塞内卡病毒A(Senecavirus A，SVA)，曾被称为塞内卡谷病毒(Seneca valley virus，SVV)，属于小RNA病毒科，是无囊膜的单股正链RNA病毒，对其保守多肽区分析发现，SVA的P1、2C、3C和3D多肽与心病毒属的P1、2C、3C和3D多肽的遗传关系最为密切，但经基因组进化分析否定了SVA来源于心病毒属的可能，因此将其独立列为一种新的病毒属，即塞内卡病毒属[1-2]。研究证明该病毒能够特异性靶向神经内分泌细胞，具有良好的溶瘤特性，且对人体无有害影响，为肿瘤的治疗提供了一种可靠的途径，目前SVA肿瘤治疗法已进入不同阶段的临床研究[3-6]。2007—2016年期间，加拿大、美国、巴西、中国以及哥伦比亚等多地相继暴发特发性水疱病(PIVD)[7-16]，并从发病猪体内分离到SVA，在排除口蹄疫(FMD)、猪水疱病(SVD)、水泡性口炎(VS)、猪水疱疹(VES)等水疱病毒感染后，相关学者提出了SVA与PIDV的暴发可能存在因果关系。2008—2012年期间，有相关研究报道母猪水疱症状与血清中SVA的RNA量呈正相关[7-8]。但在2016年前，利用已分离的SVA病毒株人工感染猪体，并未观察到预期的水疱症状。直到2016年，Montiel等[17]对9周龄的育肥猪进行鼻腔途径攻毒，最终引起了水疱症状，证明该病毒是引起猪PIDV的一种新病原，而在此之前多次人工感染失败，可能与实验猪的日龄有关。自然感染SVA的发病母猪表现短暂的低热，蹄部叉趾间隙、冠状带周围以及鼻腔黏膜处有充满液体或破裂的囊泡[14, 18]，SVA感染可致新生仔猪死亡，在巴西发生的感染仔猪病死率在30%~70%之间[13]。最近中国新分离的SVA毒株多与美国流行毒株同源关系最近[19]。据报道，该病毒感染也与猪流行性短暂新生儿损失(ETNLs)有关，对此目前尚无足够的证据证明两者之间的联系[19-21]。人炭疽毒素受体1(ANTXR1)是一种人类的肿瘤内皮标记物，最近研究揭示了ANTXR1是SVA的细胞受体[22]。
SVA是塞内卡病毒属的唯一成员，基因组全长约7.2 kb，含有编码2 181个氨基酸的开放阅读框(OFR)，基因组呈典型的L-4-3-4模式，P1基因区域编码4个结构蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)，是病毒衣壳的主要成分，P2和P3基因区域编码7个非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)，这些蛋白与病毒复制功能相关的[1]。SVV-001的内部核糖体进入位点的元件，与丙型肝炎病毒及其他多种小RNA病毒相似。分析其基因组，发现5′UTR和3D基因区域相对保守，是PCR引物设计的理想基因区域。虽然SVA对猪群致死率低，但由于发病猪表现的水疱症状与口蹄疫难以区分，极易造成错误诊断，尤其是近年来该病毒在我国多个省份扩散迅速，因此迫切需要建立一种简便、快捷、有效的检测方法，以便对疫病进行监测和快速正确诊断，从而采取相应措施控制疾病的扩散。目前国外已建立了多种检测方法，包括间接免疫荧光抗体试验(IFA)、RNA原位杂交技术、竞争性酶联免疫吸附以及间接酶联免疫吸附试验、血清中和试验、荧光定量PCR等[14-15, 23-26]，国内樊晓旭等[27-30]也建立了荧光定量PCR、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)实时荧光检测方法以及重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条检测方法。针对病毒核酸的检测，荧光定量PCR方法具有优异的灵敏性和特异性，但容易造成污染，且仪器设备昂贵，对操作人员要求较高，仅适合实验室诊断。而RT-PCR方法操作简便，灵敏度高，特异性强，不但可用于实验室诊断，同样也适用于养殖场SVA的检测，因此本研究在SVA的基因保守区域设计了3对PCR引物，并从中选出最佳引物，对扩增体系和扩增条件优化后，建立了RT-PCR检测方法，以期为SVA疫病的监测、诊断和防控提供一种有效手段。
1 材料与方法 1.1 主要试剂和材料RNA提取试剂盒购自OMEGA生物科技有限公司，Taq DNA聚合酶、Oligo dT18、dNTP、M-MLV反转录酶购自TaKaRa生物科技有限公司。
SVA CH-SD毒株、EMCV NJ08株、PRV ZJ01株、PRRSV经典毒株S1、CSFV、PEDV由本实验室分离并保存，FMDV为购买的商品化疫苗毒株。
100份猪临床病料(水疱液、心、扁桃体)分别采集于山东省的20个养殖场，按1:2体积比加入含250 IU·mL-1青链霉素的0.1 mol·L-1 PBS，匀浆后冻存于-80 ℃备用。
1.2 SVA RNA提取与反转录将SVA接种于BHK-21细胞，待80%细胞产生CPE时，反复冻融3次，10 000 r·min-1离心10 min后，取上清备用。根据RNA提取试剂盒说明书，提取病毒总RNA，加入到10 μL反转录体系中：5×buffer 2 μL、dNTP mix 0.5 μL、Oligo(dT)18 Primer 0.5 μL、病毒RNA模板7 μL，70 ℃水浴5 min，4 ℃冰浴2 min，再加入0.25 μL M-MLV反转录酶，42 ℃水浴1 h后得到病毒cDNA，于-70 ℃保存备用。
1.3 设计引物与特异性检验本研究参照NCBI所报道的40株SVA毒株基因序列，利用Primer5.0软件在保守区域设计了3对引物：P1、P2、P3(表 1)，并委托金斯瑞生物技术有限公司合成。按照“1.2”步骤获得SVA的cDNA，同时以实验室保存的EMCV NJ08株、FMDV、PRV ZJ01株、PRRSV经典毒株S1、CSFV、PEDV等病毒cDNA或DNA为模板，分别用3对引物同等条件下进行PCR扩增，从中选出扩增效率最高、特异性最强的引物用于SVA RT-PCR检测方法的建立。
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表 1 扩增SVA保守基因序列的引物设计 Table 1 The list of primers for amplifying the conservative sequences of SVA gene |
12.5 μL Taq DNA聚合酶混合物、1 μL上游引物、1 μL下游引物、1 μL SVA cDNA，ddH2O补足25 μL PCR扩增体系。保持95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s不变，依次对上、下游引物终浓度(4、4 mmol·L-1，4、2 mmol·L-1，4、1 mmol·L-1，1、4 mmol·L-1，2、4 mmol·L-1)、退火温度(52、54、56、58、60、62 ℃)30 s、72 ℃延长时间(15、20、25、30、35、40 s)、循环次数(15、20、25、30、35、40次)进行优化。
1.5 重复性检验用该方法对同一SVA cDNA进行6次重复PCR扩增，检验其重复性。
1.6 三种RT-PCR方法比较用本研究建立的方法和国外文献[15, 31]报道的两种PCR方法进行以下两组试验的比较。
1.6.1 敏感性试验将已知TCID50为109·mL-1的SVA细胞毒上清，用0.1 mol·L-1 PBS进行一系列10倍比稀释后，提取病毒RNA，分别用三种RT-PCR方法扩增，进行敏感性比较。
1.6.2 符合率试验从来自山东的100份猪组织样匀浆液中随机选取40份，10 000 r·min-1离心10 min后，取250 μL上清，按照“1.2”所述步骤处理后，用以上三种RT-PCR方法同时进行检测，比较符合率。
1.7 临床检测按照“1.6.2”所述步骤，对山东的100份组织匀浆液处理后，再按照“1.2”所述方法提取病毒RNA，反转录后获得cDNA，采用本研究建立的RT-PCR检测方法进行检测，分析SVA在该地区的流行情况。
2 结果 2.1 特异性扩增引物的选择以SVA CH-SD毒株、EMCV NJ08株、FMDV、PRV ZJ01株、PRRSV经典毒株S1、CSFV、PEDV等病毒cDNA或DNA为模板，分别用P1、P2、P3引物对扩增，扩增大小分别为694、469和333 bp。结果显示(图 1)，3对引物中，只有P1引物仅能特异性地以SVA cDNA为模板扩增出694 bp的单一目的条带，而与其他病毒cDNA或DNA均无交叉反应，且扩增条带最亮，表明P1引物扩增效率最高，且特异性最好，因此选择P1引物作为本研究的扩增引物。
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M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1~7.SVA、EMCV、FMDV、PRV、PRRSV、CSFV、PEDV；8.阴性对照 M. DL2000 DNA marker; 1-7. SVA, EMCV, FMDV, PRV, PRRSV, CSFV, PEDV; 8. Negative control 图 1 引物特异性鉴定 Fig. 1 The results of specificity detection of the primers |
通过对上、下游引物不同浓度的优化，最终确定上、下游引物终浓度均为4 mmol·L-1时，扩增效率最高(图 2)。
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M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1~5.上、下游引物终浓度分别为4、4 mmol·L-1，4、2 mmol·L-1，4、1 mmol·L-1，1、4 mmol·L-1，2、4 mmol·L-1；6.阴性对照 M. DL2000 DNA marker; 1-5. Concentration of primer F and R(4 & 4 mmol·L-1, 4 & 2 mmol·L-1, 4 & 1 mmol·L-1, 1 & 4 mmol·L-1, 2 & 4 mmol·L-1, respectively); 6. Negative control 图 2 最佳引物浓度的确定 Fig. 2 Determination of concentration of the primer |
在以上最佳扩增体系条件下，随着退火温度的升高，电泳条带逐渐减弱，在退火温度为54 ℃时，电泳条带最亮，扩增效率最高(图 3)。
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M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1.阴性对照；2~7.退火温度优化(54、56、58、60、62、64 ℃) M. DL2000 DNA marker; 1. Negative control; 2-7. Annealing temperature were 54, 56, 58, 60, 62, 64 ℃, respectively 图 3 最佳退火温度的确定 Fig. 3 Determination of the optimal annealing temperature of PCR |
琼脂糖凝胶电泳结果显示(图 4)，在不同延长时间条件下，目的条带的亮度无肉眼可辨差异，为缩短扩增时间，确定最佳延长时间为15 s。
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M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1.阴性对照；2~7.延长时间优化(15、20、25、30、35、40 s) M. DL2000 DNA marker; 1. Negative control; 2-7. Extension time were 15, 20, 25, 30, 35, 40 s, respectively 图 4 最佳延长时间的确定 Fig. 4 Determination of the optimal time of extension |
随着PCR循环次数的增加，目的条带亮度逐渐增加(图 5)，同时游离碱基被消耗，循环次数35和40的条带几乎无差异，为提高检测效率，并减少非特异扩增，确定最佳循环次数为35。
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M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1~6.循环次数优化(15、20、25、30、35、40)；7.阴性对照 M. DL2000 DNA marker; 1-6. 15, 20, 25, 30, 35, 40 cycles, respectively; 7. Negative control 图 5 最佳循环次数的确定 Fig. 5 Determination of the optimal cycles |
以SVA cDNA为模板，进行6次重复检验，结果显示(图 6)，6次扩增产物的电泳条带大小、亮度均一致，表明该方法重复性良好。
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M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1~6. 6次重复PCR检测；7.阴性对照 M. DL2000 DNA marker; 1-6. PCR repeatability; 7. Negative control 图 6 重复性试验 Fig. 6 Repeatability test |
10-1~10-10梯度稀释病毒后，提取核酸进行RT-PCR检测(图 7)，该方法的最低检出限为100TCID50，即1 TCID50，而用已报道的PCR方法[15, 31]检测到的最低病毒量分别为103TCID50和101TCID50，本研究建立的方法检测敏感性明显高于其他两种方法，证明该方法敏感性更高。
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M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1~10. 108TCID50、107TCID50、106TCID50、105TCID50、104TCID50、103TCID50、102TCID50、101TCID50、100TCID50、10-1TCID50；11.阴性对照 M. DL2000 DNA marker; 1-10. 108TCID50, 107TCID50, 106TCID50, 105TCID50, 104TCID50, 103TCID50, 102TCID50, 101TCID50, 100TCID50, 10-1TCID50; 11. Negative control 图 7 敏感性试验 Fig. 7 Sensitivity test |
用该方法和文献报道的PCR检测方法[15, 31]检测40份临床样品，部分检测结果见图 8，共检测到阳性2份，阴性38份，三种方法的符合率为100%，表明该方法可用于SVA的检测。
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M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1~6.部分猪组织样品检测检测结果；7.阳性对照；8.阴性对照 M. DL2000 DNA marker; 1-6. The detection results of some samples of pig tissue; 7. Positive control; 8. Negative control 图 8 符合率试验 Fig. 8 Conformity test |
对来自山东的100份组织病料进行检测，结果阳性为2份，阴性为98份，阳性率为2%，表明SVA在该地区尚未流行，但随着病毒基因的进化和毒力的增强，应做好相关疫病的防疫工作。
3 讨论SVA最初作为一种PER.C6细胞培养污染物被发现[1]，后被证实是导致巴西、美国、中国广州等多地特发性水疱病的病原，成年猪多呈隐性感染，发病母猪表现水疱症状，新生仔猪发病严重可致死亡，给养猪业造成一定的经济损失。该病毒与口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、猪传染性水疱病病毒共同组成五大猪水疱病病原，且水疱症状极为相似，只能依赖于实验室诊断。目前各实验室已建立多种SVA检测方法，其中病毒分离鉴定和病毒中和试验需要掌握细胞培养技术，费时、费力；荧光定量RT-PCR方法可对病原进行定量检测，但对试验条件要求比较高。酶联免疫吸附试验主要有竞争ELISA和间接ELISA，前者需要制备单克隆抗体，后者则对抗原的纯度要求较高，且容易产生交叉反应，导致假阳性。RT-PCR特异性好，灵敏度高，且操作简便、快捷，便于养殖场检测人员的掌握。而理想的RT-PCR的建立，关键在于特异性引物的选择，同时要求能尽可能多地检测出不同SVA细胞株，且不与其他病毒基因发生非特异扩增，因此本研究对美国、巴西和中国的流行毒株进行基因比对，从中选择相对保守区域，设计了3对引物P1、P2和P3，P1引物相较于P2和P3引物，以SVA cDNA为模板的PCR电泳目的条带更亮，且与EMCV、FMDV、PRV、PRRSV、CSFV、PEDV等病毒的DNA和cDNA均不反应，是理想的扩增引物。通过对一系列的条件优化，确定最佳引物浓度为4 mmol·L-1，最佳扩增体系：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s、54 ℃退火30 s，72 ℃延长15 s，35个循环，72 ℃终延伸5 min。该方法特异性好，不与其他病毒基因交叉反应，SVA的最低检测限可达1 TCID50，比文献[15, 31]的病毒检出限更高，三种RT-PCR的检测符合率为100%。研究表明[8]感染SVA后，病情大多呈一过性，病毒血症随病情发展逐渐消失，因此用该方法可以检出感染前期猪血液中的病毒核酸，而后期可能在血液中无法检出。另外，SVA感染猪的水疱液、心和扁桃体中存在大量的病毒，可作为SVA的最佳检测样品。综上，本研究建立的SVA RT-PCR方法可作为一种可靠的病原检测方法，用于SVA的诊断和分子流行病学的调查和分析。
用该方法对山东地区的100份组织进行检测，阳性率为2%，虽然阳性率低，但是自2015年我国首次报道该病毒感染病例，SVA疫病已迅速在广东、湖北、河南、山东等多省份扩散，未来存在疫病暴发的可能。目前市场上尚无针对SVA的有效疫苗，缺乏相应的应急措施，一旦发生疫病，可参考口蹄疫防控应急预案处理，减少经济损失。
4 结论本研究建立的SVA RT-PCR检测方法特异性好，灵敏度高，适用于SVA的诊断和分子流行病学调查，经初步检测，山东地区SVA感染阳性率处于较低水平，但是随着病毒的基因变异和致病性的增强，疫情防控不容乐观，需政府相关部门和养殖场提高警惕，防患于未然。
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