2. 贵州大学动物疫病研究所, 贵阳 550025
2. Institute of Animal Diseases, Guizhou University, Guiyang 550025, China
沙门菌(Salmonella)是一种常见的重要病原菌,自然界中沙门菌的宿主存在广泛,人类、多种动物以及多种植物都会受到它的侵害[1]。更为重要的是,可以引起广泛的食源性污染的疾病流行[2]。小RNA(small RNAs,sRNA)是一类存在于所有生物体内的重要调控因子,参与调节多种生命活动。在细菌中,小RNA参与调节细胞对环境变化的适应,包括调节细胞膜的蛋白质组成[3],生物膜形成[4],氮化合物的代谢[5],糖代谢[6],染色体外DNA元件的调节[7],转录和RNA降解的控制[8],及在感染期间细菌毒力的调节和宿主生物的相互作用等[9-10]。因此,阐明小RNA对基因调控的机制有利于人们应对沙门菌的威胁,保证人类和动物的健康。
研究发现,RNA-targeting sRNAs的调控方式可以分为两类,包括顺式编码调控小RNA (cis-encoded sRNAs)和反式编码调控小RNA (trans-encoded sRNAs)。反式编码调控的小RNA数量较多,并且多为对细菌染色体基因的调控,大部分可以调节多个靶mRNA的表达[11],因此研究较为深入。在沙门菌中,gcvB是长度为200个核苷酸反式编码调控多靶基因的sRNA,在富含培养基的对数生长细胞中小RNA gcvB非常丰富,可能调节鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌中所有mRNA的1%~2%[12-13],抑制一些氨基酸生物合成基因的表达[14]。这些基因编码的蛋白多属于氨基酸、寡肽和二肽的转运蛋白[15]。其中在小RNA gcvB调控的蛋白中有一类ABC转移蛋白家族,如Dpp和Opp蛋白等[3],ABC转移蛋白存在于所有生物中,是一类最重要的、最大的也是最古老的膜转运系统,对细菌的生存、毒力以及致病性有重要的影响。GcvB还可能参与酸胁迫应答[16]和诱变断裂修复[17],通过激活大肠杆菌中RpoS介导的一般应激反应,这表明GcvB功能可能不仅局限于氨基酸代谢。可见目前对小RNA gcvB的研究还不够深入,发掘小RNA gcvB调控的靶基因以及调控机制尤为重要。但由于生物中基因的数量众多,小RNA靶基因的筛选一直是一个难点。目前高通量RNA-Seq转录组分析技术逐渐成熟,已经应用于细菌小RNA的靶基因预测及其功能的相关分析中[18]。本研究通过RNA-Seq检测培养至对数期的野生型沙门菌LT2菌株和敲除sRNA gcvB的沙门菌LT2菌株的总mRNA,发现一系列的差异信号,并在此基础上进行生物信息学分析和统计学分析,同时运用荧光定量PCR方法对差异表达基因进行验证。为筛选出小RNA gcvB调控的靶基因和进一步分析小RNA gcvB的调控机制提供基础资料。
1 材料与方法 1.1 主要试验材料野生型鼠伤寒沙门菌LT2菌株(命名为3409)和小RNA gcvB基因敲除株(命名为ΔGcvB,基因型:ΔGcvB::cat)由法国国家科学研究中心(CNRS)分子遗传学Bossi实验室惠赠。细菌DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司;反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser,荧光定量PCR试剂盒SYBR® Premix Ex Taq Ⅱ等,购自TaKaRa公司;其他试剂均为分析纯。
1.2 沙门菌gcvB缺失株的鉴定根据GenBank登录的鼠伤寒沙门菌LT2菌株序列,利用Primer 5.0软件设计引物(表 1)。按照DNA提取试剂盒说明书提取3409和ΔGcvB菌株的DNA,以提取基因组DNA为模板,建立25 μL PCR反应体系,体系包括2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL;DNA模板4.0 μL;上、下游引物各1.0 μL;灭菌双蒸水6.5 μL。按照以下反应参数进行PCR反应:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,5个循环;95 ℃ 10 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 1.5 min,5个循环;95 ℃ 10 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 1.5 min,15个循环;72 ℃ 8 min;4 ℃保存。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测,观察结果并将PCR产物送上海生工生物技术有限公司进行测序。
取活化菌液0.1 mL接种于100 mL普通液体培养基中,置于37 ℃恒温摇床、200 r·min-1振荡培养。开始每隔1 h无菌取样,在波长600 nm处测定光密度值。当测出的OD600 nm值有明显上升后每隔0.5 h无菌取样,连续监测16 h,每个时间点重复测3次,取平均值。采用Excel2010软件,以OD600 nm值为纵坐标,培养时间为横坐标,绘制细菌生长曲线。
1.4 样本采集取过夜培养的对照组和试验组细菌于LB液体培养基中培养至对数期,分别吸取菌液10 mL于离心管,3 500 r·min-1离心10 min后弃上清,将沉淀悬浮并转移至2.0 mL冻存管中放入液氮速冻,每个样本做3个重复,干冰运输。
1.5 RNA提取与检测由深圳华大基因高通量测序实验室对样品进行RNA提取,用QubitFluorometer、Agilent 2100、NanoDrop和酶标仪对RNA测序样品的浓度进行检测,用NanoDrop对样品的OD260 nm/OD280 nm和OD260 nm/OD230 nm进行检测,使用Agilent 2100对28S/18S或23S/16S、RIN值进行检测。
1.6 文库构建与测序对样品的总RNA进行提取,去核糖体RNA(rRNA)后经片段化处理,合成双链cDNA,对cDNA末端修复、加A尾并连接测序接头。将连接产物纯化、扩增后得到最终的cDNA文库,将构建好的测序文库使用HiSeq测序平台测序。
1.7 差异表达基因筛选与分析用DESeq2算法进行差异表达基因检测,用Love等[19]的方法对估算的基因表达量进行差异显著性检验,然后对计算得到的P-value通过Bonferroni[20]进行校正。GO(Gene Ontology)是基于基因本位数据库,以corrected P-value≤0.05为阈值筛选差异基因的富集GO term,KEGG[21](Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是有关通路的主要公共数据库,把Q value≤0.05的通路定义为在显著差异表达基因中显著富集的通路。
1.8 差异表达基因荧光定量PCR验证选择Top10上、下调差异表达基因中的10个基因,上调基因:STM1131、sicA、pduD、pduC、prgK,下调基因:nirB、narG、napF、napD、STM2344。根据GenBank上该基因及内参基因序列,利用Primer5.0软件设计引物(表 2)。提取3409及ΔGcvB菌株的总RNA样本,反转录为cDNA后进行荧光定量PCR反应,反应体系为SYBR® Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)5.0 μL、上下游引物各0.3 μL、cDNA 2.0 μL、ddH2O 2.4 μL;扩增条件为95 ℃预变性30 s后,进入95 ℃变性5 s和60 ℃退火30 s的39个循环,每个样本设3个重复,采用2-ΔΔCt法计算相关基因mRNA的转录水平。
对3409和ΔGcvB进行PCR鉴定及测序分析(图 1)。由图 1可知,3409和ΔGcvB分别扩增出大小约为1 025、1 721 bp的特异性条带。将两株细菌的测序结果进行比对(图 2),由图 2可知,gcvB基因序列已被cat基因序列成功替换。
运用分光光度计法测细菌生长曲线(图 3),如图 3所示,3409在6 h时进入对数期,ΔGcvB在3 h时进入对数期,两株菌株在12 h时进入平台期,可见在敲除小RNA gcvB条件下细菌的生长代谢受到影响。
通过对对照组和试验组样品的浓度、OD260 nm/OD280 nm、OD260 nm/OD230 nm、RNA质量完整性指标(RIN)进行检测(表 3),由表 3可知,指标均满足建库测序的要求,且稳定性较好,可以进行后续测序工作。
通过对对照组与试验组的样品进行total raw reads、total clean reads、total raw data、total clean data、GC含量、clean reads ratio检测(表 4)。由表 4可知,经过质控后total clean reads数量大部分在1 200万条以上,样品的过滤数据比例均超过97%,GC含量在50%以上,表明过滤后的reads质量情况良好。
采用DESeq2方法将对照组与试验组的测序数据进行对比分析,结果显示,共筛选出差异表达基因1 244个,其中上调基因678个,上调显著的前十个基因为STM1132、pduD、STM1131、prgJ、pduE、pudB、sicA、prgK、spaP、pduC,以编码唾液酸转运蛋白(sialic acid transporter)的STM1132基因表达量变化最为显著;下调基因566个,下调显著的前十个基因为narK、narG、nirB、napD、napF、napA、napG、lldD、uhpT、STM2344,以编码硝酸盐转运蛋白(nitrate transporter)的narK基因表达量变化最为显著(表 5),表明与小RNA gcvB相关的基因大多参与了菌体内氨基酸及相关盐类物质的转运。
将差异表达基因与GO数据库对比,得到显著差异表达基因的GO功能分类图(图 4),由图 4可知,试验组在细胞过程(cellular progress)、细胞(cell)、催化活性(catalytic activity)相关差异表达基因较多,分别达598、444和494个。在细胞组分分类中,BP、CC和MF 3类涉及细胞呼吸、钴胺素代谢过程(cobalamin metabolic process)和钴胺素生物合成过程;细菌鞭毛的细胞成分;氧化还原活性、铁离子结合、运动活性等差异显著。将差异表达基因通过KEGG数据库进行pathway富集通路注释,显著差异表达基因富集到鞭毛装配(flagellar assembly)、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)、卟啉和叶绿素代谢(porphyrin and chlorophyll metabolism)、酪氨酸代谢(tyrosine metabolism)、糖酵解/糖异生(glycolysis/gluconeogenesis)、磷酸转移酶系统(phosphotransferase system,PTS)等14个通路。在小RNA gcvB敲除条件下,差异表达上调的基因主要富集在双组分系统、不同环境中的微生物代谢、碳代谢(carbon metabolism)等通路中;差异表达下调的基因主要富集在卟啉和叶绿素代谢、不同环境中的微生物代谢、鞭毛装配等通路中(图 5)。小RNA gcvB敲除后差异表达基因在GO富集分析中与鞭毛的成分相关,在KEGG富集分析中又参与了鞭毛的装配,表明KEGG富集与GO富集有一定的相关性。显著富集的14个通路中差异表达基因主要参与氨基酸等物质的代谢,这与前人研究的小RNA gcvB的靶基因与氨基酸的代谢相关相符。
分别选取前10位中5个差异表达上调和下调基因,上调基因STM1131、sicA、pduD、pduC、prgK,下调基因nirB、narG、napF、napD、STM2344,以GAPDH为内参基因,利用荧光定量PCR方法对总RNA提取样本进行扩增(图 6、图 7),由图 6、图 7可知10个差异表达基因的相对表达量与RNA-seq技术测序结果基本一致。
目前,在小RNA调控研究中,沙门菌作为最重要的模型生物,还未见针对某个具体小RNA靶基因高通量的筛选研究,本试验选取前期研究比较充分的小RNA gcvB作为研究对象,将其调控的基因数量由已知28个扩增成可能的1 244个;更为重要的是,在前期的研究中,小RNA gcvB作用方式被认为是以负调节(trans-encoded)方式为主,可以抑制其靶基因的表达[22],而在这次转录组研究结果中显示,敲除GcvB背景下,有566个基因的表达显示下调,说明在沙门菌中,GcvB对某些靶基因的表达有促进作用,其调控机制值得进一步的深入研究。前期的研究表明,GcvB调控的30多个靶基因多与氨基酸的转运有关,例如,其靶基因oppA和dppA编码的蛋白质属于ABC(ATP binding cassette)转运蛋白家族的一员,但本次转录组研究结果显示,筛选出的可疑靶基因主要富集在钴胺素代谢过程、钴胺素生物合成过程、细胞呼吸、乙醇胺、伯氨基化合物代谢等过程,表明小RNA gcvB的靶基因可能通过参与钴胺素代谢和合成来活化氨基酸,合成的钴胺素在有氧条件下可以降解乙醇胺[23],同时参与了乙醇胺的代谢过程和细胞呼吸等。除此之外,鞭毛装配、氧化磷酸化、细菌趋化性、卟啉和叶绿素代谢、丙酸酯代谢、糖酵解/糖异生、磷酸转移酶系统(PTS)等14个通路中都有可能受gcvB调控的基因存在。此研究结果极大地扩充了小RNA的调控理论。
本研究在高通量转录组测序研究的基础上,又进一步筛选5个上调基因和5个下调基因,运用荧光定量PCR方法对差异表达基因进行验证,其中STM1131、sicA、pduD、pduC和prgK基因表达上调,nirB、narG、napF、napD和STM2344基因表达下调,结果显示10个验证基因的上下调趋势都符合RNA-seq测序结果,但与RNA-seq测序数据中差异倍数不完全符合,这可能与验证方法不同以及仪器的灵敏度差异有关。在验证的基因中参与丙酸代谢的有pduC和pduD基因,而这两个基因可以差异化的靶向细菌微室(bacterial microcompartments,BMC)的内部,将结构定位到细胞内的特定区域[24],并且在蛋白质微室(protein micro chamber,MCP)中pduC和pduD基因编码的蛋白质是B12依赖性1,2丙二醇利用的MCP(pdu MCP)重要组成部分[25],在固定丙醛,保护细胞在1,2丙二醇分解代谢过程中免受细胞毒性和DNA损伤几个方面有重要作用[26]。而nirB和narG基因参与氮代谢,其中nirB基因又是RNA聚合酶识别位点,作为一种基因启动子参与转录调控[27],常用于构建蛋白高表达量的表达载体,在重组细菌活疫苗研究中被广泛运用[28-29]。narG基因编码硝酸盐还原酶α亚基,催化反硝化作用[30]。STM2344基因参与不同环境中微生物代谢。PrgK是鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统的内膜组分[31],参与物质的运输。在编码硝酸还原酶的nap操纵子包含7个基因,包括基因napF,其编码具有不确定的亚细胞位置和功能的推定的细胞质铁-硫蛋白[32]。在大肠杆菌中napD是双精氨酸转运(Tat)系统信号肽结合伴侣参与Tat依赖性硝酸还原酶napA的生物合成,napD与napA双精氨酸信号肽紧密且特异性结合并抑制信号肽易位活性,从而延迟通过Tat途径的转运[33]。在人和动物病原体鼠伤寒沙门菌中,编码分泌的效应分子Sip/Ssp ABCD、SigD等基因的表达需要AraC/XylS样调节因子InvF和分泌伴侣SicA、InvF和SicA相互作用以激活效应基因启动子的转录[34]。表明小RNA gcvB有可能不仅是靶向调控氨基酸的转运,而可能通过调控靶基因在沙门菌物质代谢各个途径中发挥很重要作用,并且在敲除小RNA gcvB后沙门菌发生了很复杂的生理学变化。但这些基因是否是小RNA gcvB的靶基因,小RNA gcvB如何调控基因的表达和与靶基因结合区域以及小RNA gcvB对沙门菌物质代谢作用机制等仍需进一步验证。
本研究分析了沙门菌敲除小RNA gcvB后菌体转录组的情况,对部分差异表达基因进行了验证,为探究小RNA gcvB与靶基因互作及挖掘关键基因提供丰富的基础信息,为更深入了解小RNA gcvB的作用机制及沙门菌的防控工作奠定了坚实的基础。
4 结论野生型沙门菌和敲除小RNA gcvB沙门菌的差异表达基因共1 244个,其中基因表达上调678个,基因表达下调566个。差异表达基因主要涉及氧化还原活性、铁离子结合、运动活性等分子功能,细菌鞭毛的细胞成分,细胞呼吸、钴胺素代谢过程和钴胺素生物合成过程等生物过程。差异表达基因主要参与细菌趋化性、卟啉和叶绿素代谢、不同环境中的微生物代谢、双组分系统、甲烷代谢等14个信号通路。对部分差异表达基因进行了验证,差异表达基因相对表达量与RNA-seq测序结果基本一致。
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