畜牧兽医学报  2019, Vol. 50 Issue (6): 1230-1238. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2019.06.013    PDF    
引用本文
申松玮, 王泽源, 范威峰, 祝常椿, 陆游, 石宝兰, 刘雷, 沈海峰, 焦库华, 秦涛, 陈素娟, 彭大新, 刘秀梵. 2017-2018年华东地区H9亚型禽流感病毒分离毒株的抗原差异分析[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(6): 1230-1238.  
SHEN Songwei, WANG Zeyuan, FAN Weifeng, ZHU Changchun, LU You, SHI Baolan, LIU Lei, SHEN Haifeng, JIAO Kuhua, QIN Tao, CHEN Sujuan, PENG Daxin, LIU Xiufan. Antigen Difference Analysis of H9 Subtype Avian Influenza Viruses Isolated in East China during 2017-2018[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2019, 50(6): 1230-1238.  
2017-2018年华东地区H9亚型禽流感病毒分离毒株的抗原差异分析
申松玮1, 王泽源1, 范威峰1, 祝常椿1, 陆游1, 石宝兰2, 刘雷2, 沈海峰2, 焦库华1, 秦涛1, 陈素娟1, 彭大新1, 刘秀梵1     
1. 扬州大学兽医学院, 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心, 扬州 225009;
2. 国药集团扬州威克生物工程有限公司, 扬州 225009
收稿日期：2018-11-29
基金项目：国家重点研发计划项目（2017YFD0500701）；江苏省重点研发计划项目（BE2018358）；扬州市“绿扬金凤计划”项目[扬人才办（2017）6号]；江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）；江苏省家禽疫病防控工程技术研究中心项目（BM2013450）
作者简介：申松玮(1993-), 男, 河南林州人, 硕士, 主要从事动物传染病研究, E-mail:s.s.wei@qq.com.
通信作者：彭大新, 主要从事动物传染病研究, Tel:0514-87979386, E-mail:pengdx@yzu.edu.cn.
摘要：为掌握华东地区H9亚型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）的流行情况及变异程度，采集临床疑似病料和活禽交易市场家禽的棉拭子样品，通过鸡胚接种、HA和HI试验及RT-PCR等方法分离鉴定H9 AIV，对其中部分毒株进行测序和序列分析，筛选4个代表毒株免疫SPF鸡制备抗血清，利用交叉血凝抑制试验测定抗原差异性。结果如下：共分离鉴定出62株H9亚型禽流感病毒，分离率为2.02%（62/3 074）。对25株H9亚型禽流感病毒株序列分析发现，分离株属于h9.4.2.5谱系，并进一步细分为A和B亚系。HA基因裂解位点氨基酸为PSRSSR↓G，符合低致病性禽流感病毒的特征。与Y280代表株HA基因的推导氨基酸相比，分离株受体结合位点左侧臂全部变为NGLMGR。在抗原位点92位氨基酸出现R（64%）/K（36%）的变化。交叉血凝抑制试验结果表明分离株间的HI抗体滴度相差2~8 log2，可分为2类抗原型。因此，目前流行的H9亚型AIV发生了抗原变异，至少同时存在两种抗原型。
关键词：H9亚型禽流感病毒    抗原性    序列分析    交叉反应    
Antigen Difference Analysis of H9 Subtype Avian Influenza Viruses Isolated in East China during 2017-2018
SHEN Songwei1, WANG Zeyuan1, FAN Weifeng1, ZHU Changchun1, LU You1, SHI Baolan2, LIU Lei2, SHEN Haifeng2, JIAO Kuhua1, QIN Tao1, CHEN Sujuan1, PENG Daxin1, LIU Xiufan1     
1. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China;
2. Sinopharm Yangzhou Vac Biological Engineering Co. LtD, Yangzhou 225009, China
Abstract: This experiment was conducted to understand the prevalence and variation of H9 subtype avian influenza virus (AIV) isolated in East China. Diseased samples from clinical suspected cases and swab samples from poultry in live poultry markets were collected and subjected to inoculate SPF chicken embryos. H9 AIVs were identified by HA and HI test. HA genes of partial H9 AIVs were amplified by RT-PCR, and PCR productions were subjected to sequence. Antisera from SPF chickens vaccinated with four selected strains were performed cross-reactivity by HI test to analyze the antigen variation. Results were as follows:62 isolates of H9 subtype AIV were identified, and the isolation rate was 2.02% (62/3 074). Sequence analysis of 25 H9 subtype AIVs revealed that the HA genes were belonged to the h9.4.2.5 lineage, and further were divided into Group A and Group B. The amino acid at the HA gene cleavage site was PSRSSR↓G, which is consistent with the characteristics of low pathogenic avian influenza virus. Compared with the amino acid of the HA gene of the Y280-like strain, the left arm of the receptor binding site (RBS) was changed to NGLMGR. There was a change of R (64%)/K (36%) at antigenic residue 92. The cross-reactivity of antisera showed that the HI antibody titers were differed by 2-8 log2 between the isolates and the isolates could be categorized to two antigenic phenotypes. Therefore, antigen drift is appeared in the prevalent H9N2 AIVs, and at least two antigenic phenotypes are existed simultaneously.
Key words: H9 subtype avian influenza virus     antigenicity     sequence analysis     cross-reactivity    

H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)是禽流感病毒众多亚型中的一种亚型，为低致病性禽流感(low pathogenic avian influenza, LPAI)的病原[1]。AIV可通过空气粉尘、饲料、饮水等而传播，感染家禽的死亡率较低，但H9 AIV常混合其他细菌或病毒感染，尤其是和大肠杆菌混合感染后，鸡群死亡率在10%以上[2]，饲料中混合有黄曲霉毒素并感染H9 AIV时会出现严重的腹泻、打喷嚏等症状，并造成较高的死亡率[3]。H9 AIV还广泛存在于活禽市场，不仅可在家禽棉拭子样品、环境样品检测到，也可以在气溶胶样品中检测到[4]。

H9 AIV还可以感染人，检测家禽饲养人员的血清，其针对H9 AIV的血清阳性率可高达15.5%[5]。2013年，在中国首次暴发感染人类的H7N9流感病毒，其6个内部基因来自H9N2 AIV[6]。当前流行的H9 AIV可以为多种病毒提供内部基因，可作为流感病毒的基因供体与其他亚型病毒重排，有可能产生在人类群中大规模感染、流行的新型流感病毒[7]。1999年从香港活禽市场分离到的H9 AIV，大致可分为三个亚群，代表毒株分别为A/Quail/Hong Kong/G1/97、A/Duck/Hong Kong/Y280/97以及A/Duck/Hong Kong/Y439/97[8]。而近些年H9 AIV则发生明显的变异，其中2011—2014年H9 AIV的变异速度是1999—2005年的10.64倍[9]，因此，开展H9 AIV流行情况和抗原变异程度的评估对于了解我国H9亚型禽流感病毒的遗传变异规律是非常必要的。

1 材料与方法 1.1 样品的采集

样品包括来自2017年5月—2018年3月江苏、安徽、浙江等地的送检病料，以及来自扬州大学动物医院畜禽门诊的临床病料和2017年10月—2018年5月采集活禽交易市场家禽的棉拭子样品。

1.2 主要试剂

RNA提取试剂盒购自Axygen公司；AMV反转录酶、RNA酶抑制剂(RNasin)及Taq DNA聚合酶购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；100 bp DNA Marker、DL2000 DNA Marker、Agrose Gel DNA Extraction Kit均购自大连TaKaRa公司；PCR mix购自TransGene公司；其余试剂均为国产分析纯级产品。

1.3 引物

AIV的反转录引物为12碱基随机引物：5′-AGCAAAAGCAGG-3′。为扩增HA基因片段，依据GenBank序列设计PCR引物[10]，引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

1.4 病毒的分离鉴定

病料样品加入四抗PBS(根据OIE推荐资料改制，青霉素10 000 U·mL-1、链霉素10 mg·mL-1、庆大霉素250 μg·mL-1、卡那霉素250 μg·mL-1，用10 mol·L-1 NaOH溶液调pH至7.2)研磨后，1 000 r·min-1离心10 min，吸取上清；棉拭子样品与运输液(四抗PBS)混匀，8 000 r·min-1离心10 min，吸取上清。将上清接种9~11日龄的SPF鸡胚尿囊腔，每胚接种0.2 mL，每隔12 h照胚一次，死亡鸡胚于4 ℃冰箱放置6 h后收获其尿囊液，96 h后将没有死亡的鸡胚置于4 ℃冷藏致死，收取尿囊液。通过血凝(HA)及血凝抑制(HI)试验，初步鉴定HA亚型。

1.5 序列测定和分析

选择单一感染性样品，按Axygen说明书抽提AIV RNA，通过RT-PCR的方法扩增AIV的HA基因，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，切取目的条带送北京擎科新业生物技术有限公司测序，使用Lasergene 7.1编辑测序基因，并通过MEGA 7.0软件的Neighbor-joining法以及Kimura-2-Paramerer模式运算，将bootstrap值设为1 000绘制进化树，并通过计算组间平均遗传距离，分析进化树各分支的遗传距离。在H9 HA数字谱系中，可分为三级，主谱系之间的遗传距离为20.0%~24.39%，次级谱系之间的遗传距离为11.93%~17.27%，三级谱系之间的遗传距离为5.81%~ 18.28%[11]。

1.6 交叉血凝抑制试验

比对抗原位点、受体结合位点、毒株的来源、分离时间、遗传谱系等筛选出W2393、J6354、W131210和YZ0505等4个H9 AIV代表分离株(表 1)，W131210、W2393、J6354从活禽市场的鸡中分离，YZ0505从临床病料样品中分离。甲醛灭活病毒后，制成油包水型油乳剂灭活疫苗，免疫21日龄SPF鸡，在14、21 d分别测血清效价，当HI抗体效价大于8 log2后，采血制备抗血清通过HI试验测定交叉HI抗体效价。通过计算R值评估抗原差异性，若R＜0.5，表明两株病毒间差异显著[12-13]。

表 1 H9 AIV参考及分离株背景资料 Table 1 Background of H9 AIV strains used for analysis
2 结果 2.1 H9 AIV分离率

共检测样品3 074份，其中临床病料274份，活禽市场2 800份拭子。活禽市场样品来自140个组，来源于鸡的样品有98组，鸭、鹅、鸽子各14组。通过HA、HI试验分离鉴定出62株H9 AIV，分离率为2.02%。其中活禽市场分离到59株，临床病料样品分离到3株。鸡源H9 AIV个体分离率最高，达到1.66%，鸭源H9 AIV个体分离率为0.26%，鹅源H9 AIV个体分离率为0.07%，鸽源H9 AIV个体分离率最低，为0.03%。

2.2 HA基因遗传进化分析

在对62株阳性样品中单一感染性的25株H9 AIV通过RT-PCR扩增HA基因，测序并绘制进化树，发现它们均为h9.4.2.5谱系(图 1)，通过计算组间平均遗传距离，发现A组与B组的组间遗传距离为6.71%，所以将h9.4.2.5谱系进一步细分为A和B分支。

●. H9分离株; ■. H9参考株; ▲. H9 2010、2014年代表株 ●. H9 AIV isolate; ■. H9 AIV reference strain; ▲.H9 AIV strain isolated in 2010 and 2014 图 1 HA基因遗传进化树 Fig. 1 Phylogenetic tree of HA genes
2.3 HA基因氨基酸序列分析

25株分离株HA基因的裂解位点均为PSRSSR↓G，符合低致病性禽流感病毒的特征。其与Y280代表株PARSSR↓G的第二个氨基酸存在差异，由A全部变异为S。按照H9 AIV HA未去除信号肽的ORF氨基酸编码显示，HA基因受体结合位点(receptor binding site，RBS)的易变位点主要发生在198位，呈A(36%)/T(56%)/V(8%)形式。左侧臂232—237位为NGLMGR(100%)，与Y280、F98、G1株等代表株及2010年分离株TX和2014年疫苗株SN均不相同，右侧臂146—150位为GTSKA(52%)和GTSTA(48%)，出现GTSTA新的模式(表 2)。

表 2 H9亚型AIV分离株HA基因受体结合位点分析 Table 2 Analysis of HA gene receptor binding site of H9 subtype AIV isolates

分离株与Y280等代表毒株对比后发现，13个抗原位点(表 3)[14-16]只有147、207位非常保守，而168、197、201位最不保守，出现3~4种氨基酸的变化，剩下的145、153、164、166、196位则相对保守，仅有两种氨基酸的变化(表 4)，根据这两种氨基酸变化可将毒株分为两组(表 4)。

表 3 H9亚型AIV分离株HA基因抗原位点分析 Table 3 Analysis of antigenic site of HA gene of H9 subtype AIV isolates
表 4 分离株抗原位点突变百分比 Table 4 Percentage of isolates mutations at the antigenic site
2.4 交叉血凝抑制试验及R值计算

筛选的4株H9 AIV分离株W2393、J6354、W131210、YZ0505制备抗血清，与自身抗原的HI效价都可以达到8 log2，最高可达11 log2(表 5)。

表 5 H9 AIV分离株交叉血凝抑制试验 Table 5 Cross reactivity among H9 AIV isolates in HI

R值计算结果显示，W2393和W131210具有相似抗原性，J6354和YZ0505具有相似抗原性(表 6)，而两组之间抗原差异显著。其中W2393和W131210与早期疫苗株F98抗原差异较大，与2010年分离株TX和2014年疫苗株SN具有相似的抗原性。而J6354和YZ0505与早期和现在使用的疫苗株均有较大的抗原差异性。

表 6 H9 AIV分离株交叉血凝抑制试验R值 Table 6 R value among H9 AIV isolates in HI
3 讨论

自1994年从中国广东分离到鸡源H9 AIV以来[17]，H9 AIV已广泛分布在我国大部分地区。分析25个分离株的HA基因氨基酸位点，发现裂解位点由PARSSR↓G全部变为PSRSSR↓G，该位点的变化是否会引起毒力的改变，有待进一步研究。对病毒RBS进行分析，发现与Y280等代表株相比，变化最大的为左侧臂232—237位，全部变为NGLMGR(100%)，右侧臂146—150位出现50%的GTSTA的变化，在其198位呈现A(34.61%)/ V(7.69%)的变化，但是主要氨基酸还是与Y280代表株相同的T(57.69%)，同时该位点的变化会引起糖基化位点的丧失，导致H9 AIV对哺乳动物的感染出现变化[14]。有学者表示抗原位点92位的氨基酸由G突变为R是接种疫苗所致，而与本试验结果相比，氨基酸R仅达到64%，氨基酸K升至36%，没有出现氨基酸G，相比之前的研究结果[16]又发生了很大的变化，这种变化需要引起注意。分离株在234位由氨基酸Q变异为L，具有和哺乳动物受体结合能力[9]，同样需要我们关注。

对2017—2018年华东地区活禽市场、临床病料分离到的H9 AIV分离株绘制进化树，笔者发现这25株均属于h9.4.2.5谱系，且活禽市场样品和病料样品氨基酸序列相似性很高，最高可达99.8%，表明该谱系的病毒持续在华东地区养殖场和活禽交易市场的禽群中流行。进一步分析显示HA基因又可细分为A和B分支，说明可能存在抗原差异性。结合抗原位点分析以及交叉血凝抑制试验发现，从A和B分支分别选择的2个毒株，两个分支内部间具有相似的抗原性，分支间具有不同的抗原性，其中B分支的毒株与笔者分离到的2010年和2014年的代表株具有相似的抗原性。有学者认为由于抗原漂移以及免疫压力等的存在，现在的疫苗株与流行株之间存在较大的抗原差异[18]；也有学者认为分离株与疫苗株之间的抗原差异尚不显著[19]。我们的研究显示，由于使用疫苗株的复杂性和不适当的免疫，在养殖场或活禽市场持续存在一些早期的流行毒株，以及一些与常用疫苗株的抗原性存在显著差异的毒株。这种与常用疫苗株之间存在差异的毒株有可能成为下一个大流行的毒株[20]。

4 结论

H9 AIV在华东地区养殖场及活禽市场的家禽中持续存在，流行的H9 AIV属于h9.4.2.5谱系；HA基因裂解位点氨基酸为PSRSSR↓G，符合低致病性禽流感病毒的特征；至少存在两种不同的抗原型，需要更新疫苗株或研制多价疫苗来应对H9 AIV的感染和流行。

参考文献
[1] ALEXANDER D J. An overview of the epidemiology of avian influenza[J]. Vaccine, 2007, 25(30): 5637–5644. DOI: 10.1016/j.vaccine.2006.10.051
[2] SUN Y P, LIU J H. H9N2 influenza virus in China:a cause of concern[J]. Protein Cell, 2015, 6(1): 18–25.
[3] UMAR S, YOUNUS M, REHMAN M U, et al. Role of aflatoxin toxicity on transmissibility and pathogenicity of H9N2 avian influenza virus in turkeys[J]. Avian Pathol, 2015, 44(4): 305–310. DOI: 10.1080/03079457.2015.1046813
[4] KANG N, CHEN M, BI F Y, et al. First positive detection of H9 subtype of avian influenza virus nucleic acid in aerosol samples from live poultry markets in Guangxi, South of China[J]. Chin Med J, 2016, 129(11): 1371–1373. DOI: 10.4103/0366-6999.182824
[5] WANG M W, FU C X, ZHENG B J. Antibodies against H5 and H9 avian influenza among poultry workers in China[J]. N Engl J Med, 2009, 360(24): 2583–2584. DOI: 10.1056/NEJMc0900358
[6] GAO R B, CAO B, HU Y W, et al. Human infection with a novel avian-origin influenza A (H7N9) virus[J]. N Engl J Med, 2013, 368(20): 1888–1897. DOI: 10.1056/NEJMoa1304459
[7] LI K S, XU K M, PEIRIS J S M, et al. Characterization of H9 subtype influenza viruses from the ducks of southern China:a candidate for the next influenza pandemic in humans?[J]. J Virol, 2003, 77(12): 6988–6994. DOI: 10.1128/JVI.77.12.6988-6994.2003
[8] GUAN Y, SHORTRIDGE K F, KRAUSS S, et al. Molecular characterization of H9N2 influenza viruses:were they the donors of the "internal" genes of H5N1 viruses in Hong Kong?[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999, 96(16): 9363–9367. DOI: 10.1073/pnas.96.16.9363
[9] 孟芳, 徐怀英, 张伟, 等. 近20年中国部分地区鸡源H9N2亚型禽流感病毒HA基因遗传演化及其变异频率[J]. 微生物学报, 2016, 56(1): 35–43.
MENG F, XU H Y, ZHANG W, et al. Genetic evolution and substitution frequency of avian influenza virus HA gene in chicken H9N2 subtype in China in the last 20 years[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2016, 56(1): 35–43. (in Chinese)
[10] HOFFMANN E, STECH J, GUAN Y, et al. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses[J]. Arch Virol, 2001, 146(12): 2275–2289. DOI: 10.1007/s007050170002
[11] JIANG W M, LIU S, HOU G Y, et al. Chinese and global distribution of H9 subtype avian influenza viruses[J]. PLoS One, 2012, 7(12): e52671. DOI: 10.1371/journal.pone.0052671
[12] ARCHETTI I, HORSFALL F L. Persistent antigenic variation of influenza a viruses after incomplete neutralization in ovo with heterologous immune serum[J]. J Exp Med, 1950, 92(5): 441–462. DOI: 10.1084/jem.92.5.441
[13] LIU Y F, LAI H Z, LI L, et al. Endemic variation of H9N2 avian influenza virus in China[J]. Avian Dis, 2016, 60(4): 817–825. DOI: 10.1637/11452-061616-Reg
[14] KAVERIN N V, RUDNEVA I A, ILYUSHINA N A, et al. Structural differences among hemagglutinins of influenza A virus subtypes are reflected in their antigenic architecture:analysis of H9 escape mutants[J]. J Virol, 2004, 78(1): 240–249. DOI: 10.1128/JVI.78.1.240-249.2004
[15] WAN Z M, YE J Q, XU L L, et al. Antigenic mapping of the hemagglutinin of an H9N2 avian influenza virus reveals novel critical amino acid positions in antigenic sites[J]. J Virol, 2014, 88(7): 3898–3901. DOI: 10.1128/JVI.03440-13
[16] ZHU Y B, YANG D, REN Q, et al. Identification and characterization of a novel antigenic epitope in the hemagglutinin of the escape mutants of H9N2 avian influenza viruses[J]. Vet Microbiol, 2015, 178(1-2): 144–149. DOI: 10.1016/j.vetmic.2015.04.012
[17] 陈伯伦, 张泽纪, 陈伟斌. 禽流感研究:I.鸡A型禽流感病毒的分离与血清学初步鉴定[J]. 中国兽医杂志, 1994, 20(10): 3–5.
CHEN B L, ZHANG Z J, CHEN W B. Isolation and serological identification of chicken Avian influenza A virus[J]. Chinese Journal of Veterinary Medicine, 1994, 20(10): 3–5. (in Chinese)
[18] ZHANG Y, YIN Y B, BI Y H, et al. Molecular and antigenic characterization of H9N2 avian influenza virus isolates from chicken flocks between 1998 and 2007 in China[J]. Vet Microbiol, 2012, 156(3-4): 285–293. DOI: 10.1016/j.vetmic.2011.11.014
[19] 黄艳艳, 李悦, 张琳, 等. 6株H9N2亚型禽流感病毒的分子演化和抗原变异分析[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(10): 2205–2214.
HUANG Y Y, LI Y, ZHANG L, et al. Molecular and antigenic analyses of six H9N2-subtype avian influenza viruses isolated from broiler chicken farms of Shandong province in 2017[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2018, 49(10): 2205–2214. (in Chinese)
[20] XIA J, CUI J Q, HE X, et al. Genetic and antigenic evolution of H9N2 subtype avian influenza virus in domestic chickens in southwestern China, 2013-2016[J]. PLoS One, 2017, 12(2): e0171564. DOI: 10.1371/journal.pone.0171564