, GUO Yulong, LIU Yadan, LIU Juan, SHI Wenqian, DONG Lei, CAI Chunbo, CAO Guoqing, LI Bugao, GAO Pengfei
哺乳动物的胃肠道微生物群是由大约1014个细菌组成的微生物集合，约含有500~1 000种不断与宿主和其他微生物群落成员相互作用的细菌种类[1]。研究表明，哺乳动物出生后肠道迅速被复杂的微生物群落定植，稳定的微生物群系对宿主有重要作用，包括能量平衡、新陈代谢、肠道上皮健康、免疫功能和神经发育等[2]。肠道微生物群的建立不仅是生态意义上的继承，也是内部和外部综合因素共同作用下形成的复杂过程。饮食差异、遗传因素、疾病干扰及药物使用都会影响肠道微生物群，导致短暂或持续的生态失调[3-6]。了解菌群早期定植及肠道特异菌群，对于深入了解微生物群系是如何形成的至关重要。一旦肠道建立微生物群，肠道微生物就会迅速发挥相应的作用，在此过程中，其组成和功能会逐渐趋于成熟稳定[7]。如果在哺乳期快速建立稳定的成年阶段的微生物群落，可能会对其终生健康有重大的影响[8]。
在出生之前，所有哺乳动物被认为是无菌的，新生儿会通过与母体和环境微生物的接触接种肠道微生物[9-10]。有研究发现，厚壁菌门和拟杆菌门均为肠道的主要菌门[11]。猪不同发育阶段的肠道微生物差异显著，相同日龄猪的肠道菌群彼此更相似[12]，哺乳期和保育期仔猪肠道微生物有显著区别[13]。哺乳动物为了适应从母乳到固体食物的饮食变化，胃肠道微生物结构也会发生很大改变，肠道稳态也会受到极大挑战[14-15]。在仔猪早期发育过程中，面临多次日粮结构的改变，如在其发育早期预先了解肠道微生物的结构特点，可能有助于制定指导促进肠道微生物健康形成的策略，然后可以在实际生产中应用这些策略。
马身猪是国家级猪遗传资源保护品种，具有产仔多、肉质好、耐粗饲、抗逆性强等优点，而且在高寒低营养水平下仍能维持正常繁殖，是我国地方猪种的典型代表。晋汾白猪是以马身猪、二花脸、长白猪和大白猪为亲本，经多年选育而成并通过国家审定的培育品种，具有繁殖力高、生长速度快、肉质好等特点。在生产中发现，与大白猪、长白猪等国外品种相比，晋汾白猪因含有马身猪6.25%的血液，具有非常好的耐粗饲和抗病性能，特别是在仔猪阶段表现的更为突出。尽管猪的遗传组成是影响其耐粗饲、抗病性等的关键因素，但肠道微生物与宿主之间的相互作用很可能也是影响这些特性的重要因素，对这两个品种猪微生物群落动态分布的研究可能有助于了解它们在影响宿主功能方面的作用。本研究以马身猪和晋汾白猪两个品种为研究对象，分析仔猪出生、断奶、保育3个阶段结肠中微生物菌群结构，找出两品种在肠道微生物发展、定植及结构上的异同点，为更深入研究肠道微生物群落的复杂动态以及对猪生产性能的作用机制提供理论参考。
1 材料与方法 1.1 试验动物和样品采集马身猪和晋汾白猪均饲养在大同种猪场(中国山西省)，统一饲养管理。分别选择晋汾白猪和马身猪母猪各3头，胎次均为第4胎，母猪产前及产后没有不良症状，没有接受过药物治疗，所有饲粮都不含任何益生菌、抗生素或其他药物。仔猪在28日龄断奶后分别转群至保育舍分栏单窝饲喂。
试验分别在仔猪1(出生)、28(断奶)和70日龄(保育后期)3个时间点各窝随机挑选体重相近的3头公猪进行前腔静脉采血5 mL，4 ℃ 4 000 r·min-1离心10 min分离血清。采集血液后进行屠宰，取结肠内容物样品收集于1.5 mL冻存管中，液氮保存备用。
1.2 血清生化指标检测采用ELISA检测技术测定血清中内毒素(LPS)、二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸(D-LA)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)等相关血清指标[16-18]。相关ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，通过Synergy H1/H1MFD全功能酶标仪(BioTek，美国)进行测定。
1.3 样品DNA抽提和目标片段的PCR扩增肠道内容物DNA的提取采用北京天根生物科技有限公司产品TIANGEN-Magnetic Soil And Stool DNA Kit试剂盒进行，并检测其DNA纯度、浓度及质量。根据细菌V3-V4可变区进行引物设计，引物序列：341F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，进行PCR扩增。扩增体系：5×FastPfu缓冲液4 μL，2.5 mmol·L-1 dNTPs 2 μL，上、下游引物(5 μmol·L-1)各0.8 μL，FastPfu聚合酶0.4 μL，10 ng DNA，ddH2O补至20 μL。扩增程序：95 ℃预变性3 min；27个循环(95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)；最后72 ℃延伸10 min。
1.4 16S rDNA测序分析与数据拼接处理PCR产物经DNA凝胶回收试剂盒(Axygen，美国)进行回收，采用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega，美国)进行定量检测。样品在上海美吉生物医药科技有限公司Miseq PE300平台进行检测。序列数据根据PE reads之间的重叠关系，使用FLASH软件进行拼接，采用Trimmomatic软件对拼接质量进行质控过滤，并校正序列方向。
1.5 OTU菌群聚类分析使用Usearch软件(version 7.1 http://drive5.com/uparse/)对优化序列进行OTU (Operational Taxonomic Units)聚类分析，将所有优化序列比对至OTU代表序列，筛选与OTU代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU分析结果。
1.6 猪肠道微生物多样性分析采用Mothur[19](v.1.34.0)软件进行菌群Alpha多样性分析，计算不同随机抽样下多样性指数，即PD指数(https://www.mothur.org/wiki/Phylogenetic_diversity)、Sobs指数(http://www.mothur.org/wiki/Sobs)、Ace指数(http://www.mothur.org/wiki/Ace)、Chao1指数(http://www.mothur.org/wiki/Chao)、Shannon指数(http://www.mothur.org/wiki/Shannon)和Simpson指数(http://www.mothur.org/wiki/Simpson)。采用GraphPad Prism(v.7.0.1)软件进行显著性检验。利用R Studio(v.3.0.2)软件基于加权的UniFrac距离[20]进行主成分分析(principle coordination analysis，PCoA)。使用97%相似度的OTU，利用Mothur做Rarefaction分析，利用R Studio(v.3.0.2)工具制作稀释曲线图[21]。
1.7 猪肠道微生物分类学统计分析根据SILVA细菌数据库[22](Release128 http://www.arb-silva.de)，采用RDP classifier贝叶斯算法[23]对OTU代表序列进行分类学分析，并在门(phylum)、纲(class)、目(order)、科(family)、属(genus)5个水平上统计每个样品的肠道群落组成。使用Wilcox秩和检验(Wilcoxon rank-sum test)对两品种猪各个日龄及品种间微生物群落在门和属水平上进行假设检验，评估物种丰度的显著差异，分析组间显著性差异物种。利用LEfSe软件(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/root?tool_id=lefse_upload)，根据分类学组成对样本按照不同的分组条件进行线性判别分析(LDA)，获得对两个品种仔猪各阶段产生显著影响的微生物菌属。
1.8 肠道微生物多样性与环境因子关联分析使用R软件vegan包(http://CRAN.R-project.org/package=vegan)进行血清免疫指标与肠道差异菌属关联分析。通过计算环境因子与所选菌属之间的Spearman相关系数，将获得的数值矩阵通过pheatmap程序绘制Heatmap结果。
1.9 统计分析利用SPSS23.0软件对各血液指标差异进行分析，同一日龄间采用t检验分析，同品种的不同日龄间采用单因素方差分析，选用SSR法进行组间比较。
2 结果 2.1 马身猪和晋汾白猪血清生化指标检测马身猪和晋汾白猪血清免疫指标检测结果见表 1。随着仔猪的生长发育，血清中的免疫指标也发生了明显变化。在仔猪断奶前，血清中LPS浓度处于高水平，极显著高于70天(P < 0.01)，说明在保育后期仔猪肠道微生物趋于平稳。而TNF-α浓度随着仔猪生长出现升高的趋势，特别是马身猪70日龄时TNF-α浓度显著高于1(P < 0.01)和28日龄时的浓度(P < 0.05)。两个品种仔猪血清中DAO浓度存在先升高后降低的趋势，在28日龄时处于最高水平。在马身猪仔猪血清中D-LA和IL-6浓度在70日龄时达到最大值，但在晋汾白猪中28日龄达到最大值。
|
表 1 血清指标检测结果 Table 1 The detection results of serum indexes |
本试验采用341F和806R引物，以肠道内容物DNA为模板进行PCR扩增试验，图 1为PCR产物的电泳检测结果。从图中可以看出，PCR目的条带大小正确，浓度合适，可进行后续试验。采用Mothur软件进行稀释曲线分析，结果见图 2。图中分别呈现了Shannon和Sobs稀释曲线，可见稀释曲线均达到了平台期，包含了样本中绝大多数微生物多样性的信息。
|
图 1 PCR产物电泳检测结果 Fig. 1 The electrophoresis results of PCR products |
|
图 2 稀释曲线分析结果 Fig. 2 Analysis results of dilution curves |
16S rRNA测序结果经过滤质控后获得了894 346条序列，共获得1 198个OTU，每个样品平均获得274个OTU，晋汾白猪仔猪在3个时间段检测获得的OTU分别为173、461、169个，而马身猪仔猪在3个时间段分别检测获得的OTU为205、285、356个。两个品种猪相比，晋汾白猪特有OTU为351个，马身猪特有OTU为242个。
2.4 猪肠道微生物多样性分析基于加权UniFrac距离进行主成分分析，在门水平分析发现，晋汾白猪与马身猪的仔猪结肠菌群不能完全区分(图 3A)。在属水平分析发现，不同品种初生(1日龄)仔猪也聚在一起，但在断奶(28日龄)和保育期后期(70日龄)肠道菌群能明显区分(图 3B)。α多样性分析结果发现，Sobs、Ace、Chao1、Shannon指数与PD指数的变化趋势基本一致，Simpson指数的变化与上述指数变化呈相反趋势(图 3C)。随着仔猪生长发育，晋汾白猪肠道微生物多样性出现显著升高，在仔猪保育阶段(28~70日龄)基本趋于稳定。而在马身猪中，肠道微生物多样性出现先升高后降低的趋势，断奶阶段(28日龄)微生物多样性最高，极显著高于其他两个检测点(P < 0.01)。
|
A.晋汾白猪与马身猪整体主成分分析结果；B.晋汾白猪与马身猪3个时期主成分分析结果；C. Alpha多样性指数分析结果。不同大写字母表示同一品种不同日龄间差异极显著(P < 0.01)，不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。**和*分别表示同一日龄不同品种间差异极显著(P < 0.01)和差异显著(P < 0.05) A. The principle coordination analysis of the Jinfen White and the Mashen pigs; B. The principle coordination analysis of Jinfen White and Mashen pigs at different stages; C. The analysis results of alpha diversity indexes. Different capital letters indicate extremely significant differences (P < 0.01) among different stages in the same breed, and different small letters indicate significant differences (P < 0.05) among different stages in the same breed. ** and * indicate significant difference between Jinfen White and Mashen pigs at the same age at the level of 0.01 and 0.05, respectively 图 3 马身猪和晋汾白猪结肠微生物多样性分析结果 Fig. 3 Analysis results of colon microbial diversity of Mashen and Jinfen White pigs |
分类学分析结果表明，微生物菌群分布于15个门。其中厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为优势菌门，平均所占比例分别为49.03%、31.94%(图 4A)。随着日龄的逐渐增加，马身猪和晋汾白猪仔猪结肠中，厚壁菌门丰度呈逐渐升高的趋势，刚出生时两品种猪间差异不大，约占30%左右，但在28和70日龄时，晋汾白猪结肠中的比例(63.5%~66.5%)均高于马身猪(47.8%~52.5%)。晋汾白猪仔猪3个时期结肠中拟杆菌门丰度比较稳定，占比为28.2%~31.1%，但在马身猪仔猪中所占的比例存在先降低后升高的明显变化，刚出生时所占比例为34.7%，但在28日龄显著降低至23.2%，在70日龄时增加至46.0%。变形菌门(Proteobacteria)和梭杆菌门(Fusobacteria)丰度在两个品种仔猪断奶后均处于低水平，在出生时品种间存在显著差异。在晋汾白猪仔猪1日龄时变形菌门的比例为23.5%，但马身猪中仅为4.2%。与变形菌门相反，马身猪仔猪1日龄时梭杆菌门占27.6%的比例，显著高于晋汾白猪(17.2%)。进一步分析表明，15个门中包含28个纲、59个目、100个科、290个属。在菌属水平分析发现，乳酸杆菌属(Lactobacillus)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、拟杆菌属(Bacteroides)、狭义梭状芽孢杆菌属(Clostridium sensu stricto 1)所占比例均比较高(图 4B)。马身猪仔猪中乳酸杆菌属丰度比较高，特别是在初生时，比例达到22.7%，在断奶时下降至17.6%；而在晋汾白猪仔猪中乳酸杆菌丰度均显著低于马身猪，在断奶时丰度最高为9.2%。梭杆菌属(Fusobacterium)仅在两个品种初生仔猪中存在，而且丰度比较高，晋汾白猪中丰度为17.2%，马身猪中为27.6%。采用Wilcoxon秩和检验分析发现，两品种猪各阶段在门水平无显著差异菌门(图 5A)，但在属水平发现了8个显著差异的菌属(图 5B)，均属厚壁菌门，分别是乳酸杆菌属、狭义梭状芽孢杆菌属、假丁酸弧菌属(Pseudobutyrivibrio)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)、韦荣球菌UCG 003(Erysipelotrichaceae UCG 003)、毛螺菌科UCG 003(Lachnospiraceae UCG 003)、[Eubacterium] brachy group及毛螺菌科ND3007(Lachnospiraceae ND3007)。
|
A.两个品种肠道微生物门水平组成分析结果；B.两个品种肠道微生物属水平组成分析结果 A. The colon microbes composition of Mashen pig and Jinfen White pig at phylum level. B. The colon microbes composition of Mashen pig and Jinfen White pig at genus level 图 4 两品种猪肠道微生物相对丰度和组间差异分析结果 Fig. 4 Analysis of relative abundance and differences between two breeds of intestinal microbes |
|
A.两个品种间结肠微生物门水平组间差异分析结果; B.两个品种间结肠微生物属水平组间差异分析结果 A. The difference analysis of colon microbes composition between Mashen and Jinfen White pigs at phyla level; B. The difference analysis of colon microbes composition between Mashen and Jinfen White pigs at genus level 图 5 两品种间肠道微生物组间差异分析结果 Fig. 5 Analysis results of intestinal microbial between two breeds |
为了鉴定马身猪和晋汾白猪不同日龄肠道的特定微生物分类群，在两品种仔猪中进行组内LEfSe多级物种差异判别分析。分析发现，1日龄晋汾白猪仔猪结肠中厚壁菌门的断链真杆菌(Eubacterium fissicatena)和变形菌门的巴斯德菌科(Pasteurellaceae)为特异性菌属，在28日龄仔猪结肠中富集有4个差异菌门，其中厚壁菌门包含韦荣球菌科UCG 003菌属(Erysipelotrichaceae UCG 003)、瘤胃球菌科UCG 002菌属(Ruminococcaceae UCG 002)，粪球菌属3(Coprococcus 3)等30个特异菌属，拟杆菌门中富集到2个理研菌科肠道RC9菌属(Rikenellaceae RC9 gut group)、5个普雷沃氏菌属(Prevotella 1、Prevotellaceae UCG 001、Prevotellaceae UCG 003、Prevotellaceae NK3B31和g unclassified f Prevotellaceae)、紫单胞菌属(Parabacteroides)和norank f p 2534 18B5 gut group等差异菌属，同时也在螺旋体门(Spirochaetae)和放线菌门(Actinobacteria)各发现了1个差异菌属(图 6A)。在晋汾白猪仔猪70日龄时结肠中显著富集到4个特异菌门，其中Firmicutes包含假丁酸弧菌属、乳酸杆菌属、挑剔真杆菌(Eubacterium eligens)、链球菌属(Streptococcus)等16个差异菌属，变形菌门中特异菌属为萨特氏菌属(Sutterella)，拟杆菌门包含有3个特异菌属，分别为2株普雷沃氏菌(Prevotella 2和Prevotella 9)和拟杆菌属S24-7(Bacteroidales S24-7)，而放线菌门中仅发现柯林斯菌属(Collinsella)为特异菌属(图 6B)。
|
A. LEfSe多级物种层级树图；B. LDA判别结果图 A. LEfSe multi-level species hierarchical tree map; B. LDA discriminant results map 图 6 晋汾白猪肠道微生物群落LEfSe多级物种差异判别分析结果 Fig. 6 LEfSe multi-level species difference discriminant analysis results of intestinal microflora in Jinfen White pig |
分析发现，马身猪仔猪中特异性菌属比晋汾白猪仔猪明显减少(图 7A和7B)。在马身猪仔猪1日龄结肠中显著富集到2个特异菌门，分别是变形菌门和拟杆菌门，其中变形菌门的特异菌属为假单胞菌属(Pseudomonas)，拟杆菌门中存在Butyricimonas和另枝菌属(Alistipes)。仔猪28日龄时结肠有厚壁菌门及拟杆菌门两个差异菌门，其中厚壁菌门中包含产氢厌氧杆菌属(Hydrogenoanaerobacterium)、Candidatus Soleaferrea、Terrisporobacter等7个特异菌属，拟杆菌门仅有Odoribacter 1个特异菌属；在70日龄仔猪结肠中富集到3个特异菌门，与晋汾白猪富集结果非常相似，变形菌门的萨特氏菌属、厚壁菌门的毛螺菌科菌属和链球菌属及拟杆菌门的普雷沃氏菌9都被显著特异性富集，同时发现特奈瑟氏菌科(Neisseriaceae)和瘤胃球菌科菌属也被显著富集。两个品种之间相比，螺旋体门及放线菌门仅在晋汾白猪中被特异性富集。
|
A. LEfSe多级物种层级树图；B. LDA判别结果图 A. LEfSe multi-level species hierarchical tree map; B. LDA discriminant results map 图 7 马身猪肠道微生物群落LEfSe多级物种差异判别分析结果 Fig. 7 LEfSe multi-level species difference discriminant analysis results of intestinal microflora in Mashen pig |
通过多样本典型相关分析(canonical correlation analysis，CCA)对丰度前50的肠道微生物群与血清指标进行相关性分析，发现LPS、TNF-α、IL-6与肠道菌群之间存在显著相关性(P < 0.05)，而DAO和D-LA相关性不显著(P>0.05)(表 2，图 8)。晋汾白猪中没有发现与LPS存在显著正相关的菌群，而发现假丁酸弧菌属、粪杆菌属(Faecalibacterium)、拟杆菌属S24-7、罕见小球菌属(Subdoligranulum)、劳特氏菌属(Blautia)与LPS存在显著负相关(图 9)；在马身猪中发现假单胞菌、断链真杆菌、Butyricimonas和狭义梭状芽孢杆菌属与LPS呈显著正相关，而3种普雷沃氏菌(Prevotella 9、Prevotellaceae UCG 003、Prevotellaceae NK3B31)、瘤胃菌科、链球菌等与其呈显著负相关(图 10)。TNF-α关联的菌群与LPS相反，其在马身猪肠道中与Butyricimonas呈显著负相关，与普雷沃氏菌、瘤胃菌科、链球菌等呈显著正相关；在晋汾白猪中却没有出现TNF-α关联菌群与LPS相反的结果，通过分析发现，链球菌、放线菌、梭状芽胞杆菌和Butyricicoccus与TNF-α呈显著正相关，而瘤胃球菌属和毛螺菌科菌属与TNF-α呈显著负相关。马身猪中, IL-6均与链球菌属、普雷沃氏菌UCG 003、瘤胃菌属UCG 005呈显著正相关，与另枝菌属呈显著负相关；晋汾白猪中, IL-6均与瘤胃球菌属(Ruminococcus 1和Ruminococcus UCG 014)、乳酸菌属、毛螺菌XPB1014(LachnospiraceaeXPB1014)呈显著正相关，与链球菌属、普雷沃氏菌(1和9)呈显著负相关。
|
|
表 2 肠道微生物与血清指标CCA分析结果 Table 2 CCA analysis results of intestinal microbes and serum indicators |
|
图 8 肠道微生物与血清指标CCA分析结果 Fig. 8 CCA analysis results of intestinal microbes and serum indicators |
|
*. P < 0.05; **. P < 0.01, the same as below 图 9 晋汾白猪肠道菌群与血清指标相关性热图 Fig. 9 Correlation heatmap between intestinal microflora and serum indexes in Jinfen White pig |
|
图 10 马身猪肠道菌群与血清指标相关性热图 Fig. 10 Correlation heatmap between intestinal microflora and serum indexes in Mashen pig |
哺乳动物肠道微生物的发展及定植是一个动态变化的过程，在动物成长的每个时间段内都会形成发挥相应作用的特有菌群或者优势菌群[13, 24-25]。各种外来因素的介入都会打破肠道微生态的动态平衡，导致肠道黏膜免疫系统紊乱，发生过度免疫、肠道菌群失调，引发肠道疾病的产生[26-28]。有研究发现，猪的肠道微生物结构持续变化，从出生到哺乳期结束，菌群丰度不断增加，哺乳后期趋于稳定，保育期后基本形成相对稳定的微生态[29]，生长发育和饲粮的改变在此过程中具有重要的作用[11, 30]。本研究结果表明，晋汾白猪和马身猪出生第一天时肠道菌群多样性差异不显著，随日龄增加，两品种仔猪肠道菌群出现极显著差异，马身猪进入保育期(28~70日龄)后微生物多样性差异不显著，而在晋汾白猪中，肠道微生物多样性发生先升高后降低的显著变化，说明不同品种间肠道微生态的形成与成熟存在显著的差异，同时也反映出地方品种马身猪抗逆性强的特点。有研究表明，机体脂肪沉积与肠道微生物群的α多样性有关[31]，肥胖人群的肠道菌群α多样性相对较低[32]，体重过度增加者的肠道菌群α多样性也降低[33]。在屠宰时发现，马身猪仔猪断奶时(28日龄)颈部脂肪厚度显著高于晋汾白猪，而在此阶段马身猪的肠道微生物多样性显著低于晋汾白猪，也说明肠道微生物多样性可能与脂肪沉积相关。
众多研究表明，猪肠道主导菌群主要属于厚壁菌门和拟杆菌门[34-35]，随着生长发育的进行，在不同阶段的不同肠段中微生物丰度会出现显著变化[36-37]，当变形菌门的丰度升高时会导致肠道菌群失调，引发肠道炎症[38]。本研究结果也发现，两个品种猪结肠中的菌群主要是厚壁菌门和拟杆菌门，在仔猪出生当天结肠中变形菌门和梭杆菌门丰度较高，但在断奶后丰度均处于很低水平，说明仔猪刚出生时由于环境影响、肠道发育不完善、机体抵抗力较弱导致肠道变形菌门和梭杆菌门处于较高丰度。在本研究的两个品种之间发现的8个显著差异菌属均集中于厚壁菌门，有研究表明，根据厚壁菌门中的菌群丰度可以将不同日龄肠道菌群进行区分[39]，本研究结果也同样说明了这一点。普雷沃氏菌属是牛羊瘤胃中数量最多的一种微生物，有助于分解蛋白质和碳水化合物食物，不仅参与宿主的多糖降解和氨基酸代谢，并对猪肌内脂肪产生影响，还能够防御拟杆菌引起的葡萄糖耐受不良，促进肝糖原储存[40-41]。有研究发现，普雷沃氏菌在非洲儿童肠道中占细菌总数的53%，而在欧洲儿童的肠道中没有发现该菌属，表明普雷沃氏菌对纤维代谢具有重要作用[42]，提示马身猪的抗逆性能可能与该菌属的作用相关。本研究的两品种中均存在11种普雷沃氏菌，普遍存在于28和70日龄的肠道中，其中NK3B31丰度最高，在马身猪中达到21.6%。有研究发现，NK3B31与机体葡萄糖代谢呈正相关，可能参与淀粉降解，为结肠供能进而维护肠道健康[43]。本研究也发现，乳酸菌在两个品种之间丰度存在显著差异，这也可能是影响两个品种仔猪生长速度的原因之一。晋汾白猪中的特异性菌群富集到粪球菌属及理研菌属，这两个菌属对短链脂肪酸的产生具有重要作用[44]。有研究发现，另枝菌属与肥胖相关[45]，而且高脂饮食会引起该菌属丰度的增加[46]。本研究发现，马身猪特异性富集到另枝菌属，这可能与马身猪自身特点相关。有研究发现，脂肪因子、能量代谢[47]及丁酸盐代谢[48]都与毛螺菌科菌属有较强的相关性，本研究也同样在两品种肠道中检测到了该菌属，说明毛螺菌科菌属对于仔猪发育过程中能量代谢等机能具有重要的作用。
关联研究表明，LPS、TNF-α及IL-6与肠道菌群存在显著的相关性[49]，肠道微生物群调控上皮内淋巴细胞产生IL-6，维持上皮屏障功能稳态[50]。通过环境因子关联分析发现，LPS与假单胞菌属和狭义梭状芽孢杆菌属有极强正相关，与普雷沃氏菌科、拟杆菌属S24-7、罕见小球菌属、劳特氏菌属、粪杆菌属呈负相关。TNF-α与考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)和罗斯氏菌(Roseburia)均有显著的相关性。IL-6与瘤胃球菌科UCG 005、链球菌属、乳酸杆菌属、norank f Erysipelotrichaceae和瘤胃球菌科UCG 014等菌群有极强相关性。有研究发现，假单胞菌属和狭义梭状芽孢杆菌属在产生LPS的同时还会干扰机体免疫反应，加剧或引起相关疾病[51-52]。而普雷沃氏菌科、罕见小球菌属中的菌属能够产生短链脂肪酸，有效降低肠道通透性，减少炎症发生[53-54]，劳特氏菌属在肠道中介导抗炎作用[46]，拟杆菌属S24-7与炎症状态呈负相关[55]。本研究发现，乳酸杆菌与IL-6存在显著的相关性。有研究发现，乳酸杆菌不仅是肠道有益菌群，能够提高机体消化吸收能力，还可通过降低肠上皮细胞IL-6的产生，同时增加IL-10的表达，起到抗炎症作用，改善肠道失调引起的各种疾病，对于机体健康有着积极作用[56-57]。
4 结论本研究以地方品种马身猪和培育品种晋汾白猪为试验对象，对仔猪不同阶段的肠道微生物多样性进行分析，探讨了仔猪3个关键发育阶段结肠微生物的组成变化。仔猪断奶后肠道微生物多样性趋于稳定，但培育品种结肠微生物多样性显著高于地方品种，乳酸菌、普雷沃氏菌科等菌属与仔猪结肠炎性因子IL-6、LPS、TNF-α等血液指标具有显著关联，对仔猪免疫性能具有重要作用，该结果可为从微生物角度出发深入发掘地方品种猪(马身猪)的抗逆性提供研究基础，也为研究仔猪肠道微生态作用机制提供理论参考。
| [1] | XU J, GORDON J I. Honor thy symbionts[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(18): 10452–10459. DOI: 10.1073/pnas.1734063100 |
| [2] | BARKO P C, MCMICHAEL M A, SWANSON K S, et al. The gastrointestinal microbiome:a review[J]. J Vet Intern Med, 2018, 32(1): 9–25. DOI: 10.1111/jvim.14875 |
| [3] | MACKIE R I, SGHIR A, GASKINS H R. Developmental microbial ecology of the neonatal gastrointestinal tract[J]. Am J Clin Nutr, 1999, 69(5): 1035s–1045s. DOI: 10.1093/ajcn/69.5.1035s |
| [4] | LI P H, NIU Q, WEI Q T, et al. Microbial shifts in the porcine distal gut in response to diets supplemented with Enterococcus faecalis as alternatives to antibiotics[J]. Sci Rep, 2017, 7: 41395. DOI: 10.1038/srep41395 |
| [5] | TIMS S, DEROM C, JONKERS D M, et al. Microbiota conservation and BMI signatures in adult monozygotic twins[J]. ISME J, 2013, 7(4): 707–717. DOI: 10.1038/ismej.2012.146 |
| [6] | DUVALLET C, GIBBONS S M, GURRY T, et al. Meta-analysis of gut microbiome studies identifies disease-specific and shared responses[J]. Nat Commun, 2017, 8(1): 1784. DOI: 10.1038/s41467-017-01973-8 |
| [7] | AZAD M B, KONYA T, MAUGHAN H, et al. Gut microbiota of healthy Canadian infants:profiles by mode of delivery and infant diet at 4 months[J]. CMA J, 2013, 185(5): 385–394. DOI: 10.1503/cmaj.121189 |
| [8] | HILL C J, LYNCH D B, MURPHY K, et al. Evolution of gut microbiota composition from birth to 24 weeks in the INFANTMET Cohort[J]. Microbiome, 2017, 5(1): 4. DOI: 10.1186/s40168-016-0213-y |
| [9] | PALMER C, BIK E M, DIGIULIO D B, et al. Development of the human infant intestinal microbiota[J]. PLoS Biol, 2007, 5(7): e177. DOI: 10.1371/journal.pbio.0050177 |
| [10] | DOMINGUEZ-BELLO M G, COSTELLO E K, CONTRERAS M, et al. Delivery mode shapes the acquisition and structure of the initial microbiota across multiple body habitats in newborns[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(26): 11971–11975. DOI: 10.1073/pnas.1002601107 |
| [11] | KIM H B, BOREWICZ K, WHITE B A, et al. Longitudinal investigation of the age-related bacterial diversity in the feces of commercial pigs[J]. Vet Microbiol, 2011, 153(1-2): 124–133. DOI: 10.1016/j.vetmic.2011.05.021 |
| [12] | NIU Q, LI P H, HAO S S, et al. Dynamic distribution of the gut microbiota and the relationship with apparent crude fiber digestibility and growth stages in pigs[J]. Sci Rep, 2015, 5: 9938. DOI: 10.1038/srep09938 |
| [13] | FRESE S A, PARKER K, CALVERT C C, et al. Diet shapes the gut microbiome of pigs during nursing and weaning[J]. Microbiome, 2015, 3: 28. DOI: 10.1186/s40168-015-0091-8 |
| [14] | ZHONG H Z, PENDERS J, SHI Z, et al. Impact of early events and lifestyle on the gut microbiota and metabolic phenotypes in young school-age children[J]. Microbiome, 2019, 7(1): 2. DOI: 10.1186/s40168-018-0608-z |
| [15] | AL NABHANI Z, DULAUROY S, MARQUES R, et al. A weaning reaction to microbiota is required for resistance to immunopathologies in the adult[J]. Immunity, 2019, 50(5): 1276–1288. DOI: 10.1016/j.immuni.2019.02.014 |
| [16] | HAMADA Y, SHINOHARA Y, YANO M, et al. Effect of the menstrual cycle on serum diamine oxidase levels in healthy women[J]. Clin Biochem, 2013, 46(1-2): 99–102. DOI: 10.1016/j.clinbiochem.2012.10.013 |
| [17] | CANI P D, BIBILONI R, KNAUF C, et al. Changes in gut microbiota control metabolic endotoxemia-induced inflammation in high-fat diet-induced obesity and diabetes in mice[J]. Diabetes, 2008, 57(6): 1470–1481. DOI: 10.2337/db07-1403 |
| [18] | XU R, LEI Y H, SHI J, et al. Effects of lactadherin on plasma D-lactic acid and small intestinal MUC2 and claudin-1 expression levels in rats with rotavirus-induced diarrhea[J]. Exp Ther Med, 2016, 11(3): 943–950. DOI: 10.3892/etm.2016.3015 |
| [19] | SCHLOSS P D, WESTCOTT S L, RYABIN T, et al. Introducing mothur:open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities[J]. Appl Environ Microbiol, 2009, 75(23): 7537–7541. DOI: 10.1128/AEM.01541-09 |
| [20] | LOZUPONE C, KNIGHT R. UniFrac:a new phylogenetic method for comparing microbial communities[J]. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(12): 8228–8235. DOI: 10.1128/AEM.71.12.8228-8235.2005 |
| [21] | AMATO K R, YEOMAN C J, KENT A, et al. Habitat degradation impacts black howler monkey (Alouatta pigra) gastrointestinal microbiomes[J]. ISME J, 2013, 7(7): 1344–1353. DOI: 10.1038/ismej.2013.16 |
| [22] | QUAST C, PRUESSE E, YILMAZ P, et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project:improved data processing and web-based tools[J]. Nucleic Acids Res, 2013, 41(D1): D590–D596. |
| [23] | KNIGHTS D, KUCZYNSKI J, CHARLSON E S, et al. Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking[J]. Nat Methods, 2011, 8(9): 761–763. DOI: 10.1038/nmeth.1650 |
| [24] | BIAN G R, MA S Q, ZHU Z G, et al. Age, introduction of solid feed and weaning are more important determinants of gut bacterial succession in piglets than breed and nursing mother as revealed by a reciprocal cross-fostering model[J]. Environ Microbiol, 2016, 18(5): 1566–1577. DOI: 10.1111/1462-2920.13272 |
| [25] | GRIER A, MCDAVID A, WANG B K, et al. Neonatal gut and respiratory microbiota:coordinated development through time and space[J]. Microbiome, 2018, 6(1): 193. DOI: 10.1186/s40168-018-0566-5 |
| [26] | CAMPBELL J M, CRENSHAW J D, POLO J. The biological stress of early weaned piglets[J]. J Anim Sci Biotechnol, 2013, 4(1): 19. DOI: 10.1186/2049-1891-4-19 |
| [27] | LALLÈS J P, BOSI P, SMIDT H, et al. Nutritional management of gut health in pigs around weaning[J]. Proc Nutr Soc, 2007, 66(2): 260–268. DOI: 10.1017/S0029665107005484 |
| [28] | LALLÈS J P, BOSI P, SMIDT H, et al. Weaning-a challenge to gut physiologists[J]. Livest Sci, 2007, 108(1-3): 82–93. DOI: 10.1016/j.livsci.2007.01.091 |
| [29] | KIM H B, ISAACSON R E. The pig gut microbial diversity:understanding the pig gut microbial ecology through the next generation high throughput sequencing[J]. Vet Microbiol, 2015, 177(3-4): 242–251. DOI: 10.1016/j.vetmic.2015.03.014 |
| [30] | MACH N, BERRI M, ESTELLÉ J, et al. Early-life establishment of the swine gut microbiome and impact on host phenotypes[J]. Environ Microbiol Rep, 2015, 7(3): 554–569. DOI: 10.1111/1758-2229.12285 |
| [31] | BEAUMONT M, GOODRICH J K, JACKSON M A, et al. Heritable components of the human fecal microbiome are associated with visceral fat[J]. Genome Biol, 2016, 17(1): 189. DOI: 10.1186/s13059-016-1052-7 |
| [32] | LE CHATELIER E, NIELSEN T, QIN J J, et al. Richness of human gut microbiome correlates with metabolic markers[J]. Nature, 2013, 500(7464): 541–546. DOI: 10.1038/nature12506 |
| [33] | AATSINKI A K, UUSITUPA H M, MUNUKKA E, et al. Gut microbiota composition in mid-pregnancy is associated with gestational weight gain but not prepregnancy body mass index[J]. J Womens Health, 2018, 27(10): 1293–1301. DOI: 10.1089/jwh.2017.6488 |
| [34] | UMU Ö C O, FRANK J A, FANGEL J U, et al. Resistant starch diet induces change in the swine microbiome and a predominance of beneficial bacterial populations[J]. Microbiome, 2015, 3: 16. DOI: 10.1186/s40168-015-0078-5 |
| [35] | RAMAYO-CALDAS Y, MACH N, LEPAGE P, et al. Phylogenetic network analysis applied to pig gut microbiota identifies an ecosystem structure linked with growth traits[J]. ISME J, 2016, 10(12): 2973–2977. DOI: 10.1038/ismej.2016.77 |
| [36] | LEY R E, TURNBAUGH P J, KLEIN S, et al. Microbial ecology:human gut microbes associated with obesity[J]. Nature, 2006, 444(7122): 1022–1023. DOI: 10.1038/4441022a |
| [37] | ISAACSON R, KIM H B. The intestinal microbiome of the pig[J]. Anim Health Res Rev, 2012, 13(1): 100–109. DOI: 10.1017/S1466252312000084 |
| [38] | LITVAK Y, BYNDLOSS M X, TSOLIS R M, et al. Dysbiotic Proteobacteria expansion:a microbial signature of epithelial dysfunction[J]. Curr Opin Microbiol, 2017, 39: 1–6. DOI: 10.1016/j.mib.2017.07.003 |
| [39] | LU D, TIEZZI F, SCHILLEBEECKX C, et al. Host contributes to longitudinal diversity of fecal microbiota in swine selected for lean growth[J]. Microbiome, 2018, 6: 4. DOI: 10.1186/s40168-017-0384-1 |
| [40] | FANG S M, XIONG X W, SU Y, et al. 16S rRNA gene-based association study identified microbial taxa associated with pork intramuscular fat content in feces and cecum lumen[J]. BMC Microbiol, 2017, 17(1): 162. DOI: 10.1186/s12866-017-1055-x |
| [41] | KOVATCHEVA-DATCHARY P, NILSSON A, AKRAMI R, et al. Dietary fiber-induced improvement in glucose metabolism is associated with increased abundance of Prevotella[J]. Cell Metab, 2015, 22(6): 971–982. DOI: 10.1016/j.cmet.2015.10.001 |
| [42] | DE FILIPPO C, CAVALIERI D, DI PAOLA M, et al. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(33): 14691–14696. DOI: 10.1073/pnas.1005963107 |
| [43] | WEI X Y, TAO J H, XIAO S W, et al. Xiexin Tang improves the symptom of type 2 diabetic rats by modulation of the gut microbiota[J]. Sci Rep, 2018, 8: 3685. DOI: 10.1038/s41598-018-22094-2 |
| [44] | SHI H J, CHANG Y G, GAO Y, et al. Dietary fucoidan of acaudina molpadioides alters gut microbiota and mitigates intestinal mucosal injury induced by cyclophosphamide[J]. Food Funct, 2017, 8(9): 3383–3393. DOI: 10.1039/C7FO00932A |
| [45] | ZHU J Q, KONG Y, YU J, et al. Consumption of drinking water N-nitrosamines mixture alters gut microbiome and increases the obesity risk in young male rats[J]. Environ Pollut, 2019, 248: 388–396. DOI: 10.1016/j.envpol.2019.02.012 |
| [46] | WAN Y, WANG F L, YUAN J H, et al. Effects of dietary fat on gut microbiota and faecal metabolites, and their relationship with cardiometabolic risk factors:a 6-month randomised controlled-feeding trial[J]. Gut, 2019, 68(8): 1417–1429. DOI: 10.1136/gutjnl-2018-317609 |
| [47] | GOMEZ-ARANGO L F, BARRETT H L, MCINTYRE H D, et al. Connections between the gut microbiome and metabolic hormones in early pregnancy in overweight and obese women[J]. Diabetes, 2016, 65(8): 2214–2223. DOI: 10.2337/db16-0278 |
| [48] | SARESELLA M, MENDOZZI L, ROSSI V, et al. Immunological and clinical effect of diet modulation of the gut microbiome in multiple sclerosis patients:a pilot study[J]. Front Immunol, 2017, 8: 1391. DOI: 10.3389/fimmu.2017.01391 |
| [49] | CHENG C S, WEI H K, YU H C, et al. Metabolic syndrome during perinatal period in sows and the link with gut microbiota and metabolites[J]. Front Microbiol, 2018, 9: 1989. DOI: 10.3389/fmicb.2018.01989 |
| [50] | KUHN K A, SCHULZ H M, REGNER E H, et al. Bacteroidales recruit IL-6-producing intraepithelial lymphocytes in the colon to promote barrier integrity[J]. Mucosal Immunol, 2018, 11(2): 357–368. DOI: 10.1038/mi.2017.55 |
| [51] | PIER G B. Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide:a major virulence factor, initiator of inflammation and target for effective immunity[J]. Int J Med Microbiol, 2007, 297(5): 277–295. DOI: 10.1016/j.ijmm.2007.03.012 |
| [52] | REN L L, ZHANG R B, RAO J, et al. Transcriptionally active lung microbiome and its association with bacterial biomass and host inflammatory status[J]. MSystems, 2018, 3(5): e00199–18. |
| [53] | HERRMANN E, YOUNG W, ROSENDALE D, et al. Determination of resistant starch assimilating bacteria in fecal samples of mice by in vitro RNA-based stable isotope probing[J]. Front Microbiol, 2017, 8: 1331. DOI: 10.3389/fmicb.2017.01331 |
| [54] | ZHANG Y, KANG C, WANG X L, et al. Dietary factors modulate colonic tumorigenesis through the interaction of gut microbiota and host chloride channels[J]. Mol Nutr Food Res, 2018, 62(5): 1700554. DOI: 10.1002/mnfr.201700554 |
| [55] | HAN L H, LI T G, DU M, et al. Beneficial Effects of Potentilla discolor bunge water extract on inflammatory cytokines release and gut microbiota in high-fat diet and streptozotocin-induced type 2 diabetic mice[J]. Nutrients, 2019, 11(3): 670. DOI: 10.3390/nu11030670 |
| [56] | MU Q H, ZHANG H S, LIAO X F, et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota[J]. Microbiome, 2017, 5: 73. DOI: 10.1186/s40168-017-0300-8 |
| [57] | BHAT M, ARENDT B M, BHAT V, et al. Implication of the intestinal microbiome in complications of cirrhosis[J]. World J Hepatol, 2016, 8(27): 1128–1136. DOI: 10.4254/wjh.v8.i27.1128 |