现代家养肉禽品种具备肌肉快速生长的特性，但相对于体重、肌肉等的早熟，其心、肝等内脏器官的发育较慢[1-2]。在肉鸭生长发育中，内脏器官发育的相对滞后是导致其患腹水症猝死的重要原因[3]。目前关于禽类肌肉生长发育的分子调控网络研究较为完备[4-5]，而内脏器官发育方面的调控基因研究较为缺乏。因此，研究肉鸭器官发育的关键调控基因具有重要意义。
研究证明，GATA4/5/6是调控各器官发育的关键转录因子[6-7]。GATA家族是含锌指结构的转录因子家族，广泛存在于真核生物中，在细胞增殖及器官形成中起重要作用[8]。脊椎动物GATA家族基因可分为2个亚群:即GATA1/2/3和GATA4/5/6亚家族[9]，GATA1/2/3亚家族主要表达于造血系统[10-11]；而GATA4/5/6亚家族主要表达于心脏和肝脏等中胚层和内胚层来源的器官[12-13]。GATA4是心脏前体细胞出现的最早期标志之一[14]。并且GATA4/5/6可通过反式激活Hhex启动子等直接参与胚胎期心脏和肝脏的发育[15-16]。在出生后的研究中发现，GATA4/5/6在小鼠心脏和肝脏中有不同程度的表达[17-18]。GATA4/6在调节新生心脏心肌细胞成熟和维持成年心脏舒张功能方面有重要作用[19]，并且GATA4是出生后防止心力衰竭所必须的转录因子[20]。同时，GATA4可以通过HNF3β和促进因子X等方式调节肝脏的特异性表达[21-22]。GATA转录家族基因通常含有2个锌指结构域(N端锌指结构和C端锌指结构)。C端锌指结构通常介导DNA结合以及GATA因子的蛋白-蛋白相互作用，已被报道与NKX2-5的同源盒结构域、JARID2[23]相互作用发挥功能。而N端锌指结构域有助于与DNA结合的完全特异性和稳定性，可以与NFATC4[24]、LMCD1[25]相互作用形成复合物, 刺激心肌细胞肥大。并且，通过敲除GATA家族基因的锌指结构发现，锌指结构的缺失会影响相应组织的发育[23]。然而，目前鸭GATA4/5/6基因还未被克隆，且其在出生后肉禽心脏和肝脏中的表达规律与功能等尚不清楚。
鉴于肉鸭生产上面临的内脏器官发育相对滞后引起的腹水症等实际问题, 以及GATA4/5/6在动物内脏器官发育中的关键作用，本试验拟克隆鸭GATA4/5/6基因的编码区序列，并对其进行生物信息学分析，同时通过qRT-PCR检测GATA4/5/6在0~8周龄肉鸭心脏和肝脏中的表达量，并将其与心脏和肝脏的重量和器官指数等进行相关分析。本研究的结果有助于了解GATA4/5/6亚家族在出生后鸭心脏和肝脏发育中的表达模式与功能特性，并可为解决肉禽内脏器官发育滞后的问题提供理论参考。
1 材料与方法 1.1 试验动物与样品采集本试验选取的农华麻羽肉鸭均来自四川农业大学水禽育种试验农场，所有肉鸭的饲养管理条件一致，且按照常规程序进行免疫。在0、2、4、6、8周龄时，均随机选取6只健康母鸭屠宰，按照相应国家标准(NY/T823-2004)测定活重、心脏重量和肝脏重量，并计算心脏指数和肝脏指数(器官指数(%)=(器官重量/活重)×100%)，同时采集心脏和肝脏组织于－80 ℃冷冻保存。
1.2 心脏和肝脏组织RNA提取和cDNA制备各组织样本的总RNA按照Trizol(Invitrogen，USA)的操作说明书提取，用核酸蛋白检测仪(Bio-Rad，USA)和1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量。经检测合格的总RNA使用反转录试剂盒(TaKaRa，JPN)合成cDNA，于-20 ℃保存备用。
1.3 鸭GATA4/5/6基因克隆及生物信息学分析根据GenBank中鸭GATA4/5/6的序列(登录号分别为：XM_013107502.2、XM_005031716.2、XM_005031717.1)，采用Primer Premier 5.0软件设计9对扩增引物(表 1)，引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。PCR采用10 μL仅应体系：上、下游引物各0.4 μL，模板1 μL，Master Mix 5 μL，ddH2O 3.2 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，退火温度(表 1)退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳确认后，用胶回收试剂盒(Omega，USA)回收，回收产物连接pMD19-T(TaKaRa)载体，转化至DH5α感受态细胞中。PCR检测阳性克隆后，挑选阳性菌液送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。
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表 1 扩增引物信息表 Table 1 PCR primer informations used in this study |
序列分析：将本次克隆所获得的鸭GATA4/5/6基因序列翻译为氨基酸后，利用NCBI的CCD在线工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)对鸭GATA4/5/6序列的结构域进行预测。利用Clustal omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)分别进行GATA4/5/6序列不同物种间的同源性比对和氨基酸序列的比对，使用MEGA6软件，采用NJ算法，Bootstrap设为1 000，构建GATA4/5/6的分子进化树。利用ExPASy Proteomics Server的Protparam在线工具(http://web.expasy.org/protparam/)进行氨基酸组成成分分析和预测鸭GATA4/5/6编码蛋白理化性质。通过NLS Mapper(http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi)预测鸭GATA4/5/6基因的核定位序列。
1.4 qRT-PCR检测GATA4/5/6基因在出生后鸭心脏和肝脏中的表达量根据克隆得到的GATA4/5/6基因编码区序列和GenBank中鸭GAPDH(登录号：AY436595)和β-actin(登录号：EF667345)序列设计荧光定量引物(表 2)，委托成都擎科生物技术有限公司合成。通过绘制标准曲线验证引物的特异性。以各组织的cDNA为模板，使用GAPDH和β-actin为内参基因，采用SYBR Premix Ex Taq为荧光染料，用Bio-Rad CFX荧光定量PCR仪检测GATA4/5/6在鸭心脏和肝脏中的相对表达量，各个样品重复3次。采用12.5 μL反应体系：上下游引物各1 μL，荧光标记MIX 6.25 μL，cDNA模板4.25 μL。反应条件：95 ℃预变性10 s；95 ℃变性15 s，退火温度(如表 2)退火30 s，40个循环。循环结束后通过熔解曲线检测PCR产物的特异性。
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表 2 定量引物信息表 Table 2 qRT-PCR primer informations used in this study |
对于qRT-PCR结果，以GAPDH和β-actin为内参基因，运用2-ΔΔCt法[26]计算GATA4/5/6的相对表达量，随后采用SPSS20.0软件进行单因素方差分析，并用Duncan法进行多重比较，以P < 0.05为差异显著性判断标准。此外，采用SPSS20.0软件对GATA4/5/6的相对表达量与肉鸭心脏、肝脏重量和指数进行相关性分析，并计算Pearson相关系数。
2 结果 2.1 鸭GATA4/5/6基因克隆及其序列同源性分析克隆得到的鸭GATA4/5/6基因cDNA序列长度分别为1 392、1 428、1 239 bp，各自包含长度为1 242、1 182、1 173 bp的完整编码区，分别编码413、393、390个氨基酸(图 1)。通过预测蛋白质理化性质，发现鸭GATA4/5/6编码蛋白均具有不稳定性，呈现亲水性，属于可溶性蛋白。经Clustal omega在线比对发现，鸭GATA4基因核苷酸和氨基酸序列均与鹅的相似性最高，分别为98.11%、99.24%；鸭GATA5基因核苷酸和氨基酸序列均与原鸡的相似性最高，分别为93.71%、96.88%；鸭GATA6基因核苷酸和氨基酸序列分别与原鸡和鹅的相似性最高，为91.67%、96.56%(表 3)。
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*代表终止密码子，灰底区域为编码区序列 * represents the termination codon, and the gray areas indicate the coding region sequences 图 1 鸭GATA4(A)、GATA5(B)、GATA6(C)基因核苷酸及氨基酸序列 Fig. 1 Nucleotide and amino acid sequences of GATA4 (A), GATA5(B) and GATA6(C) genes in ducks |
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表 3 鸭与其他物种GATA4/5/6基因编码区核苷酸与氨基酸序列同源性分析 Table 3 Homology analysis of nucleic acid and amino acid sequences of GATA4/5/6 genes from duck and other species |
通过NLS Mapper在线预测发现，鸭GATA4/5/6均存在一段序列为“QTRKRKPKNI”的核定位序列，这与其作为转录因子的功能相符。利用NCBI的CCD在线工具预测GATA4/5/6的蛋白结构域，发现鸭GATA4/5/6均存在1个GATA-N转录激活域，1个N端锌指结构域和1个C端锌指结构域(图 2)。脊椎动物的多序列比对结果显示(图 3)，鸭GATA4/5/6的GATA-N转录激活域仅与鸟类的同一结构域较为保守，而GATA4/5/6的2个锌指结构在所有物种中均很保守。
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黑色区域为GATA-N结构域，灰色区域为锌指结构域 The black areas in figure are the GATA-N structure domains, the gray areas are the zinc finger structure domains 图 2 鸭GATA4/5/6结构域分布示意图 Fig. 2 Schematic diagram of duck GATA4/5/6 structure domains location |
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“-”为与鸭完全一致的氨基酸序列，为了获得最佳对齐而引入的间隙用“.”表示 "-" are the amino acid sequences identical to that of duck, and the gaps introduced for optimal alignment are denoted by ". " 图 3 各物种间GATA4(A)、GATA5(B)、GATA6(C)结构域比较 Fig. 3 Comparison of GATA4 (A), GATA5 (B) and GATA6 (C) domains among different species |
此外，本研究构建的GATA4/5/6分子进化树显示(图 4)，GATA4聚为一类，而GATA5与GATA6被分为另一个较新的类群。另一方面，比对鸭GATA4/5/6序列发现(图 5)，鸭GATA4/5/6的核定位序列完全一致；鸭GATA4/5/6的GATA-N端转录激活域间存在较大差异，鸭GATA4与GATA5、GATA6的GATA-N端转录激活域氨基酸一致率为45.56%和45.03%，GATA5与GATA6的GATA-N端转录激活域氨基酸一致率为44.24%；GATA4与GATA5、GATA6的N端锌指结构域氨基酸一致率为94%和57.64%，GATA5与GATA6的N端锌指结构域氨基酸一致率为56.00%，GATA6的N端锌指结构域末端缺失了一段“RPLF(-)KRQR(K)RLSA(S)SRR”序列；GATA4与GATA5、GATA6的C端锌指结构域氨基酸一致率为71.16%和98.08%，GATA5与GATA6的C端锌指结构域氨基酸一致率为71.16%，GATA5的C端锌指结构域前端缺失了一段“SCANCHTTTTT”序列。
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图 4 GATA4/5/6系统进化树 Fig. 4 GATA4/5/6 phylogenetic tree |
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“-”为与鸭完全一致的氨基酸序列，为了获得最佳对齐而引入的间隙用“.”表示 "-" are the amino acid sequences identical to that of duck, and the gaps introduced for optimal alignment are denoted by ". " 图 5 鸭GATA4/5/6基因GATA-N(A)、N端锌指(B)、C端锌指(C)结构域同源性比较分析 Fig. 5 The structural domain homology of duck GATA4/5/6 GATA-N (A), N-terminal zinc finger domain(B) and C-terminal zinc finger domain(C) |
qRT-PCR结果显示(图 6A)，GATA4/5/6在出生后鸭各时期心脏中均有表达。在出生后心脏的发育过程中，GATA4的表达量呈现逐渐降低的趋势，GATA4在0周龄的表达量显著高于2、4、6、8周龄(P < 0.05)，但其余周龄的表达量间无显著差异(P>0.05)；GATA5和GATA6的表达量均呈现先增加再降低的趋势、且均在6周龄时达到最大值，GATA5在各周龄的表达量均差异不显著，GATA6在6周龄的表达量显著高于8周龄(P < 0.05)，但其余周龄的表达量间差异不显著(P>0.05)。
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同组数据上所标字母相异表示差异显著(P < 0.05)，所标字母相同表示差异不显著(P>0.05) The different letters in the same group mean significant difference (P < 0.05), while the same letter means no significant difference (P>0.05) 图 6 GATA4/5/6 mRNA在鸭出生后0~8周龄心脏(A)和肝脏(B)中的表达 Fig. 6 Expression of GATA4/5/6 in the heart (A) and liver (B) of postnatal ducks at 0-8 weeks of age |
在出生后肝脏的发育过程中(图 6B)，GATA4的表达量呈现逐渐增加的趋势，GATA4在6和8周龄的表达量显著高于0、2和4周龄(P < 0.05)，但其余周龄均无显著差异(P>0.05)。GATA5的表达量呈先上升后下降的趋势，GATA5在2~4周龄的表达量显著高于8周龄(P < 0.05)。GATA6的表达量在4周龄达到最高，但GATA6在各周龄的表达量没有显著差异(P < 0.05)。
2.4 鸭GATA4/5/6表达水平与心脏和肝脏早期发育的相关性分析本试验测定了各周龄鸭的活重以及心脏和肝脏的重量。结合GATA4/5/6在鸭心脏和肝脏中各周龄的表达量应用Graphpad Prism 5.0绘制散点图，并作相关性和线性分析，如图 7所示。通过散点图发现，心脏和肝脏的重量与GATA4的表达量均呈极显著相关(P < 0.01)，与GATA5/6的表达量无显著相关性(P>0.05)。心脏指数和肝脏指数与3个基因的表达量均无显著相关性(P>0.05)。
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图 7 GATA4/5/6基因(A/B/C)在鸭心脏和肝脏中表达量与表型相关性散点图 Fig. 7 Scatter plot of correlation between GATA4/5/6 genes(A/B/C) expression and phenotypes of heart and liver of duck |
本试验成功克隆得到鸭GATA4/5/6基因CDS区序列，长度分别为1 242、1 182、1 173 bp，各自编码413、393、390个氨基酸。根据结构域预测的结果，鸭GATA4/5/6均含有1个GATA-N转录激活结构域和2个Ⅳ型锌指结构域(N端锌指结构域和C端锌指结构域)。多序列比对发现，GATA4/5/6的GATA-N转录激活结构域均在物种间存在明显的序列差异，而2个锌指结构的保守性均很高。转录激活结构域在DNA结合区与DNA分子特异性结合后激活转录的起始[27]。C端锌指结构域已经被证明是特定结合到GATA识别序列的必要条件，通常介导GATA因子的蛋白-蛋白相互作用[28], N端锌指结构域有助于其与DNA结合的完全特异性和稳定性[29-30]。不同的转录激活蛋白的转录激活区可相互取代, 而不影响其激活能力，而DNA结合域通过特异识别不同的核苷酸顺序来调控不同的基因表达[27]。因此，上述现象可能和结构域的功能有关，GATA-N转录激活结构域中的序列变异对结构域功能的影响可能更小。本研究分析了各个结构域在鸭GATA4/5/6间的序列差异。对于GATA-N端转录激活域，3个基因间的氨基酸一致率仅为40%~50%。对于N端和C端锌指结构域，GATA5和GATA6相对于GATA4分别在C端锌指结构域和N端锌指结构域缺失了一段“RPLF(-)KRQR(K)RLSA(S)SRR”和“SCANCHTTTTT”序列，Morrisey等[28]在鸡上的研究也有类似的结果。但是，锌指结构域在3个基因间共有区域中的氨基酸一致率均高于90%，这与史荣华等[31-32]在斑马鱼上的发现一致。GATA-N端转录激活域中的大量序列变异暗示了鸭GATA4/5/6间的功能差异，而GATA5和GATA6在锌指结构域中的序列缺失则提示鸭GATA4可能具有更重要的作用。先前的报道中，GATA4遗传性的突变会造成先天性心脏缺陷[33], 而GATA5的无效胚胎并不会出现心脏畸形[34]，GATA6与GATA4同时缺失才会而引起先天性心脏病[35]。此外，多物种的分子进化树显示，GATA5与GATA6形成了一个独立的类群。这一结果也支持了鸭GATA4与GATA5/6的差异性。
为了解GATA4/5/6在肉鸭出生后心脏和肝脏中的表达模式，本研究检测了它们在0~8周龄期间的相对表达量。从整体上来看，GATA4/5/6在0~8周龄期间的相对表达量一直维持在较高水平。这暗示GATA4/5/6在肉鸭出生后心脏和肝脏发育过程中均具有较为重要的作用。但在鸡上的Northern blot结果显示，GATA4/5在出生后的肝脏中不表达[36]，在小鼠中3个基因仅有GATA5极少或不表达于成体肝脏[37]，这可能是由于试验方法不同造成的差异。GATA4在鸭心脏中的表达量随着年龄的增长逐渐降低，在鸭肝脏中的表达量随着年龄的增长逐渐升高。前人的研究发现，GATA4在出生后小鼠心脏[38]和肝脏[39]中的表达量均呈缓慢下降趋势，推测这可能是出生后年龄变化带来的结果。GATA5在出生后各阶段小鼠心脏中的表达量无显著差异且持续较高(GEO数据库：Profile. GDS5003/1450126_at)，这与本研究结果一致。GATA6在鸭心脏中的表达在第6周达到最高值，并呈现先上升后下降的趋势，在鸭肝脏中的表达无显著变化，这与对出生后小鼠的研究结果一致(BGEE数据库：UBERON:0000948，UBERON:0002107)。从基因间来看，GATA4随着年龄变化而发生的表达量变化更为明显。这再一次印证了鸭GATA4功能与出生后心脏和肝脏发育的关系可能更为密切。
最后，为了明确GATA4/5/6对肉鸭出生后心脏和肝脏发育的影响，本研究测定了0~8周龄期间器官重量和指数，并与0~8周龄期间的相对表达量作相关分析。结果表明，心脏和肝脏的重量与GATA4的表达量呈极显著相关(P < 0.01)，而心脏、肝脏重量和器官指数与GATA5/6的表达量均不显著相关(P>0.05)。研究表明，尽管GATA4/5/6可能在发育中的脊椎动物内脏器官中部分或完全辅助性地发挥冗余功能，但GATA4/5/6转录因子亚家族的每个成员在脊椎动物发育过程中都发挥着独特的功能[37]。结合序列分析、表达模式和相关分析的结果，推测相对于GATA5/6，鸭GATA4与出生后心脏和肝脏发育的关系更为密切。
4 结论本试验成功克隆得到鸭GATA4/5/6基因CDS区序列，长度分别为1 242、1 182、1 175 bp，各自编码413、393、390个氨基酸。试验结果初步揭示，GATA4/5/6基因在出生后鸭心脏和肝脏发育中具有各自特异的表达模式，而GATA4与出生后鸭心脏和肝脏发育的关系可能更为密切。
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