低产池平均测序深度分别为30.5×和34.45×,4×覆盖率分别为97.86%和97.94%,说明测序数据量合格,比对结果正常,符合进一步分析要求。
2.3 两个混池的SNPs检测与注释2个混池的SNPs检测与注释结果见表 2。在高产池和低产池中分别检出了20 189 224和20 396 751个SNPs,其中两个混池共有SNPs为17 311 146个,共有比例分别为85.7%和84.8%。检测到的SNPs中96%以上分布在内含子区(34%)和基因间区(62.8%)。同时检测到SNPs中以转换为主,转换与颠换的比例为2.3:1。高产池和低产池全基因组杂合率分别为6.9‰和7.0‰。
基于杂合率选择消除分析(M1),高产池获得候选基因188个,低产池获得候选基因166个。基于群体固定系数选择消除分析(M2),两个群体间共获得候选基因141个。基于Hp和Fst的选择消除分析(M3),高产池和低产池分别获得候选基因89个(图 2,表 3)。分别分析了高产池和低产池基于M1、M2和M3 3种分析方法获得候选基因的交集,其中高产池获得共有候选基因11个,低产池没有得到共有候选基因(表 3)。
高产池获得的11个候选基因信息见表 4,其中7个基因属于HOXA家族,包括HOXA3、HOXA4、HOXA5、HOXA9、HOXA10、HOXA11和HOXA13,2个基因尚未被验证功能,剩余2个基因分别为DPH6和AKAP6。
虽然超数排卵技术已经被广泛应用于家畜生产活动,但超数排卵的不稳定性一直是限制其广泛推广的重要因素。尽管已经探讨了包括超排程序、激素组合、季节、品种等因素对超数排卵的影响,但目前尚未彻底解决超数排卵稳定性的问题。在本研究中,尽管超排程序、季节、品种等外部因素均保持了一致,超数排卵结果仍具有较大离散性,获得头均可用胚胎数为(7.76±7.43)枚,进一步提示个体遗传差异可能是超数排卵效果不一致的重要原因。类似的,在医学上遗传因素也是造成个体间药代动力学、药效学反应差异的重要原因。例如,CPY450基因多态性被证明能够影响机体对麻醉药物的代谢过程,从而影响个体对麻醉药物的敏感性。因此在麻醉工作前,进行个性化遗传分析,能够显著提高麻醉效果并降低麻醉风险[16]。同样,寻找高产个体与低产个体关键遗传差异,并鉴定参与的功能基因,将有助于解决超数排卵结果不稳定的生产难题。
在萨福克绵羊超数排卵基础上,本研究对高产群体和低产群体进行了基因组混池重测序,并进行了选择消除分析。选择消除分析原理是当某一位点受到选择后,其附近和与其处在同一个单体型(haplotype)或者区块(block)的其他多态性位点同样跟着受到了选择,从而降低了整个区域多态性[17]。该方法被广泛应用于SNP和功能基因挖掘,并取得了良好效果[18-20]。但鉴于基因组复杂性和自然群体遗传多样性,选择消除分析往往容易得到过多的假阳性结果[20]。本研究中,分别使用基于杂合率和基于群体固定系数方法,均获得了100个以上候选基因,而通过将多种方法进行组合,极大的缩小了候选基因范围,从而为下一步功能基因验证降低了工作量。但是,理论上本研究还有一种更加理想的分析策略,就是在构建极端群体基础上,杂交获得F1代,然后将F1代横交后获得F2代,最终在F2代中再次构建极端群体。这样的样本预期能够显著降低选择消除分析时的假阳性,从而获得更加精准的结果。
本研究分析结果表明,共有11个基因可能影响或参与萨福克绵羊对超数排卵激素的响应过程,其中7个基因属于HOXA家族。通常认为HOX基因在胚胎发育中具有重要作用,能够决定前后体轴的分化。但许多证据表明,HOX基因在生殖系统中也具有重要调控作用。例如,HOXA9、HOXA10、HOXA11、HOXA13能够调控胚胎苗勒管分化,进而形成成熟生殖结构[21-23]。除在生殖道中有HOX基因表达外,HOXA3、HOXA5、HOXA7、HOXA9和HOXA10均能够在卵泡发育中检测到表达[24-26],其中HOXA7在原始卵泡中表达量非常低,而在成熟卵泡中则有高表达[24]。而在多囊卵巢综合征中,HOXA10基因的表达水平显著低于正常水平[26],提示这些基因可能够参与卵泡发育过程。同时,包括HOXA9、HOXA10在内的多个HOX基因的表达受雌激素和雄激素调节,进而参与雌性动物繁殖周期的动态调控[24]。本研究通过基因组选择消除分析证明,多个HOXA基因可能参与了机体对外源激素刺激的响应过程,但具体调控网路需要进一步验证,例如,可以通过检测超数排卵过程中相关HOXA基因表达水平与最终获得胚胎数的关系,进而验证相关基因是否参与了机体对超数排卵激素的响应过程。
在剩余的4个候选基因中,有2个尚未验证功能,其余2个分别是DPH6和AKAP6基因。相关研究表明,在牛卵巢转录组中能够观察到DPH6的表达[27],并且DPH6被促性腺激素释放激素通路调控[28],说明DPH6基因对于动物卵巢功能的维持具有重要作用,但其在家畜超数排卵过程中的具体作用机制仍不明确。相反,目前并没有直接证据证明AKAP6基因能够参与卵泡发育或者响应激素调控。蛋白激酶A锚定蛋白家族(AKAPs)是一类结构不同而功能相关的蛋白家族,其在靶向定位和调节PKA介导的磷酸化方面扮演重要角色,从而参与多种细胞信号转导过程[29]。AKAP6基因作为AKAPs家族的一员,目前被发现参与脂肪沉积、骨发育、肌肉发育等生物过程[30]。本研究发现,AKAP6基因与超数排卵相关联,鉴于AKAPs家族的丰富调控功能,进一步验证AKAP6基因在动物卵泡发育和激素调控中的作用或许能够揭示AKAP6基因所具备的新功能。
4 结论在萨福克绵羊超数排卵基础上,对高产群体和低产群体进行了基因组混池重测序,并进行了选择消除分析。结果表明,共有11个候选基因能够影响萨福克绵羊超数排卵过程,其中7个基因属于HOXA家族,分别是HOXA3、HOXA4、HOXA5、HOXA9、HOXA10、HOXA11和HOXA13,2个基因尚未被验证功能,剩余2个基因分别为DPH6和AKAP6。进一步验证HOXA家族、DPH6和AKAP6基因在卵泡发育中的作用有助于解释家畜超数排卵的调控机制。
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