2. 重庆市高校兽医科学工程研究中心中兽药创新研发实验室, 重庆 402460
2. Chinese Veterinary Herbal Drugs Innovation Research Lab, University Veterinary Science Engineering Research Center, Chongqing 402460, China
在我国西南地区以及长江流域地区，夏、秋季节气候独特，常处于高热高湿环境，使得仔猪易发湿热泄泻。仔猪湿热泄泻主要是由于湿邪热毒蕴结脾，导致脾之运化功能失调，谷气料毒积于肠道之中，属里热湿证，治疗原则应以清热燥湿、利水止泻为宜[1]。肠道是机体消化、吸收营养物质的主要场所，对机体的消化吸收起着十分重要的作用；同时肠道也是机体最大的免疫器官，肠道黏膜层是肠道发挥其免疫功能的主要部位所在，肠道黏膜层主要包括黏膜上皮、固有层、黏膜肌肉层[2-3]。
仔猪湿热泄泻易导致肠道出现损伤，肠黏膜遭到破坏，仔猪生长发育受到严重的影响。肠上皮细胞为单层柱状细胞并弯曲褶皱形成绒毛-隐窝结构，肠黏膜上皮细胞主要由吸收细胞、杯状细胞(goblet cell，GC)和内分泌细胞3部分组成，杯状细胞作为机体肠道内重要的分泌细胞，可分泌黏蛋白(mucoprotein, MUC)、肠三叶因子(intestinal trilobular factor, ITF)、抵抗素样分子(resistin-like molecule β, RELMβ)等物质，这些分泌物是小肠黏液的主要成分，可在肠道表面形成一层保护性凝胶层，保护肠黏膜免受侵袭[4]。其中，MUC对上皮细胞起重要保护和润滑作用；而ITF是一类生长因子类多肽物质，特异分布于肠黏膜表面，不仅可促进细胞增殖与移行，还具有稳定肠道黏液层、增强肠道黏膜屏障的功能；两者相互作用，形成保护性黏液凝胶层，阻止肠黏膜的损伤，从而在肠黏膜屏障功能中均发挥重要作用[5-8]。复方术苦芩是由西南大学动物科学学院中药创新研究室研发，具有清热燥湿、健脾和胃、利水止泻等主要功效。前期研究发现复方术苦芩主要是通过改善胃肠功能、提高免疫、增强抗病能力、促进肠黏膜修复等来发挥主要作用的[9]。为此，笔者用复方术苦芩总多糖(polysaccharides from ZhuKuQin, ZKQPs)探究其对湿热泄泻仔猪小肠GC数量以及MUC-2和ITF-3 mRNA转录量和含量的影响，进一步阐明复方术苦芩对湿热泄泻仔猪小肠损伤修复作用的机制。
1 材料与方法 1.1 试验材料60只30~35日龄三元断奶仔猪(长×大×荣昌)，体重(10.0±0.3)kg，雌雄各半，由西南大学荣昌校区动物科统一购买。复方术苦芩，由白术(5.5份)、苦参(2份)、黄芪(6.5份)、金银花(6.5份)、白头翁(5.5份)、栀子(2.5份)、黄芩(6.5份)、广藿香(4.5份)组成，购自四川千金中药饮片有限公司，批号：160201；番泻叶：购于安徽省毫州市德昌药业有限公司，制备成每毫升含1 g生药的番泻叶提取液；白头翁散：重庆天龙牧业科技有限公司；批号：20170425。中性树胶购自重庆川东化工(集团)有限公司，批号：20170109；PAS染色液购自Secoma-Bio公司，批号：051117G1001；猪肠三叶因子(ITF-3)、猪黏蛋白-2(MUC-2)试剂盒购自厦门惠嘉生物技术有限公司，批号：201707；Trizol总RNA抽提试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，批号：B511321；反转录试剂盒购自GoScriptTM Reverse Transcription System，批号：A5000；荧光定量试剂盒购自TaKaRa SYBR® Premix Ex-TaqTM Ⅱ，批号：RR820A。
1.2 主要仪器设备切片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)；显微镜(日本IX51 Olympus)；-86 ℃超低温冷冻冰箱(中科美菱低温科技股份有限公司DW-HL678)；酶标仪(Bio-Rad公司iMark)；荧光定量PCR仪(TU-1950 Roche公司)等仪器。
1.3 试验方法 1.3.1 药物的制备 1.3.1.1 ZKQPs提取制备[10]按比例称取所需药材共100 g，粉粹后加入8倍石油醚，置于多功能提取浓缩机组中，60 ℃回流提取3次；将药渣加入6倍75%乙醇，回流提取2次，合并滤液，回收乙醇至无乙醇味，得滤液A；将醇提后药物加入8倍蒸馏水水提，提取3次，得滤液B，合并滤液A、B，浓缩至生药量为1 g·mL-1，加入无水乙醇至含醇量达80%进行醇沉，4 ℃过夜，过滤，加水溶解滤渣，反复醇沉3次；将粗提的多糖加水溶解后，加入sevag试剂除蛋白(5次以上，至几乎无蛋白)；进行二次醇沉，最后分别依次加入无水乙醇、丙酮、乙醚进行洗涤、纯化(3次以上)，30 ℃干燥，得多糖。参照文献[11]采用苯酚硫酸法测定ZKQPs的糖含量。
1.3.1.2 番泻叶提取液将番泻叶水提三次，浓缩为生药量为1 g·mL-1的溶液。
1.3.2 动物分组与处理参考文献方法[12]，将适应性饲养一周的断奶仔猪60头随机分为A、B两组，A组为空白对照组(10头)，饲养于湿度65%~75%，25~27 ℃的圈舍中，给予正常饲料、自由饮水；B组为造模组(50头)，用保温灯和喷雾器使造模圈舍环境控制在35~38 ℃，相对湿度90%~95%，将造模仔猪饲喂于圈舍中，并饲喂高脂配合饲料(猪油18%+蔗糖1%+酒糟5%，连续10 d，隔天加入1%番泻叶提取液)、自由饮水。将B组造模成功后的50头仔猪随机分为模型组、阳性药物组、ZKQPs高、中、低剂量组，各组分圈饲养，饲喂正常仔猪配合饲料，自由饮水。ZKQPs高、中、低剂量组仔猪分别按体重给予75、50和25 mg·kg-1 ZKQPs，2次·d-1，阳性药物组仔猪按体重给予白头翁散1.0 g·kg-1，于每天9：00、15:00拌料给药2次，连续给药7 d。模型组与空白对照组仔猪，拌以等量生理盐水，正常饲喂饲料、自由饮水。
模型成功判定标准[13]：当仔猪出现精神沉郁(喜卧，不愿走动)、采食下降、口渴喜饮、排便次数增加、排稀粪或水样便、肛门红肿、肛周污秽、尿黄短赤、身体消瘦、被毛粗乱等症状时可判定模型建立成功。
1.3.3 仔猪小肠组织的采集与制备试验结束后仔猪禁食12 h，每组随机抽取3头仔猪，进行放血屠宰，采取小肠组织(十二指肠、空肠、回肠)，在每段小肠起始端2 cm处采集各段小肠组织两段，每段5 cm，第一段用灭菌生理盐水冲洗干净，放入4%甲醛溶液中固定，用于检测GC，第二段-86 ℃冷冻用于检测仔猪小肠表面分泌物中MUC-2和ITF-3含量，并检测MUC-2和ITF-3的转录情况。
1.3.4 仔猪小肠组织GC的检测(PAS染色法)将固定好的仔猪各段小肠组织进行修块、脱水、透明、包埋、切片；PAS染色，封片，镜检。每组随机选取1头仔猪，每头仔猪各段小肠组织(十二指肠、空肠、回肠)各制作一张切片，每段小肠组织切片在显微镜(400×)下选取5根完整的小肠绒毛计数GC。
1.3.5 ELISA法检测仔猪小肠表面分泌物中MUC-2和ITF-3的含量用猪MUC-2和ITF-3 ELISA试剂盒检测各段小肠表面分泌物中MUC-2和ITF-3的含量。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，以空白孔调零，在450 nm波长检测各孔的OD值，计算各样本的含量。
1.3.6 荧光定量PCR检测仔猪小肠组织中MUC-2和ITF-3的mRNA转录水平登录GenBank，根据已有的猪MUC-2和ITF-3和内参基因β-actin mRNA核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0软件设计相对应的引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成相对应的MUC-2和ITF-3引物，引物信息见表 1。仔猪小肠组织总RNA提取严格参照UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒说明书进行操作。使用promega反转录试剂盒(GoScriptTM Reverse Transcription System)将提取的总RNA反转录成cDNA，在Roche Light Cycler 96荧光定量PCR仪上扩增，共40个循环，每个样品3个重复。
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表 1 引物信息表 Table 1 The table of primer information |
用SPSS 20.0统计软件，对所得数据进行显著性检验，并进行分析比较，数据以平均值±标准差表示；RT-PCR mRNA相对转录量分析数据处理采用2-△△Ct法，结果通过Bio-Rad CFX Manager软件进行分析。
2 结果 2.1 ZKQPs的糖含量ZKQPs糖含量为91.42%。
2.2 ZKQPs对湿热泄泻仔猪的作用及对各段小肠GC数量的影响结果显示，造模第3天开始，造模组仔猪陆续开始出现食欲减退，饮水次数增加，精神沉郁，粪便开始不成形，在造模第5天仔猪出现粪便溏稀、泄泻如水样且腥臭，采食量大幅下降，饮水量增加，仔猪逐渐消瘦，被毛粗乱逆立，肛周有污物、肛门红肿，可判定成功建立湿热泄泻模型。用药后仔猪临床症状出现好转；在给药第5天时，仔猪粪便基本成形，采食、饮水基本恢复正常，提示ZKQPs对仔猪湿热泄泻有较好的治疗效果。与空白对照组比较，模型组仔猪十二指肠、空肠、回肠中GC数量均减少，差异显著(P＜0.05)；与模型组比较，阳性药物组仔猪十二指肠、空肠、回肠中GC数量增加，差异显著(P＜0.05)。与阳性药物组比较，除ZKQPs低剂量组仔猪十二指肠、空肠、回肠外，各ZKQPs剂量组仔猪十二指肠、空肠、回肠中GC数量差异不显著(P > 0.05)。与模型组比较，除ZKQPs低剂量组仔猪十二指肠外，各ZKQPs剂量组仔猪十二指肠、空肠、回肠中GC数量均有所增加，其中ZKQPs高、中剂量组仔猪十二指肠、回肠和ZKQPs高剂量组仔猪空肠GC数量差异显著(P＜0.05)。结果详见图 1、2。
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图 1 仔猪各段小肠GC分布(PAS染色，400×) Fig. 1 GC distribution in the small intestine tissue of piglets (PAS staining, 400×) |
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模型组vs空白对照组，△. P＜0.05，△△. P＜0.01；各药物组(阳性药物及不同剂量ZKQPs)vs模型组，*. P＜0.05，**. P＜0.01。下同 The model group vs the blank control group, △. P < 0.05, △△. P < 0.01; the drug groups (positive drug and different doses of ZKQPs) vs the model group, *. P < 0.05, **. P < 0.01. The same as below 图 2 仔猪不同小肠段GC数量 Fig. 2 The number of GC in different intestinal segments of piglets |
结果显示，与空白对照组比较，模型组仔猪十二指肠和空肠表面分泌物中MUC-2含量降低，差异极显著(P＜0.01)，仔猪回肠表面分泌物中MUC-2含量降低，差异显著(P＜0.05)。与模型组比较，阳性药物组仔猪十二指肠、空肠表面分泌物中MUC-2含量增加，差异极显著(P＜0.01)。与阳性药物组比较，ZKQPs高剂量组仔猪十二指肠、空肠和回肠表面分泌物中MUC-2含量差异不显著(P > 0.05)。与模型组比较，除ZKQPs低剂量组外，各ZKQPs剂量组仔猪十二指肠、空肠和回肠表面分泌物中MUC-2含量均升高，其中ZKQPs高剂量组仔猪十二指肠、空肠表面分泌物中MUC-2含量差异极显著(P＜0.01)，ZKQPs高剂量组仔猪回肠表面分泌物中MUC-2含量差异显著(P＜0.05)。结果详见图 3。
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图 3 仔猪小肠表面分泌物中MUC-2含量 Fig. 3 The content of MUC-2 in secretion of small intestine in piglets |
结果显示，与空白对照组比较，模型组仔猪十二指肠、空肠、回肠表面分泌物中ITF-3含量降低，差异极显著(P＜0.01)，与模型组比较，阳性药物组仔猪空肠、回肠表面分泌物中ITF-3含量增加，差异极显著(P＜0.01)。与阳性药物组比较，除ZKQPs低剂量组仔猪十二指肠、空肠、回肠外，各ZKQPs剂量组仔猪十二指肠、空肠、回肠表面分泌物中ITF-3含量差异不显著(P > 0.05)。除十二指肠、空肠ZKQPs低剂量组外，各ZKQPs剂量组仔猪十二指肠、空肠、回肠表面分泌物中ITF-3含量均升高，其中ZKQPs高剂量组仔猪十二指肠表面分泌物中ITF-3含量与模型组比较，差异极显著(P＜0.01)；ZKQPs高、中剂量组仔猪空肠分泌物中ITF-3含量与模型组比较，差异极显著(P＜0.01)；各ZKQPs剂量组仔猪回肠表面分泌物中的ITF-3含量均升高，与模型组比较，差异极显著(P＜0.01)。结果详见图 4。
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图 4 仔猪小肠表面分泌物中ITF-3含量 Fig. 4 The content of ITF-3 in secretion of small intestine in piglets |
结果显示，与空白对照组比较，模型组仔猪十二指肠中MUC-2 mRNA的转录量降低差异显著(P＜0.05)；与阳性药物组比较，各ZKQPs剂量组仔猪十二指肠MUC-2 mRNA的转录量差异不显著(P>0.05)。与模型组比较，ZKQPs各剂量组仔猪十二指肠中MUC-2 mRNA的转录量均升高，ZKQPs高剂量组仔猪十二指肠中MUC-2 mRNA转录量差异显著(P＜0.05)。结果见图 5A。
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图 5 仔猪小肠各段MUC-2 mRNA相对转录量 Fig. 5 Relative transcriptional quantity of MUC-2 mRNA in different intestinal segment of piglets |
与空白对照组比较，模型组仔猪空肠中MUC-2 mRNA的转录量降低差异极显著(P＜0.01)；与阳性药物组比较，各ZKQPs剂量组仔猪空肠中MUC-2 mRNA的转录量差异不显著(P > 0.05)。与模型组比较，ZKQPs各剂量组仔猪空肠中MUC-2 mRNA的转录量均升高，ZKQPs高、中剂量组仔猪空肠中MUC-2 mRNA转录量差异极显著(P＜0.01)，低剂量组差异显著(P＜0.05)。结果见图 5B。
与空白对照组比较，模型组仔猪回肠中MUC-2 mRNA的转录量降低，差异极显著(P＜0.01)；与阳性药物组比较，各ZKQPs剂量组仔猪回肠中MUC-2 mRNA的转录量差异不显著(P > 0.05)。与模型组比较，ZKQPs各剂量组仔猪回肠中MUC-2 mRNA的转录量均升高，ZKQPs高剂量组仔猪回肠中MUC-2 mRNA转录量差异极显著(P＜0.01)，ZKQPs中、低剂量组仔猪回肠中MUC-2 mRNA转录量差异显著(P＜0.05)。结果见图 5C。
2.5.2 仔猪小肠组织中ITF-3 mRNA的转录情况结果显示，与空白对照组比较，模型组仔猪十二指肠中ITF-3 mRNA的转录量降低，差异极显著(P＜0.01)；与阳性药物组比较，ZKQPs高剂量组仔猪十二指肠中ITF-3 mRNA的转录量差异不显著(P > 0.05)。与模型组比较，ZKQPs高、中剂量组仔猪十二指肠中ITF-3 mRNA的转录量均升高，差异极显著(P＜0.01)。结果见图 6A。
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图 6 仔猪小肠各段ITF-3 mRNA相对转录量 Fig. 6 Relative transcriptional quantity of ITF-3 mRNA in different intestinal segment of piglets |
与空白对照组比较，模型组仔猪空肠中ITF-3 mRNA的转录量降低，差异极显著(P＜0.01)；与阳性药物组比较，ZKQPs高剂量组仔猪空肠中ITF-3 mRNA的转录量差异不显著(P > 0.05)。与模型组比较，ZKQPs各剂量组仔猪空肠中ITF-3 mRNA的转录量均升高，ZKQPs高、中剂量组仔猪空肠中ITF-3 mRNA转录量差异极显著(P＜0.01)。结果见图 6B。
与空白对照组比较，模型组仔猪回肠中ITF-3 mRNA的转录量降低，差异极显著(P＜0.01)；与阳性药物组比较，ZKQPs高剂量组仔猪回肠中ITF-3 mRNA的转录量差异不显著(P > 0.05)。与模型组比较，除ZKQPs低剂量组外，各ZKQPs剂量组仔猪回肠中ITF-3 mRNA的转录量均升高，ZKQPs高剂量组仔猪回肠中ITF-3 mRNA转录量差异极显著(P＜0.01)，ZKQPs中剂量组仔猪回肠中ITF-3 mRNA转录量差异显著(P＜0.05)。结果见图 6C。
3 讨论多糖是一类由许多单糖分子通过糖苷键聚合形成的碳水化合物，广泛存在于植物、微生物(细菌及真菌)和海藻中。研究表明，多糖具有改善小肠黏膜结构和改善小肠营养物质吸收的功能，可从很多方面对肠道屏障进行修复[14]；在肠上皮细胞表面形成类似于肠道屏障黏液层的亲水凝胶层，维护肠道屏障结构的完整性[15]；也能降低肠黏膜通透性使肠道屏障得到保护。仔猪断奶后其胃肠尚未发育完全，处于“稚阴稚阳”状态，高热、高湿的环境会使湿邪、热毒集聚仔猪体内，使得饲料在胃肠内异常发酵，有害微生物大量繁殖，产生毒素刺激肠壁细胞分泌体液，破坏黏液屏障，出现泄泻。小肠GC是肠黏膜上皮中分泌黏液的细胞，GC在肠黏膜损伤后的修复重建起着重要作用[16]，当肠黏膜遭到严重损伤后，肠黏膜表面几乎由GC来代替脱落的肠绒毛，在肠黏膜损伤的后期，GC数量会出现下降[17]。石玉祥等[18]研究发现，枸杞多糖能增加小鼠小肠GC的数量。本试验利用人工复制仔猪湿热泄泻模型，结果显示，模型组仔猪十二指肠、空肠、回肠中GC数量均减少，与文献[12]结果一致。除ZKQPs低剂量组仔猪十二指肠外，其余各治疗组仔猪小肠内GC数量均有所增加，可见ZKQPs能提高湿热泄泻仔猪小肠GC的数量，在肠道内形成亲水性凝胶，有效的阻止病原微生物直接侵袭肠黏膜上皮，减少肠黏膜的损伤，促进肠黏膜的自我修复。
MUC-2属于分泌型黏蛋白，在肠道表面形成一层黏液层，具有保护肠黏膜的作用。肠道的黏液屏障主要是由GC分泌的黏蛋白与水、无机盐等结合共同形成的凝胶型网状结构黏液层，可分为两层，即可供共生菌寄生的疏松黏液层和以“过滤”形式阻止病原微生物进入的紧密附着黏液层[19]。研究表明[20-21]，当MUC-2的结构和功能发生改变后，致病微生物可自由穿过黏液层，直接攻击肠黏膜上皮细胞，使得肠黏膜受到损伤发生病变。黏液层是抑制肠道内细菌与肠上皮细胞直接接触的重要因素，黏液层变薄或消失后，细菌就能直接侵袭上皮细胞导致肠道炎性反应或免疫反应，这是肠道发生病变的重要因素[22]。邓桦等[23]研究显示，玉屏风多糖可从多方面调控小鼠肠黏膜的免疫应答，可有效增强肠黏膜免疫功能，缓解和改善免疫抑制小鼠肠黏膜免疫屏障的损伤。本研究结果显示，模型组仔猪小肠组织MUC-2含量和MUC-2 mRNA的转录量均显著降低，除个别肠段ZKQPs低剂量组仔猪小肠组织MUC-2 mRNA的转录量和MUC-2含量没有改变外，其余各组中仔猪小肠组织MUC-2含量和MUC-2 mRNA的转录量均增加，这可能与ZKQPs可使损伤后的肠黏膜的GC数量增多有关。受损肠黏膜在修复过程中，黏液屏障的恢复十分重要，其关系到生物屏障的恢复，一旦黏液层形成后，肠道内的共生菌就可在肠道寄生，形成菌群隔离带，阻止致病微生物对肠粘膜上皮细胞的侵袭。
ITF-3是属于三叶肽蛋白家族的成员，为GC分泌的小分子多肽，研究证明其在维持肠上皮细胞的完整性、恢复肠黏膜的正常通透性、加速肠黏膜的修复等方面起到重要作用[23]，大量研究发现ITF-3与MUC-2相互作用，进而增强肠道黏液屏障，是由于其特殊的空间结构可与MUC-2中糖苷链结合[24]。ITF-3具有维护内质网结构的功能，对蛋白质的折叠和分泌具有一定的调控作用[25]。研究发现，ITF-3能通过促进细胞移行、促进黏液分泌等机制减轻烧伤后肠道损伤，促进受损黏膜修复[26]。ITF-3主要在肠道内转录，由具有分泌功能的杯状细胞，黏膜细胞和腺细胞等合成并分泌进入肠道，与MUC-2共同发生作用，以一种旁分泌的方式作用于邻近的肠细胞[27]。ITF-3可使得紧密链接蛋白转录，肠黏膜通透性恢复正常，起到保护肠黏膜的作用[28-29]。本研究结果显示，模型组仔猪小肠中的ITF-3含量和ITF-3 mRNA的转录量均降低；除个别肠段ZKQPs低剂量组仔猪小肠组织ITF-3含量和ITF-3 mRNA的转录量没有改变外，其余各组仔猪各段小肠内的ITF-3含量和ITF-3 mRNA的转录量均有所增加，推测ZKQPs可通过改善小肠内的ITF-3含量和ITF-3 mRNA的转录量达到加速修复肠黏膜的作用。
4 结论ZKQPs可提高湿热泄泻仔猪小肠GC的数量以及MUC-2和ITF-3含量和其mRNA转录量，以发挥ZKQPs对湿热泄泻仔猪小肠肠黏膜的修复作用，形成较好的肠道内环境。
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