2. 河南兴锐农牧科技有限公司, 信阳 465550
, HUA Liushuai1, CHEN Junfeng1, ZHANG Jiaqing1, REN Qiaoling1, BAI Hongjie1, GUO Hongxia1, XU Zhaoxue1, XING Baosong1
, BAI Xianxiao1, CAO Hai2
2. Henan Xing Rui Agricultural and Animal Husbandry Technology Co., LTD, Xinyang 465550, China
目前，去势已经成为规范化生产流程中不可缺少的一步。去势不仅可以减少雄性激素的分泌，减少公猪膻味，实现环境友好型生产。其次，去势后公猪性情更加温和，可为猪场减少不必要的经济损失[1]。睾酮作为性激素，除了与生殖相关，还广泛参与机体各项生命活动，例如蛋白质合成、脂质代谢、肌肉生长、神经系统发育、骨量维持、心血管系统保护等[2]。目前，关于去势对动物肉质性状影响的研究已有很多，有研究表明，去势导致小尾寒羊羔羊日增重降低26.9%(P < 0.05)，耗料增重比上升50.5%(P < 0.05)，肌肉中亚油酸、花生四烯酸等6种脂肪酸含量显著降低(P < 0.05)[3]。杜环利等[4]发现，公猪去势后背膘厚及肌内脂肪含量显著提高(P < 0.05)。姜锦鹏等[5]研究表明，去势公猪日粮添加脱氢表雄酮后平均背膘厚显著降低(P < 0.05)，眼肌面积显著增大(P < 0.05)，肌肉pH显著提高(P < 0.05)，但对胴体质量、屠宰率、胴体长均无显著影响(P>0.05)。关中黑猪去势试验的结果证明，去势后公猪生长速度快、脂肪沉积能力强、肉质优于母猪，但是瘦肉率不如母猪[6]。同样，去势对公鸡肌肉品质也有影响，试验证明，去势明显增强贵州黄鸡脂肪沉积能力(P < 0.05)，显著增加其宰前体重、腿肌重、失水率和肌肉嫩度(P < 0.05)，而且其肌肉pH更接近优质肌肉的标准[7]。在牛上也有类似的结果，郭同军等[8]试验证明，去势能提高17~21月龄西门塔尔牛肌红蛋白含量(P < 0.01)，下调背最长肌pH(P < 0.01)，同时提高大理石纹等级，增加牛肉脂肪、干物质、油酸和不饱和脂肪酸含量(P < 0.05)。综上结果来看，关于去势对肉质性状的研究结果比较一致，不同动物去势后脂质沉积均增加，虽然所测肉质性状的具体指标不太相同，但是脂质沉积增多，肌内脂肪相关的肉质性状指标都有所改善。
目前已有一些关于去势对肉质性状分子调控机制的研究，例如蔡兆伟等[9]通过荧光定量PCR技术，比较了去势和非去势公猪脂肪组织中脂肪代谢关键基因的表达量，结果提示，去势公猪体内脂肪沉积增加可能与过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)、脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD-1)和苹果酸酶1(ME1)基因的表达量上调有关。Bai等[10]以皮特兰×长白二元杂交猪为研究对象，发现去势后皮下脂肪中上调miRNAs的靶基因集中在抑制脂肪形成的MAPK、Wnt通路；其中miR-30a表达量显著上升，其靶基因是雄激素受体(AR)，推测去势后的脂肪沉积可能与miR-30a对AR表达量的抑制作用有关；部分下调miRNAs的靶基因是转化生长因子β1受体2(TGFBR2)，该基因是脂肪沉积相关TGF-β通路的重要组成部分。在长白猪的试验中，与非去势公猪相比，去势公猪皮下脂肪组织有18个miRNAs表达量变化达到显著水平，功能分析发现它们与脂肪酸代谢相关[11]。Cai等[12]通过比较去势和非去势公猪背最长肌miRNA表达谱，结果发现7个差异表达miRNAs，这7个miRNAs与骨骼肌收缩和脂质代谢相关。
为了验证去势对我国地方猪肉质的影响，笔者之前以河南优良地方品种—淮南黑猪为研究对象，通过屠宰试验分析了去势对淮南黑猪公猪肉质性状的影响。结果发现，与同等体重非去势公猪相比，去势后淮南公猪脂肪细胞平均横截面积显著增大(P < 0.05)，背膘厚和肌内脂肪含量显著上调(P < 0.05)，瘦肉率和眼肌面积显著减小(P < 0.05)，大理石纹等级升高[13-14]。为了进一步研究去势对猪肉质性状影响的分子调控机制，本研究以淮南猪为试验对象，通过高通量测序技术分析去势对淮南公猪背最长肌基因表达的影响，筛选寻找去势调控肉质性状的关键基因，旨在为揭示去势影响公猪肉质性状的分子机制提供相应的理论依据。
1 材料与方法 1.1 供试动物及样品采集为了比较去势对猪肌肉发育和肌内脂肪沉积的影响，选择体重相近的淮南仔公猪3对，每对来源于同一窝，出生1周以内每对同窝仔猪随机选择1头手术去势(共3头去势)，剩余3头在腹部同样位置切口做伪处理，保证2组所受手术应激一致。按照商品猪的饲养标准和流程进行饲养，体重达到130 kg屠宰。屠宰30 min内采集背最长肌样品，剪成黄豆大小，置于冻存管中液氮保存。
1.2 猪背最长肌RNA提取、文库构建及质检使用TRIzol reagent(Invitrogen，Carlsbad，USA)提取猪背最长肌总RNA。然后使用琼脂糖凝胶电泳、Nano-Drop ND-2000分光光度计(NanoDrop products，Wilmington，USA)和Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies，Massy，France)检测所提RNA的完整性、纯度和质量。使用Qubit RNA BR试剂盒检测所提RNA浓度。所有样品所提RNA的RIN值(RNA integrity number)大于8的用于高通量测序建库。
1.3 猪背最长肌转录组高通量测序及生物信息学分析利用RiboZeroTM(Epicentre，Madison，WI，USA)试剂盒去除所提RNA中的rRNA，然后使用片段化缓冲液将RNA片段化成150~200 bp。使用SuperScript Ⅱ reverse transcriptase(Life Techonologies, Saint Aubin, France)合成双链cDNA，末端修复和磷酸化后，然后使用Agencourt AMPure® XP beads (Beckman Coulter, Villepinte, France)纯化。经Agilent 2100 Bioanalyzer定量分析后，将cDNA文库在Illumina HiSeq 2000平台测序。
1.4 猪背最长肌基因结构优化和新转录本的预测测序所得序列通过Cufflinks软件进行转录本组装，将小于180 bp的过滤掉，然后与已公布的参考基因组(Sscrofa10.2)注释信息进行比对。其中重叠基因2个200 bp的侧翼区域，通过2-way比较法进行blast，重叠度大于等于0.9的就是基因结构优化的结果，会延长已注释基因的5′和/或3′端序列。位于基因间隔区的转录本，且距离现有注释基因200 bp以上的可用于候选新转录本的分析。使用Coding Potential Calculator (CPC，http://cpc.cbi.pku.edu.cn/)对新转录本的编码能力进行预测。
1.5 猪背最长肌基因SNPs以及可变剪接基于测序数据，使用ASprofile软件对所得样品中的可变剪切事件进行分析和统计，包括单内含子保留(intron retention，IR)、模糊边界单内含子保留(approximate IR，XIR)、多内含子保留(mulit IR-MIR)、模糊边界多内含子保留(approximate mulit-IR，XMIR)、可变末尾外显子(alternative last exons，TTS)、可变第一外显子(alternative first exons，TSS)、单外显子跳跃(skipped exons，SKIP)、模糊边界单外显子跳跃(approximate SKIP，XSKIP)、多外显子跳跃(mulit-exon SKIP，MSKIP)、可变5′或3′端剪切(alternative exon ends，AE)以及模糊边界5′或3′端剪切(approximate AE，XAE)。同时还统计了每个样品的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)位点和插入缺失突变(insert-deletion，INDEL)。
1.6 猪背最长肌差异表达基因分析使用bowtie2(http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml)和eXpress(http://www.rna-seqblog.com/express-a-tool-for-quantification-of-rna-seq-data)软件，用序列相似性比对的方法计算各转录本在各样本中的表达丰度。使用FPKM(fragments Per kb per Million reads)来表示基因的表达量。差异表达基因的筛选条件为P < 0.05且|log2(Fold Change)|>0.8。
1.7 猪背最长肌差异表达基因的GO和KEGG分析为了进一步分析背最长肌差异表达基因的功能，对这些基因进行GO富集分析，对其功能进行描述。同时利用KEGG数据库对差异表达基因进行通路分析，并用超几何分布检验的方法计算每个通路条目中差异基因富集的显著性。同时围绕激素分泌、肌肉发育和脂质代谢3个方面选取富集到的通路，将这些通路中差异表达基因进行分析，寻找能同时参与调控其中2个或3个方面的基因，利用Cytogrape软件进行绘图。
2 结果 2.1 猪背最长肌转录组测序结果评估及数据初步分析通过去除核糖体RNA法建库，在Illumina HiSeq 2000平台进行测序，去势组和非去势组共得到1.70亿raw reads，去除空读、低质量和接头序列后共获得1.67亿clean reads，去势和非去势淮南公猪分别获得83 613 018和83 746 508条可用读段，序列的有效率高达98.00%以上，2组样品GC含量均为52.50%。
2.2 猪背最长肌测序结果基因组比对分析与猪的基因组序列进行比对，去势组和非去势组的总比对率分别为73.78%和74.09%，比对率高说明测序所获得的序列可信度高，可应用于进一步的分析。其中有大于13.00%的序列在基因组上有多个比对位置，60.00%左右的序列在参考基因组上具有唯一的比对位置。其中比对到“+”链和“－”链的均为30.00%左右，比对到2个外显子上的序列，也就是junction reads为24.00%~25.43%，而整段比对到外显子的序列为35.00%左右。测得数据已提交到NCBI数据库，登录号为GSE87680。
2.3 猪背最长肌基因结构优化和新转录本的预测通过比对分析，发现共有486个基因的507个区域得到了基因结构优化，其中5′端191个，3′端316个，其中位于正链239个，位于负链268个。除了Y染色体，所有染色体都有分布，其中1号染色体最多共60个，16号染色体最少仅5个，X染色体有21个。其中5′端扩展序列范围为11~289 272 bp，平均27 963 bp，而3′端扩展序列为64~370 812 bp，平均39 163 bp。
本研究中，2个样品测序共发现11 377个基因的12 550个新转录本，其中6 408个位于“－”链，6 142个位于“+”链，平均外显子数2个，转录本长度范围为180~36 480 bp，平均长度为1 541 bp，经编码潜能软件预测分析，其中3 863个具有编码潜能，剩余8 687个为非编码序列。
2.4 猪背最长肌基因SNPs检测以及可变剪接分析2个样品共检测到16 049个基因的357 992个SNPs位点，位于所有染色体和线粒体，其中A-G和C-T转换型SNP位点占大多数，约为72.56%，二者具体含量差异不大，颠换型SNP位点(G-C、T-G、A-C、A-T)仅占27.44%，其中A-C数量最多，A-T最少。还检测到8 866个基因的30 172个INDEL，这些INDEL位点位于所有染色体。
从图 1可以看出，2个样品中均包含12种可变剪切模式，而且趋势相似，均为TSS(15 561个和14 770个)最多，TTS次之(14 567个和13 924个)，接着是SKIP(4 310个和4 908个)，剩余几种可变剪切模式均极少，其中XMIR仅为10个和4个。
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图 1 去势组和非去势组背最长肌可变剪切类型及数量 Fig. 1 Types and number of alternative splicing events of longissimus dorsi muscle in castrated and intact groups |
去势组和非去势组共有表达基因16 170个，去势组特有1 468个基因，非去势组特有基因1 071个。使用FPKM值来表示基因的表达量，总体来看去势组和非去势组全部基因表达量变化不明显(图 2)。两个样品中表达量最高的5个基因分别是肌球蛋白重链1(MYH1)、骨骼肌α-肌动蛋白1(ACTA1)、肌球蛋白重链2(MYH2)、线粒体细胞色素c氧化酶第Ⅰ亚基(COX1)和肌酸激酶基因(CKM)。同一基因在2个样品中的表达量符合|log2(Fold Change)|≥0.8，且P＜0.05即为差异表达基因，与非去势组相比，去势组背最长肌共有503个上调基因，432个下调基因。其中与肌肉发育相关的上下调最显著的20个基因见表 1，下调的10个基因log2(Fold Change)平均值为－2.27，下调最显著的是血管紧张素Ⅱ-1型受体(AGTR1)。上调的10个基因log2(Fold Change)平均值为2.60，上调最显著的是胶原蛋白XI型α1(COL11A1)。这些基因主要与肌细胞增殖、分化和迁移，骨骼肌的发育、肥大、收缩、肾上腺素能信号等有关。而与脂肪代谢相关的显著变化的前20个基因如表 2所示，下调最显著的是脂肪特异性磷脂酶A2(PLA2G16)，而上调最显著的是SCD-1。这些基因参与调控糖酵解/糖异生、脂肪酸的合成、延长、降解、甘油酯代谢等多个方面。
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图 2 去势组和非去势组背最长肌基因FPKM值箱线图 Fig. 2 The box plots of FPKM value of genes expressed in longissimus dorsi muscle in castrated and intact groups |
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表 1 与非去势组相比，去势组与肌肉发育相关上调/下调最显著的20个基因 Table 1 The top 20 up- or down-regulated differentially expressed genes related to muscle development in castrated group compared to intact group |
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表 2 与非去势组相比、去势组与脂质代谢相关上调/下调最显著的20个基因 Table 2 The top 20 up- or down-regulated differentially expressed genes related to lipid metabolism in castrated group compared to intact group |
对去势组和非去势组差异表达基因进行GO富集分析，图 3显示的是显著富集的前20条通路。其中蛋白质在线粒体的定位、代谢过程、能量动态平衡等属于能量代谢方面的通路。去势组和非去势组在脂质代谢方面有较大差异，例如对于糖脂代谢非常重要的胰岛素受体、脂肪酸合成以及甘油三酯合成等信号通路。去势也引起肌肉发育方面的差异，尤其是心肌收缩通路相关基因。KEGG富集分析结果与GO分析结果一致(图 4)，差异表达基因极显著富集于能量代谢、脂肪沉积和肌肉发育相关通路，其中能量代谢相关通路主要涉及蛋白质、氨基酸和淀粉以及糖的代谢，而脂肪沉积相关通路包括脂解的调控、脂肪酸的延长，而心肌细胞肾上腺素能信号、心肌收缩、磷酸腺苷活化的蛋白激酶(AMPK)等均为肌肉发育相关通路。
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图 3 差异表达基因GO富集分析 Fig. 3 The GO analysis of the differentially expressed genes |
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图 4 差异表达基因KEGG富集分析 Fig. 4 The KEGG analysis of the differentially expressed genes |
研究表明，去势通过激素分泌、脂质代谢和肌肉发育等3个方面间接调控肉质性状[1]。本研究比较了去势猪和非去势猪背最长肌的基因表达差异，如图 5所示，在这3个方面确实富集到较多差异表达基因。在激素方面，去势最直接影响的是睾酮分泌量，睾酮可抑制脂蛋白酯酶(LPL)活性，促进脂肪分解，抑制脂肪沉积，达到促进能量消耗的作用[15]。本研究结果中，差异表达基因显著富集于雌激素代谢通路而不是雄激素代谢通路。已有研究表明，雄激素去芳香化可转化为雌激素[16]，由此推断去势后雄激素通过雌激素代谢通路间接发挥作用。甲状腺激素在脂质代谢方面也很重要，其通过促进生长激素合成、增强脂肪组织对儿茶酚胺和胰高血糖素的敏感性以及拮抗胰岛素的作用，达到促进脂质分解的目的[17]。在本研究中，与非去势组相比，甲状腺激素信号通路大部分基因表达量下调，符合去势后脂质沉积增多的现象。与脂肪代谢密切相关的还有胰岛素，其通过刺激脂肪细胞吸收利用葡萄糖，促进脂肪合成，在本研究中, 胰岛素信号通路中关于葡萄糖转运、脂肪酸合成、糖酵解、糖原合成、脂解等多个方面的基因表达量均有显著变化。其中葡萄糖转运体4(GLUT4)是调控肌肉葡萄糖代谢的关键因子[18]，研究表明，在C2C12成肌细胞中过表达广西巴马小型猪Glut4，能增加细胞的葡萄糖摄入量[19]。在莱芜猪群体中，Glut4表达量升高能够促进肌内脂肪含量增加[20]。这些结果提示，去势能通过调控雌激素、甲状腺激素以及胰岛素等的分泌参与机体能量代谢的调控。
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灰色.生物过程；红色.信号通路；绿色.基因 Gray. Biological processes; red. Signaling pathways; green. Genes 图 5 与激素、脂质沉积和肌肉发育相关的差异表达基因及通路 Fig. 5 The differentially expressed genes and their pathways associated with hormone, lipid deposition and muscle development |
去势后脂肪沉积增多，本研究中, 差异表达基因主要富集在脂质代谢方面，这些基因主要与脂肪酸、甘油酯以及葡萄糖等代谢相关。KEGG富集分析中，与脂质代谢最相关的是淀粉和糖代谢通路，该通路中磷酸二酯酶1(ENPP1)等6个基因在去势组的表达量显著上调，已有研究表明，ENPP1尤其是其K121Q多态位点与二型糖尿病[21]和青少年肥胖[22]等糖脂代谢相关疾病显著相关。其次富集到的是脂肪酸延长通路，该通路中乙酰辅酶A酰基转移酶2(ACAA2)在去势后表达量显著下调，已知该基因主要参与调控脂肪酸的β-氧化和胆固醇的生物合成[23]。已有研究表明，鹅在填饲后，肝中甘油三酯的合成速度急速增加，肝中脂肪酸的β-氧化代偿性增加，ACAA2表达量也显著上调，但随着填饲的持续，增多的脂肪酸氧化后产生的活性自由氧导致线粒体损伤，ACAA2表达量又下降[24]。由此推断，去势后ACAA2表达量降低的原因可能与此类似。值得关注的还有PPAR信号通路(图 6)，SCD-1是单不饱和脂肪酸合成的限速酶，通过调控饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的比例来影响机体的脂质代谢[25]。本研究中，去势促进SCD-1表达量上调，说明去势能够通过上调SCD-1促进脂肪酸的合成进而增加肌内脂肪沉积。围脂滴蛋白(PLIN1)是调控脂解的重要蛋白，为定位于脂滴表面的高磷酸化蛋白，既可通过阻止脂肪酶与脂滴的接触降低脂解，也可促进激素刺激的脂解[26]。去势组PLIN1表达量是非去势组的20倍左右，说明去势组脂滴都被保护起来用于能量储存。研究表明，雌激素能够通过抑制PLIN1减少肝细胞内的脂质沉积[27]，去势后雄性激素分泌减少，进而芳香化的雌激素也变少，所以其对PLIN1的抑制作用也降低了，这与去势后脂肪沉积增多相符。脂肪酸转位酶(FAT/CD36)是油酸、棕榈油酸和棕榈酸这3种长链脂肪酸转运的主要受体，而长链脂肪酸的摄取是细胞利用脂肪酸的关键环节[28]。去势后FAT/CD36表达量显著下调，说明睾酮表达量下降以后，机体整体能量合成增多，能量利用减少，所以转运体也相应减少。
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红色.上调；绿色.下调。下图同 Red. Up-regulation; green. Down-regulation. The same as below 图 6 PPAR信号通路 Fig. 6 PPAR signaling pathway |
去势后肌肉发育也发生了改变，本研究中，AMPK信号通路被显著富集(图 7)，AMPK表达量显著下调。已知AMPK既能通过调控骨骼肌脂肪酸的氧化，调控骨骼肌甘油三酯的沉积[29]，又能通过促进GLUT4[18]、糖酵解(磷酸化激活6-磷酸果糖激酶-2，PFK-2)[30]和抑制糖原合成(Gs)3个方面来调控骨骼肌的能量代谢，此外AMPK/SIRT1/PGC-1α通路还参与调节骨骼肌的质量和骨骼肌纤维类型转化[31]。去势后AMPK表达量显著降低，肌肉的增殖分化、能量代谢、肌纤维类型、肌内脂肪沉积等都随之发生改变。本研究富集到关于肌肉发育的信号通路还有RAP1[32]、MAPK[33]和PI3K-AKT[34]等。
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图 7 AMPK信号通路 Fig. 7 AMPK signaling pathway |
去势后的差异表达基因主要富集于激素分泌、肌肉发育和脂质代谢3个方面，为了筛选去势调控肉质性状的关键靶基因，围绕这3个方面将显著富集的相关通路中的差异表达基因进行统计分析，筛选出12个能同时调控其中2个或3个方面的差异表达基因。这12个基因除了前面已经讨论过的SCD-1、Gs、Akt、MEK、Glut4等，值得关注的还有HSL和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路，HSL与猪的肌内脂肪含量显著相关[35]，MAPK通路能够抑制猪骨骼肌成肌细胞的分化[36]。推测这12个基因在去势相关的肉质性状调控中起到了关键作用，值得进一步在细胞水平进行功能验证。
4 结论综上所述，去势后猪背最长肌共有935个差异表达基因，其中上调基因503个，下调基因432个。GO和KEGG富集分析发现，这些差异表达基因主要与激素分泌、脂肪沉积和肌肉发育相关。综合分析，得到12个能同时参与调控这几个方面的差异表达基因，这些基因可能参与调控了去势导致的肉质性状改变，可作为进一步功能验证的关键靶点。
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