, MA Kaiqi, LIU Zhenghui, XIE Jinxin, SU Hong, WANG Dong, SUN Xue, GAO Jiaojiao, SU Zhanqiang
产志贺毒素大肠埃希菌(Shiga toxin-producing E. coli，STEC)是一类能产生志贺毒素，并引起人腹泻、出血性结肠炎以及溶血性尿毒综合征等疾病的食源性病原菌[1-2]。已知与人类食源性疾病相关的STEC血清型有200多种，其中以O157血清型为主[3]。近年来，由非O157 STEC感染的病例数量已有超过O157 STEC感染的趋势[4]。牛是STEC的天然宿主，也是STEC感染人类的主要来源[5]。虽然在人类感染STEC的治疗上不建议使用抗生素，但抗生素在养殖业上的应用，使STEC暴露于抗生素的选择压力之下从而产生了耐药性，甚至产生了多重耐药性[6]，这种同时具有毒力和耐药性的菌株，对人类健康构成更严重的威胁。
目前，临床上最广泛使用的抗菌药物为β-内酰胺类，自2002年以来，已在食品动物上分离到越来越多的产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的肠杆菌科细菌，在全球引起了极大关注[7]。细菌对β-内酰胺类产生耐药的重要机制是产生ESBLs，ESBLs主要由质粒和染色体介导，能够通过接合、转化和转导等转移方式在自然界中传播耐药性[8]。目前已发现400多种ESBLs型别，其基因型和基因亚型因国家或地区的不同而存在差异[9]。ESBLs编码的基因家族主要有窄谱的TEM型和广谱的CTX-M型[10]。产ESBLs菌株可在动物和人之间相互传播[11-13]，产ESBLs菌株的出现给兽医临床使用抗生素敲响警钟。随着新疆畜牧业的发展，有关新疆牛源STEC菌株的报道越来越多，而研究新疆牛源STEC菌株耐药性的报道罕见，因此本研究对2015—2017年新疆部分地区牛源STEC菌株的耐药性进行研究，为监测牛源STEC的耐药性提供数据支持，同时为临床合理用药提供参考。
1 材料与方法 1.1 菌株来源2015—2017年收集新疆博乐、伊犁、石河子、五家渠、昌吉及乌鲁木齐周边牛场肛拭子、新鲜粪便、料槽内饲料、水槽内饮水(地下水)和屠宰场胴体样品。肛拭子：用无菌棉签采集牛肛拭子，置于2 mL无菌营养肉汤；粪便：用无菌PE手套抓取新鲜牛粪中心，根据圈舍分组进行编号；饲料：每个牛场采集不同料槽内饲料，置于无菌自封袋；饮水：每个牛场采集不同水槽内饮水，置入无菌营养肉汤；胴体：取新鲜屠宰胴体拭子，置于2 mL无菌营养肉汤，低温运输并及时处理。样品共计1 459份，分离209株(非O157：H7)STEC(表 1)。
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表 1 本研究中牛源样本与STEC分离株情况 Table 1 Bovine origin samples and STEC isolates in this study |
TSB、MH肉汤、MH培养基购自青岛海博生物科技有限公司。18种药敏片：氨苄西林(AMP)、阿莫西林-克拉维酸(AMC)、头孢噻肟(CTX)、头孢他啶(CAZ)、头孢吡肟(FEP)、哌拉西林-他唑巴坦(TZP)、氨苄西林-舒巴坦(SAM)、庆大霉素(GEN)、氨曲南(ATM)、阿米卡星(AMI)、左氧氟沙星(LVX)、环丙沙星(CIP)、四环素(TET)、磺胺甲基异恶唑(SXT)、氯霉素(CHL)、哌拉西林(PIP)、多黏菌素B(PB)、链霉素(STR)购自杭州滨和微生物试剂有限责任公司。E. coli ATCC 25922保存于本实验室。E. coli J53(NaN3抗性)作为接合试验受体菌(由军事兽医研究所惠赠)。头孢噻肟、头孢他啶药粉购自中国药品生物制品检定所。引物由上海生工生物工程有限责任公司合成。
1.3 实验动物雌性昆明鼠(18±2)g，购自新疆医科大学实验动物中心，SCXK(新)2018-0001。
1.4 大肠杆菌系统进化发育分群根据Clermont等[14]的方法对STEC分离株进行多重PCR检测，扩增chuA、yjaA、TspE4.C2、arpA和trpA基因，根据文献方法判定分群结果。
1.5 STEC毒力基因及致病性检测PCR检测209株STEC的stx1、stx2、eae和hly毒力基因[15-16]。选择代表性菌株进行小鼠致病性试验。50只小鼠随机分成5组，每组10只，饲养观察2 d。挑取纯化的单菌落接种于无菌EC肉汤中培养12 h，进行活菌计数，以无菌EC肉汤稀释细菌，调整细菌浓度为107~1011 CFU·mL-1。第3天采用腹腔注射的方法用稀释后的菌液分别接种于5组小鼠，0.3 mL·只-1。攻毒后正常饲养，观察记录发病死亡情况，采用改良寇氏法计算LD50。
1.6 药敏试验采用K-B法对STEC进行18种抗生素的药敏试验，将菌株接种于MH肉汤中，37 ℃培养12 h，调整菌液至0.5麦氏浊度，用无菌棉签均匀涂布于MH平板上，将药敏片贴于MH表面，37 ℃培养约16 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径，参照CLSI标准判断结果[17]，并记录数据。
1.7 产ESBLs菌株确认采用双纸片扩散法确认产ESBLs菌株。将CAZ和/或CTX耐药的受试菌株均匀涂布于MH琼脂平板，分别进行CAZ、CAZ/CAL和CTX、CTX/CAL两组药敏纸片试验，37 ℃培养约16 h，当CAZ和CTX中有任何一个，在加CAL后，抑菌环直径与不加CAL的抑菌环相比，增大值≥5 mm时，判定为产ESBLs。
1.8 ESBLs菌株耐药基因检测采用PCR方法检测ESBLs基因型，包括blaCTX-M-1、blaCTX-M-2、blaCTX-M-9、blaTEM和blaSHV[18]，参照文献合成引物进行PCR检测，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，阳性产物由上海生工生物有限公司测序，并进行BLAST比对分析，确定其耐药基因亚型。
1.9 接合转移试验将携带ESBLs基因的STEC作为供体菌，E. coli J53作为受体菌，通过滤过膜接合法进行接合试验，通过CAZ 4 μg·mL-1或CTX 4 μg·mL-1与NaN3 200 μg·mL-1的双抗TSA平板筛选接合子，对接合子进行耐药表型和ESBLs确认，并进行耐药基因检测。
2 结果 2.1 STEC系统发育分群0.96%(2/209)的STEC属于系统发育D群，此群与病原菌相关。94.74%(198/209)和2.39%(5/209)分别属于系统发育A群和E群。0.48%(1/209)和1.44%(3/209)分配至系统发育B1群和F群。与毒力相关的2株菌均来自肛拭子。
2.2 STEC毒力基因及致病性209株STEC中携带stx1(210 bp)菌株占31.58%(66/209)，携带stx2(484 bp)菌株占27.27%(57/209)，携带hly(319 bp)菌株占48.33%(101/209)(图 1)，同时携带stx1和stx2菌株占41.15%(86/209)，同时携带stx1、stx2和hly菌株占23.44%(49/209)，未检测到eae基因(375 bp)。采用腹腔注射法将分离株W-R33(stx1+stx2，肛拭子)，107~1011 CFU·mL-1接种小鼠。48 h后开始出现死亡，107和108 CFU·mL-1组小鼠全部耐过，109和1010 CFU·mL-1组部分小鼠耐过，1011 CFU·mL-1组小鼠全部死亡，根据改良寇氏法计算出LD50为1.8×1010 CFU。
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M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1、2. stx1和stx2引物扩增；3、4. hly引物扩增；5.阴性对照 M. DL2000 DNA marker; 1 and 2 were amplified with stx1 and stx2 primes; 3 and 4 were amplified with hly primes; 5. Negative control 图 1 stx1、stx2和hly基因PCR扩增产物 Fig. 1 PCR products of stx1, stx2 and hly gene |
209株STEC中24株(11.48%)表现为耐药菌株。AMP耐药性在牛场STEC分离株中相对普遍。经鉴定，9株(4.31%)多重耐药菌对3~11种抗生素具有耐药性，共显示9个不同的抗生素耐药谱，在多重耐药菌株中，最常见的耐药模式为CHL+ STR+TET，占总分离株的2.4%，其中有4株(1.91%)产ESBLs。
2.4 β-内酰胺酶基因检测对B-R14、C-R30、W-R33和U-R32进行CTX-M、TEM和SHV基因检测，结果blaTEM和blaCTX-M群扩增出目的片段(图 2)，W-R33和U-R32为blaTEM阳性(861 bp)，测序2株均携带TEM-1型基因；B-R14、C-R30和U-R32为blaCTX-M阳性(593 bp)，U-R32同时携带blaTEM和blaCTX-M基因。4株菌呈blaCTX-M-1、blaCTX-M-2、blaCTX-M-9和blaSHV阴性。
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M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1、2. blaCTX-M引物扩增；3、4. blaTEM引物扩增；5.阴性对照 M. DL2000 DNA marker; 1 and 2 were amplified with blaCTX-M primes; 3 and 4 were amplified with blaTEM primes; 5. Negative control 图 2 blaCTX-M和blaTEM基因PCR扩增产物 Fig. 2 PCR blaCTX-M and blaTEM gene |
以4株产ESBLs分离株(NaN3敏感)作为供体菌，以E. coli J53作为受体菌进行接合试验，通过双抗平板筛选分别获得W-R33和U-R32的阳性接合子tW-R33和tU-R32，接合转移发生率为50%。
药敏检测显示，经接合转移W-R33将AMP+CTX+GEN+STR+SXT+TET耐药性转移至E. coli J53，CHL+CIP+LVX耐药性未发生转移；U-R32将AMP+CTX+GEN+ LVX+PB+PIP+ STR+SXT+TET耐药性转移至E. coli J53，CHL+ CIP耐药性未发生转移。
对tW-R33和tU-R32进行β-内酰胺酶基因的检测结果显示，W-R33将携带的blaTEM转移至E. coli J53；U-R32将携带的blaTEM和blaCTX-M均转移至E. coli J53。
3 讨论近年来，非O157血清群STEC感染人类的报道越来越多，引起人们的广泛关注[19]。人类感染STEC主要通过直接或间接食用了被牛粪污染的肉类、牛奶、蔬菜、水果和水而发病[20]，因此研究牛源STEC具有重要的公共卫生学意义。本研究在2015—2017年采集新疆部分地区牛源样品进行STEC分离鉴定，其中在肛拭子中STEC的分离率最高为19.7%(194/984)，低于日本(28.1%)和加拿大(49.2%)牛源STEC的分离率[21-22]。值得注意的是，分布于饲料和饮水中的STEC可能成为其在牛场的扩散源头。
通常情况下，属于系统发育B2群和D群的大肠杆菌更可能具有致病性，而A群和B1群为非致病共生菌[23]。Alizade等[24]研究表明，来自健康牛的STEC主要属于A群和B1群，Kennedy等[25]研究表明，来自牛场多数多重耐药STEC主要属于A群和B1群。本研究中分离株W-R33属于A群，携带stx1和stx2，多重耐药且产ESBLs，对小鼠致病性不强。这些发现提示多重耐药STEC很可能是由非致病性大肠杆菌获得毒性和耐药性基因而形成的，导致多重耐药STEC污染食品。从牛场饮水中仅分离出一株对AMC和AMP耐药的A群STEC，而多重耐药的STEC均分离自肛拭子。令人担忧的是，一株D群与毒力相关的STEC对头孢菌素类耐药，成为毒力和耐药性共选择的证据。本研究未在胴体上获得耐药的STEC是值得庆幸的，但采集胴体样本量有限。
笔者发现新疆牛源STEC对更新的、更具临床重要性的抗生素(如氟喹诺酮和头孢菌素)开始出现耐药性。革兰阴性菌产生β-内酰胺酶是对头孢菌素类耐药的主要机制[22]。本研究首次在我国新疆牛源STEC菌株中鉴定了blaTEM和blaCTX-M。Kennedy等[25]之前从牛场和屠宰场的STEC中鉴定了blaTEM。blaCTX-M引物可扩增的亚型包括CTX-M-1~30，TOHO-1~3，FEC-1，UOE-1和UOE-2[18]，blaCTX-M-1、blaCTX-M-2、blaCTX-M-9在人类和动物源产ESBLs菌株中较常见[13, 26]，而在本研究中并未确定这三个亚型中的任何一种，尚需进一步鉴定。牛源STEC携带的blaTEM和blaCTX-M可以通过接合的方式在细菌间扩散。
本研究中24株耐药的STEC有6株对多黏菌素耐药。由于针对多重耐药的革兰阴性菌缺乏新型抗生素，导致多黏菌素作为最后一道防线被重新启用[27]，细菌对黏菌素产生耐药性可能是细菌细胞外膜或外排泵/钾系统改变[27]。已鉴定MCR-1和MCR-2为质粒介导的多黏菌素耐药机制[28-29]。不是所有质粒都可以通过接合而发生转移[30]，在本研究中证实黏菌素的耐药性可发生接合转移，关于多黏菌素耐药性的数据需谨慎对待。
4 结论通过对新疆不同地区牛源STEC的药物敏感性试验，初步分析新疆牛源STEC的耐药规律，对临床用药具有一定参考。同时通过对STEC中ESBLs基因的检测，发现ESBLs基因在牛源STEC中开始流行，且以blaTEM和blaCTX-M基因为主要基因型。
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