2. 杭州海关技术中心, 杭州 310016;
3. 中国检验检疫科学研究院动物检疫所, 北京 100029;
4. 呼和浩特海关技术中心, 呼和浩特 010020
2. Technology Center of Hangzhou Customs, Hangzhou 310016, China;
3. Institute of Animal Quarantine, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100029, China;
4. Technology Center of Huhehaote Customs, Hohhot 010020, China
炭疽杆菌(Bacillus anthracis)是一种革兰阳性芽胞杆菌，可引起人畜共患的炭疽病，是世界动物卫生组织(OIE)确立的必须通报的动物疫病。炭疽杆菌抵抗力强，形成芽胞后可在动物皮毛和土壤等环境中长期存在。炭疽杆菌具有高致病性，对人和动物的健康和生命构成极大威胁，常被用作生物恐怖战剂，其快速而精确的检测一直备受重视[1]。目前炭疽杆菌检测的常用方法，主要是对病原体进行培养、染色镜检、血清学(抗原或抗体)检测等，但这些检测方法耗时较长，难以适应快速诊断和控制疫情的需要。基于PCR及各种改进型的基因检测技术快速、灵敏、准确，适应当前疫情快速诊断的需要，如常规PCR、LAMP、数字PCR等已经应用于炭疽杆菌的检测[2-5]。由于各种细菌芽胞的相似性，常规PCR检测炭疽杆菌的特异性难以令人满意；LAMP技术污染的可能性较大，条件控制要求比PCR更严格；数字PCR虽具有更高的敏感性、特异性和精确性，但是仪器设备和耗材昂贵，难以推广应用。TaqMan荧光定量PCR检测技术除了引物序列的特异性之外，还有探针序列的特异性，从两个方面保证了所扩增基因的特异性，荧光定量PCR技术因其特异性高、敏感性强、安全省时，已经在医学检测和其他各个领域广泛应用。
为寻找更加简便、快速和准确的基因检测方法，本研究以染色体基因BA5345和位于毒素质粒pXO1上的保护性抗原PA基因为研究对象，设计两种不同荧光基团标记的TaqMan探针，建立了染色体基因BA5345和毒力因子PA基因特异性的双重荧光定量PCR检测方法，并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证；同时与常规PCR对比，评价其实际应用价值，力求建立一种快速、稳定和准确的双重荧光定量PCR检测方法。
1 材料与方法 1.1 细菌菌株及核酸样品炭疽杆菌无毒疫苗株(A16R)购自兰州生物制品有限公司；蜡样芽胞杆菌(BNCC124613)、苏云金芽胞杆菌(BNCC221700)、蕈状芽胞杆菌(BNCC184427)和魏氏芽胞杆菌(BNCC189983)购自国家兽医微生物菌种保藏中心，变形杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌和耶尔森菌由浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心赠送。按照Quick-DNATM提取和纯化试剂盒说明书提取细菌菌株基因组DNA。
1.2 主要试剂和仪器Quick-DNATM提取和纯化试剂盒购自美国ZYMO RESEARCH公司；质粒提取试剂盒、pUC57 Vector、大肠杆菌DH5α和Amp购自上海生工生物工程有限公司；TaqMan® Universal Master Mix II购自美国ABI公司；Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)、dNTPs(10.0 mmol·L-1)、MgCl2(25 mmol·L-1)、DL5000 DAN Marker、DNA胶回收试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司。ABI7500实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；NanoDrop2000核酸蛋白分析仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司。
1.3 引物探针设计染色体基因BA5345是炭疽杆菌特异性鉴定基因，能有效区分蜡样芽胞杆菌群中的近缘种；PA基因是炭疽杆菌毒力因子pXO1质粒上较为保守的基因。根据GenBank中登录的炭疽杆菌BA5345基因(FJ694154.1)和PA基因(AY921578.1)设计引物和探针，使用FAM荧光素标记BA5345检测探针，用于炭疽杆菌染色体的检测；使用VIC荧光素标记PA检测探针，用于毒力因子的检测，引物和探针序列见表 1。要求两靶基因的引物和探针之间无非特异性反应，使用Primer 5.0进行多重比对和引物探针设计，由上海华大基因科技有限公司合成。
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表 1 引物和探针序列 Table 1 Sequences of primes and probes |
设计并合成炭疽杆菌BA5345基因和PA基因的常规PCR特异性引物(表 2)。
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表 2 常规PCR引物序列 Table 2 Sequences of primes of conventional PCR |
以提取的炭疽杆菌疫苗株DNA为模板，分别扩增BA5345基因和PA基因片段。在50 μL反应体系中依次加入：10×PCR Buffer 5.0 μL，dNTPs(10.0 mmol·L-1)1.0 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)2.0 μL，正、反向引物(25 pmol·μL-1)各1.0 μL，Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)0.4 μL，模板DNA 4.0 μL，最后加灭菌去离子水补至50.0 μL。按如下程序进行扩增：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55.0 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。
1.5 质粒标准品制备将“1.4”扩增的BA5345基因和PA基因片段按照凝胶回收试剂盒说明书回收，将目的基因片段分别与pUC57载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性菌落经PCR和测序鉴定无误后，通过NanoDrop2000测定质粒的DNA浓度，按照公式(6.02×1023拷贝·mol-1)×质粒浓度(ng·μL-1)×10-9/(DNA长度×660)=拷贝·μL-1换算为拷贝数，作为pUC57-BA5345和pUC57-PA的质粒标准品备用。
1.6 双重荧光定量PCR反应条件优化试验使用ABI7500荧光定量PCR仪进行扩增和分析，以TaqMan® Universal Master Mix II(4440038，ABI，USA)作为反应缓冲液。在缓冲液推荐的反应体系下进行退火温度优化，设置6个退火温度，分别为56、57、58、59、60、61 ℃，反应条件:95 ℃预变性10 min，然后95 ℃ 15 s变性，56~61 ℃退火延伸1 min并收集荧光，共40个循环。在确定退火温度后对引物和探针反应浓度进行优化。以20 pmol·μL-1的引物和10 pmol·μL-1的探针各0.2、0.25、0.5、0.75、1.0 μL进行反应，选取最佳引物和探针浓度。25 μL反应体系：TaqMan® Universal Master Mix II(2×)12.5 μL，正、反向引物(BA5345-F、BA5345-R和PA-F、PA-R)各0.2~1.0 μL(5个浓度梯度)，探针(BA5345-P和PA-P)各0.2~1.0 μL(5个浓度梯度)，pUC57-BA5345和pUC57-PA的质粒标准品DNA 2.0 μL，最后加灭菌去离子水补至25 μL。
1.7 特异性试验利用建立的双重荧光定量PCR方法对炭疽杆菌疫苗株、蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌、魏氏芽胞杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌和耶尔森菌进行特异性检测，并以pUC57-BA5345和pUC57-PA的质粒标准品作为阳性对照，以灭菌去离子水作为阴性对照，按照“1.6”确定的方法进行实时荧光定量PCR，评价此方法的特异性。
1.8 敏感性试验将pUC57-BA5345、pUC57-PA质粒和3×106CFU·mL-1炭疽杆菌疫苗株芽胞悬液分别进行10倍梯度稀释，用已建立的反应条件进行实时荧光定量PCR扩增，评价此方法的敏感性。
1.9 重复性试验将“1.5”制备的质粒标准品10倍倍比稀释，使用4个浓度梯度进行重复试验，将同一批不同稀释度的标准品按建立的方法重复3次进行组内重复试验，对3次不同时间段稀释的同一浓度的标准品进行组间重复试验，对试验结果进行统计，分析此方法的重复性。同时设置去离子水为阴性对照。
1.10 模拟皮毛样品和临床样品检测将3×106CFU·mL-1炭疽杆菌疫苗株芽胞悬液，10倍倍比稀释为7个浓度梯度后各取200 μL随机加入到1 g生牛皮(毛)样品中，振荡混匀1 min，4 ℃放置过夜，使芽胞与皮毛充分吸附，即为污染皮毛，共制备35份样品，分为7组，每组5份样品，每组样品炭疽杆菌的添加浓度分别为3×106、3×105、3×104、3×103、3×102、3×101和3×100 CFU·mL-1。同时对100份临床送检的皮毛样品使用本研究建立的常规PCR方法、双重荧光定量PCR方法和OIE推荐的常规PCR方法进行平行检测，反应时用pUC57-BA5345和pUC57-PA质粒标准品作阳性对照，用灭菌去离子水作阴性对照。两种方法结果判定标准如下：荧光定量PCR以出现典型扩增曲线为阳性，并根据Ct值和标准曲线计算样品模板拷贝数；普通PCR以电泳检测时出现目的片段为阳性。
2 结果 2.1 质粒标准品制备用常规PCR方法对提取的炭疽杆菌基因组DNA进行特异性扩增，扩增产物长度分别为510(BA5345)和1 406 bp(PA)。将BA5345基因片段和PA基因片段分别克隆至pUC57载体后，经PCR和序列测定分析，与GenBank中相应序列完全一致。重组质粒经NanoDrop2000测定，BA5345质粒浓度为45 μg·mL-1，通过公式换算得到重组质粒的拷贝数为8.0×1010拷贝·μL-1，PA质粒浓度为120 μg·mL-1，通过公式换算得到重组质粒的拷贝数为7.8×1010拷贝·μL-1。
2.2 双重荧光定量PCR最优反应条件经反应体系与反应条件优化，最终确定了炭疽杆菌双重荧光定量PCR反应体系：TaqMan® Universal Master Mix II(2×)12.5 μL，正、反向引物(BA5345-F、BA5345-R和PA-F、PA-R)各0.5 μL，探针(BA5345-P和PA-P)各0.5 μL，DNA模板2.0 μL，加灭菌去离子水至25 μL。最终确定该反应的循环参数：95 ℃预变性10 min；然后95 ℃变性15 s，60 ℃延伸1 min并收集荧光，共40个循环。
2.3 标准曲线的建立将质粒标准品pUC57-BA5345和pUC57-PA 10倍梯度稀释后，以7个稀释度进行荧光定量PCR扩增，通过系统自动分析软件分析，可以得到以Ct值为纵坐标，质粒标准品浓度梯度为横坐标绘制的荧光定量PCR标准曲线(图 1)。由图 1可知，在102~108拷贝·μL-1的范围内，构建的2个标准品的标准曲线均呈现良好的线性关系，线性关系表达式分别为：Y=-3.812X+46.603和Y=-3.951X+47.302，相关系数R2均在0.99以上，扩增效率均高于90%。标准曲线比较理想。
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图 1 质粒标准品DNA的标准曲线 Fig. 1 Duplex real-time PCR standard curves for BA5345 and PA gene |
利用建立的双重荧光定量PCR方法对炭疽杆菌疫苗株、蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌、魏氏芽胞杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌和耶尔森菌的基因组DNA进行检测，并以pUC57-BA5345和pUC57-PA质粒标准品作为阳性对照，以灭菌去离子水作为阴性对照，仅炭疽杆菌疫苗株和pUC57-BA5345、pUC57-PA质粒标准品出现特异性扩增曲线(图 2)，表明该检测方法的特异性较好。
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1. pUC57-BA5345质粒；2.炭疽杆菌疫苗株；3. pUC57-PA质粒；4~12.蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌、魏氏芽胞杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、耶尔森菌和阴性对照 1.pUC57-BA5345 plasmid; 2. Bacillus anthracis vaccine strain; 3. pUC57-PA plasmid; 4-12. Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus proteus, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Jerson fungus and negative control 图 2 特异性试验 Fig. 2 Specific test of the duplex real-time PCR assay |
将浓度为8.0×105拷贝·μL-1的pUC57-BA5345和7.8×105拷贝·μL-1的pUC57-PA质粒标准品分别进行10倍梯度稀释，按照所建立的条件，进行荧光定量PCR扩增。结果表明，双重荧光定量PCR最低可以检出8.0拷贝·μL-1的 pUC57-BA5345质粒和7.8拷贝·μL-1的pUC57-PA质粒(图 3)。
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A. pUC57-BA5345质粒：1~6. 8.0×105 ~8.0×100拷贝·μL-1 pUC57-BA5345；7、8.阴性对照。B. pUC57-PA质粒：1~6. 7.8×105~7.8×100拷贝·μL-1 pUC57-PA质粒；7、8.阴性对照 A. pUC57-BA5345 plasmid: 1-6. 8.0×105-8.0×100 copies·μL-1 pUC57-BA5345; 7, 8. Negative control. B: pUC57-PA plasmid: 1-6. 7.8×105-7.8×100 copies·μL-1 pUC57-PA; 7, 8. Negative control 图 3 敏感性试验 Fig. 3 Sensitivity analysis of the duplex real-time PCR |
将浓度为3×106CFU·mL-1炭疽杆菌疫苗株芽胞悬液进行10倍倍比稀释为7个浓度梯度后各取200 μL，按照所建立的条件，进行荧光定量PCR扩增。结果表明，双重荧光定量PCR最低可以检测到3×101CFU·mL-1的炭疽杆菌芽胞悬液(图 4)。
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A. pUC57-BA5345；B. pUC57-PA；1~6. 3.0×106~3.0×101 CFU·mL-1炭疽杆菌疫苗株；7. 3×100CFU·mL-1炭疽杆菌疫苗株；8.阴性对照 A. pUC57-BA5345; B. pUC57-PA; 1-6. 3.0×106-3.0×101 CFU·mL-1 Bacillus anthracis vaccine strain; 7. 3.0×100 CFU·mL-1 Bacillus anthracis vaccine strain; 8. Negative control 图 4 敏感性试验结果 Fig. 4 Sensitivity analysis of the duplex real-time PCR |
为验证所建立检测方法的重复性，对同一批稀释的标准品按照建立的方法重复3次进行组内重复试验，并对3次不同时间稀释的同一浓度的标准品进行组间重复试验，结果显示，BA5345和PA基因组内检测的变异系数为0.18~1.49，组间检测的变异系数为0.16~1.31(表 3)，表明该方法具有较高的可重复性。
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表 3 荧光定量PCR的组内、组间重复性试验 Table 3 Intra-assay and inter-assay reproducibility test of the real-time PCR |
对35份污染样品进行双重荧光定量PCR和常规PCR检测，结果如表 4所示，双重荧光定量PCR方法对BA5345基因的检出率为80.0%(28/35)，对PA基因的检出率为82.9%(29/35)；自建常规PCR方法的BA5345和PA基因检出率均为51.4%(18/35)；OIE推荐的常规PCR方法pXO1质粒基因和pXO2质粒基因的检出率都是42.9%(15/35)；上述常规PCR检测的阳性样品，双重荧光定量PCR检测也都为阳性。对两种PCR方法结果进行对比，显示定量结果中模板量大于等于100拷贝数的样品，双重荧光定量PCR和常规PCR结果都为阳性；定量结果为1~100拷贝数的样品中，常规PCR检出率为0.00%，双重荧光定量PCR能检出低于10拷贝数的样品，敏感性高出常规PCR方法100倍。
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表 4 双重荧光定量PCR、常规PCR对污染样品和临床样品的检测结果 Table 4 Results of duplex real-time PCR and conventional PCR for contaminated samples and clinical samples |
对100份送检皮毛样品进行双重荧光定量PCR和常规PCR检测，结果如表 4所示，自建常规PCR方法的PA基因对1个样品扩增出了基因条带，双重荧光定量PCR没有出现荧光曲线，OIE推荐的常规PCR方法对近30%的样品扩增出了基因条带，这些基因条带大小不一，测序后经基因比对，为蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌。
3 讨论炭疽杆菌能引起马、牛、羊等动物及人类的炭疽病，严重威胁公众健康和生命安全，并可以形成气溶胶通过空气飞沫传播，易引起突发公共卫生事件。在进出境动物及动物产品贸易中，炭疽杆菌往往以浓度较低的芽胞形态存在于环境复杂的样品中，如动物皮毛中。炭疽杆菌与蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌和魏氏芽胞杆菌等均属于蜡样芽胞杆菌群，细菌的高度相似性导致了在适当的温度、湿度和pH值条件下不同芽胞杆菌之间基因水平交换的可能性，造成检测困难[6-7]。炭疽杆菌的基因组复杂，其完整的基因组包括染色体基因组和2个质粒pXO1和pXO2[8]。炭疽杆菌大多数生命活动所需要的基因都位于染色体基因组上，主要致病基因位于质粒pXO1上，质粒pXO2主要与荚膜形成有关[9-11]。炭疽杆菌的大多数基因检测方法，都以毒力因子pXO1和pXO2质粒上的基因片段为检测对象，然而质粒容易丢失，完全依靠质粒鉴定炭疽杆菌的方法并不完全可靠，可能造成漏检。同时，蜡样芽胞杆菌群之间存在质粒交换，可能导致检测结果的假阳性[12-14]。研究证实，编码假定蛋白的BA5345和BA2686基因是染色体基因序列中较为理想的检测对象，BA5345基因能有效区分“蜡样芽胞杆菌群”中的近缘种，它是快速、准确检测各种样品中炭疽杆菌的工具[1-3, 15-16]。谭维国等[17]以炭疽杆菌pXO1质粒保护性抗原PA基因和pXO2质粒的荚膜合成相关基因capA基因为检测靶基因，建立了双重实时荧光定量PCR方法，能区分强毒株、弱毒株和疫苗株，capA基因和PA基因的检测灵敏度分别达到5和50拷贝·μL-1，并在突发公共卫生事件应急处置中应用。刘东立等[18]以炭疽杆菌pXO1毒素质粒基因pagA，pXO2毒素质粒基因capB，以及染色体上的前噬菌体λBa03基因PL3为靶基因，建立了多重实时荧光定量PCR检测方法，pagA、capB和PL3基因的检出限分别为63、398、114拷贝·μL-1，并对模拟的土壤和奶粉样品进行检测。
本研究选取炭疽杆菌染色体基因BA5345和质粒基因PA为研究对象，建立同时检测2个不同靶基因的双重荧光定量PCR方法，其敏感性优于谭维国等和刘东立等建立的炭疽杆菌双重或多重荧光定量PCR方法，这可能与基因片段的选择有关。临床试验结果表明，本研究建立的双重荧光定量PCR方法靶基因和探针特异性高，避免了炭疽杆菌检测出现假阳性，可用于炭疽杆菌的临床检测。本研究自建常规PCR方法选取的PA基因和OIE推荐常规PCR方法选取的pXO1和pXO2质粒基因，因蜡样芽胞杆菌群之间的质粒交换等基因自身特点，导致出现假阳性检测结果。
4 结论建立了一种快速检测炭疽杆菌的双重荧光定量PCR检测方法，对BA5345和PA基因的最低检测限分别为8.0和7.8拷贝·μL-1，对炭疽杆菌的检测限为3×101CFU·mL-1，与蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌、魏氏芽胞杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌和耶尔森菌等无交叉反应，特异性好。此方法适合大量临床样品的检测，可应用于炭疽病临床诊断和疫情监测，为诊断和防控炭疽病提供技术支持。
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