黄芪甲苷(astragaloside,Ast)为中药黄芪的主要有效成分[1], 也是研究最多的特征性活性成分[2],2010年版中国药典将黄芪甲苷作为指标性成分评价黄芪药材及其制剂的质量[3]。研究表明,Ast具有多方面的药理作用,例如,对心脏的保护作用[4-7],清除氧自由基的作用[7],钙离子调控作用[7],减少炎症物质的产生[4, 8],对脑的保护作用[4-6],对肾、肝的保护作用[6, 8],对血管的影响[5-7, 9],抗病毒作用[10], 调节免疫的作用[11]等。Ast对心脑血管疾病具有一定的治疗作用,但其作用机制不明确,当前心脑血管疾病的发病率越来越高[12-13],Ast抗心脑血管疾病机制的研究日益凸显其重要性。
微血管舒缩活动是微血管产生的一种自主的,不受心跳和呼吸控制的自律性的收缩和舒张活动[14-16],与心脑血管疾病的发生密切相关[17-20]。研究表明,多种中药有效成分可提高微血管自律性舒缩活动的振幅[21],NO是一种重要的血管舒张因子[22-25],ET-1是一种强效的血管收缩因子[23-24], 细胞水平的研究表明这些中药有效成分能使微血管内皮细胞分泌NO和ET-1的量处于高位平衡状态[24, 26]。中药穴位导入对于疾病的治疗作用主要通过改变穴区微循环状态来实现,其对穴区微循环状态的改变主要体现在对微血管自律舒缩振幅的提高[27]。微血管内皮细胞功能正常是保障正常的微血管舒缩活动的基础[28],微血管舒缩活动的正常与否是判断微血管内皮功能正常与否的重要指标[12, 29-30]。微血管内皮的功能异常可导致微血管自律性舒缩活动的异常,进而导致各种心脑血管相关疾病的发生[18, 20-21, 23, 26, 31]。微血管舒缩活动的产生与调节具有内皮依赖性,其舒缩活动振幅由NO和ET-1共同调节[23-24, 26]。
本试验拟研究人合谷穴区导入Ast后穴区微血管自律舒缩活动振幅的变化以及Ast对大鼠心肌微血管内皮细胞NO和ET-1的影响,探讨Ast治疗心血管疾病的分子机制,为进一步研究其对心血管疾病的预防和治疗作用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料Ast购自上海融禾医药科技有限公司;NO ELISA检测试剂盒购自南京建成科技有限公司;ET-1 ELISA检测试剂盒购自美国Assay Designs公司;DMEM高糖培养基、优质胎牛血清(FBS)、D-Hank’s干粉胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶冻干粉购自美国Gibco公司;L-谷氨酰胺购自美国Sigma公司;细胞培养6孔板、玻底细胞培养皿购自美国CORNING公司;CD31因子兔抗鼠一抗、荧光(FITC)标记羊抗兔二抗购自北京博奥森生物技术有限公司;激光多普勒血流监测仪(主机型号PeriFlux5000,探头型号Probe481-1)、离子导入仪购自瑞典Perimed公司:M-MLV Reverse Transcriptase、TRIzol Reagent以及所有引物(9N Random Primer & PCR Primers)均购自美国Invitrogen公司;dNTP Mixture购自大连TaKaRa公司;Recombinant RNasin® RNase Inhibitor、RQ1 RNase-Free Dnase购自美国Promega公司;RNeasy Mini Kit购自德国QIAGEN公司;Power SYBR® Green PCR Master Mix、MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate、MicroAmp® Optical Adhesive Covers、7900 HT Fast Real-Time PCR system购自美国Applied Biosystems公司;CO2培养箱购自美国Thermo公司(371型);倒置荧光数码显微分析系统购自日本Olympus公司(TH4-200型);Mastercycler gradient购自德国Eppendorf公司;Peltier Thermal Cycler PTC-225购自美国MJ公司;Gel Imaging System CBC/UVP I-D001购自北京CapitalBio公司;Spectrophotometer ND-1000购自美国NanoDrop公司。
1.2 Ast对微血管自律运动振幅的影响选6名健康的在校大学生志愿者,男女各半,穴位定位前,受试者静坐20 min,定位时亦静坐,利用穴位定位仪在志愿者相应穴位的解剖学位置找到其手阳明大肠经上的合谷穴,并做好标记。用生理盐水溶解得到终浓度为3 mg·mL-1 Ast作为试验样品,生理盐水(NS)作为对照样品。使用激光多普勒系统进行导入药物和检测,将导药电极固定于合谷穴区,探头与皮肤贴合,启动系统分析软件,观察穴位区微血管舒缩活动图谱。调整探头的位置,待出现穴位区特有的微血管舒缩活动振幅时,记录穴位区微血管舒缩活动3 min,观察其振幅稳定并继续记录20 min,然后吸取200 μL黄芪甲苷注入药物导入电极的衬垫上,打开PF382b电源,设定导药时间为2 min,导药电流为0.16 mA,开始导药,导药结束后先记录3 min,待振幅稳定后继续记录20 min。从每位志愿者导药前20 min和导药后20 min的微血管舒缩活动振幅图像中每隔4 min选取一段数据分别各选择5段数据以避免选择性差异,计算其平均值[(PUmax-PUmin)÷5]来表示每位志愿者导药前后微血管舒缩活动振幅变化。
1.3 RMMECs的培养及鉴定7日龄SD大鼠,脱颈置死后用酒精对其体表进行消毒。用手术器械尽快取出心脏左心室壁浸泡于4 ℃ D-Hank’s液中。将左心室壁浸泡在75%酒精中15 s,用D-Hank’s洗3遍,撕去心内、外膜后再用D-Hank’s清洗一遍。将组织块置于37 ℃预热的0.5 mL血清中剪碎至1 mL枪头吹打无阻力,接种至培养板,37 ℃培养20 min,使组织块贴壁。贴壁后吸弃血清,加入预热的完全培养基(含20%胎牛血清、1%双抗、2%谷氨酰胺、77%DMEM),37 ℃、5%CO2培养箱中进行原代培养[32]。24 h后换液,将多余组织块清洗掉,以后原代细胞每隔2 d换液一次,待细胞生长至80%汇合状态时传代,并利用差速贴壁法避免成纤维细胞的干扰。第二次传代时将部分细胞培养在培养碟底部的坑内,待细胞贴壁生长20 h后进行鉴定。倒置显微镜观察细胞的形态;用兔抗大鼠CD31相关抗原一抗(对照不加一抗,加等量PBS)37 ℃孵育2 h,PBS冲洗3次,每次3 min;加FITC标记的二抗,37 ℃孵育45 min,PBS冲洗3次,每次3 min,荧光显微镜下观察并拍照。
1.4 Ast对RMMECs分泌NO和ET-1的影响将Ast加入培养好的RMMECs中,使其终浓度分别为5、10、25 μg·mL-1,空白组不加。分别在孵育3、6、9、12 h后收集细胞培养上清,利用ELISA检测试剂盒分别对上清中NO和ET-1含量进行检测。
RMMECs第二代生长至铺满培养板底部时,将细胞进行消化、离心、重悬、计数并稀释到所需密度(5×104·mL-1)。将调整好密度的细胞均匀接种至12孔培养板中,置于37 ℃、5%CO2培养箱中静置培养。试验组中分别加入Ast终浓度为5、10、25 μg·mL-1的含2%FBS的维持培养基中,并分别于培养3、6、9、12 h后收集细胞上清液于无菌离心管中,3 000 r·min-1离心10 min,然后将样品分装于新的无菌离心管中,于-20 ℃保存备用。按照试剂盒说明对细胞培养上清中的NO和ET-1进行检测。
1.5 Ast对RMMECs NO和ET-1 mRNA的影响试验组中加入Ast,使其终浓度为10 μg·mL-1,培养3 h后收集细胞,提取total RNA,利用分光光度计方法检测纯度,利用琼脂糖凝胶电泳方法检测其完整性。total RNA消化和纯化后进行逆转录,Real-Time PCR检测NO和ET-1 mRNA。引物见表 1。以gapdh为内参基因。Real-time PCR反应体系:2× SYBR Master Mix 5 μL, 10 μmol·L-1正、反向引物各0.4 μL,相应的cDNA 2 μL,加水补至10 μL。反应程序:95 ℃预变性;95 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40个循环。采集荧光信号,数据采用2-△△ Ct法进行分析。
经皮肤将中药成分Ast导入穴位区后,穴位区皮内微血管血流灌注量明显增大,导药后微血管舒缩活动振幅明显高于导药前(P<0.01)(图 1A 、B、E)。而导入生理盐水前后,穴区皮内微血管舒缩活动振幅无显著变化(图 1 C、D、E)。
在倒置显微镜下可见细胞贴壁生长,呈短梭形和扁平的多角形。48 h后细胞呈现典型的铺路石样,72 h后达到汇合状态。细胞在倒置显微镜下可见成铺路石样生长(图 2A),细胞膜和细胞质内的因子被FITC标记的抗体标记呈现清晰的绿色荧光,而细胞核因缺少CD31因子呈现暗色(图 2B)。由形态学和CD31免疫荧光鉴定表明所培养的细胞为RMMECs。
用低、中、高三个浓度的Ast作用于RMMECs时,发现三个浓度的Ast均能促进RMMECs对NO和ET-1的释放,与用生理盐水作用的对照组相比,差异显著(表 2、表 3)。低、中浓度Ast作用于内皮细胞3 h,可使NO的释放增加,差异极显著,之后随作用时间延长,NO的释放量呈下降趋势。高浓度Ast可极显著提高RMMECs对NO的释放,NO呈时间依赖性增长。低、中、高三个浓度的Ast均能促进RMMECs对ET-1的释放,并且其对ET-1的释放具有时间依赖性地增长作用。
NO与ET-1之间的动态平衡对维持RMMECs正常功能至关重要。试验发现三个浓度的Ast均可提高NO/ET-1的值(图 3),Ast作用3 h,NO/ET-1的值最高,随后具有时间依赖性的下降趋势(图 3)。高浓度Ast组,NO/ET-1值始终维持在较高水平(图 3)。作用3 h,中浓度Ast对NO和ET-1的促进作用最强,其NO/ET-1值最大。
qRT-PCR检测RMMECs中ET-1和NO的mRNA表达水平,结果(图 4)显示NO、ET-1的mRNA在10 μg·mL-1 Ast作用前后的RMMECs中均有表达。10 μg·mL-1 Ast与RMMECs孵育6 h,ET-1 mRNA水平上升至孵育前的(1.79±0.18)倍(P<0.05),NO mRNA水平显著升高至孵育前的(2.36± 0.23)倍(P<0.01)。说明Ast通过上调NO和ET-1 mRNA的表达来调节NO与ET-1在血液循环系统中的动态平衡保护微血管内皮细胞功能完整性。
已经有研究证明Ast具有保护内皮细胞,促进血管新生的作用,成为心血管疾病治疗药物研究的热点。本试验采用离子导入仪将中药成分Ast导入穴区皮下组织,并采用激光多普勒血流监测仪检测穴区皮下微血管网血流量的变化,该方法具有高敏感性、高安全性、低影响性。研究结果显示,穴区皮下导入Ast能够显著提高微血管自律性舒缩活动的振幅。正常情况下,微血管会发生自律性收缩和舒张活动,从而引起管径周期性地变化[13]。微血管自律性舒缩活动在组织血液分配中具有重要作用,其自律运动的减弱会导致微循环功能环紊乱[17],这将会大大增加机体发生心血管疾病的风险[17]。一些动物试验的研究发现,微血管网相邻血管的舒缩活动在很大程度上具有同步性,在肌性血管中也有相同的发现[16]。皮下微循环可以很好地反映机体其他器官组织部位(包括心肌)的微循环状态[17],因此笔者推测Ast对心脏病起到治疗作用可能是通过调节心肌微循环状态来实现的。
为了进一步研究Ast提高微血管舒缩活动振幅的机制,进行了体外试验,所使用的RMMECs通过组织块法获得,经过鉴定,用该方法分离提取出的RMMECs纯度较高,可直接用于试验。体外试验结果证明Ast对RMMECs分泌NO和ET-1具有显著的促进作用,并可提高NO/ET-1值。研究发现三个浓度的Ast均可提高NO/ET-1的值,Ast作用3 h,NO/ET-1的值最高,随后具有时间依赖性的下降趋势,但始终高于对照组。25 μg·mL-1 Ast组,NO/ET-1值始终维持在较高水平。作用3 h,10 μg·mL-1浓度Ast对NO和ET-1的促进作用最强,其NO/ET-1值最大。qRT-PCR结果显示10 μg·mL-1 Ast与RMMECs作用6 h时, NO与ET-1基因转录量均升高,差异显著(P<0.01),这与ELISA检测出NO和ET-1分泌表达水平升高的结果相一致。本研究所选取的药物浓度是参考临床动物试验常用的药物浓度以及血药浓度而选择,体外试验时所选取的药物作用时间是按照之后动物试验中每天给药2次的试验方案而确定,因此本研究中选取的Ast与RMMECs最长的作用时间为12 h,具有一定的合理性和参考性。本试验在药物浓度和作用时间的选择上还有一定的不足,在后期的试验中需要进一步完善和补充。
在众多血管活性因子中,NO和ET-1在调节血管活动中起到关键作用[24, 31],NO和ET-1是存在于血液循环中的重要的血管舒张因子和血管收缩因子,NO和ET-1对血管张力、血流和渗透性有调节作用[24]。因此Ast很可能是通过促进NO和ET-1的分泌,使其处于较高水平从而提高微血管自律运动的振幅。Ast促进NO和ET-1的分泌并使两者处于高位平衡状态,提高微血管舒缩振幅,可能是其治疗心血管疾病的重要机制,为临床治疗心脏病以及其他疾病时根据病情选择不同用药剂量提供了一定参考。
4 结论中药成分Ast能提高微血管舒缩振幅,对RMMECs分泌NO和ET-1具有显著的促进作用,并可提高NO/ET-1值,其提高微血管舒缩振幅的机制可能是通过调节RMMECs释放NO和ET-1在循环系统中的动态平衡实现的。
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