2. 中国农业大学动物医学院, 农业部动物流行病学重点实验室, 北京 100193
2. Key Laboratory of Animal Epidemiology of the Ministry of Agriculture, College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China
住肉孢子虫是绵羊体内一种常见寄生原虫，以绵羊为中间宿主的住肉孢子虫有四种：S. gigantean、S. tenella、S. arieticanis和S. medusiformis[1]，我国以巨型住肉孢子虫(S. gigantean)、柔嫩住肉孢子虫(S. tenella)和S. arieticanis最为常见[2]。巨型住肉孢子虫在终末宿主猫体内进行有性生殖，产生的孢子化卵囊或孢子囊随猫粪排到外界环境中，中间宿主羊通过食入了被孢子化卵囊或孢子囊污染的饲料或水而感染[3]。巨型住肉孢子虫的最后一代裂殖子进入羊横纹肌内可形成长达1 cm的椭圆形白色包囊，主要见于食道肌、喉肌和舌肌，在膈膜和胴体上也有发现[4]。巨型住肉孢子虫病一般为慢性感染且临床症状不明显[5]。但是在横纹肌内形成的巨大包囊严重影响肉品外观及肉质，包囊破裂后导致周围组织的炎症反应，引起肌肉变色变性，造成商品羊肉大量废弃，给畜牧业带来巨大经济损失[6]。因此，准确地诊断住肉孢子虫感染可及早对家畜进行治疗或淘汰，也对早期预防及控制住肉孢子虫病具有重要意义。
目前已建立的血清学诊断方法主要有间接血凝试验(IHA)[7]、酶联免疫吸附试验(ELISA)[8]、斑点ELISA试验(dot-ELISA)[8]、间接免疫荧光试验(IFA)[8]和补体结合试验(CFT)[9]等，然而这些方法大多应用全虫抗原(包囊或纯化后的缓殖子)作为诊断抗原，与弓形虫、新孢子虫等顶复亚门原虫具有明显交叉反应，影响结果准确性。此外，制备抗原需要大量的包囊，取材困难、成本较高、操作复杂。对于住肉孢子虫病的诊断还有很多限制因素[10]，因此，筛选出敏感性好、特异性高的抗原是建立血清学诊断方法的关键。本研究通过免疫印迹及质谱分析，筛选出巨型住肉孢子虫反应原性良好的蛋白作为候选诊断抗原，对该蛋白的基因进行克隆和蛋白表达，通过生物信息学分析和免疫印迹方法评价该重组蛋白的诊断价值，为建立高特异性、高敏感性的血清学诊断方法提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料住肉孢子虫包囊分离自中国农业大学试验动物羊食道肌，住肉孢子虫阴、阳性血清由河南农业大学牧医工程学院杨玉荣副教授惠赠。弓形虫和新孢子虫阳性血清由国家动物寄生原虫实验室制备并保存。Donkey anti-goat IgG HRP购自北京博奥龙免疫技术有限公司，Goat anti-mouse IgG HRP、Goat anti-rabbit IgG HRP购自北京艾德莱生物科技有限公司。
全血组织细胞基因组DNA快速提取试剂盒购自北京艾德莱生物技术公司；反转录试剂盒(EasyScript One-step gDNA Removal and cDNA synthesis Supermix)、免疫印迹及PCR相关试剂购自北京全式金生物技术有限公司。染色体步移试剂盒(Genome Walking Kit)购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.2 方法 1.2.1 巨型住肉孢子虫的分子生物学鉴定基因组DNA快速提取试剂盒提取住肉孢子虫基因组DNA，Trizol法提取总RNA，并用反转录试剂盒转录为cDNA。以住肉孢子虫基因组DNA为模板，根据已有文献报道使用18S rRNA的保守性引物(18s48F、18s359R；18s58F、18s348R)[11]及线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ基因(cox1)的保守性引物(SF1、CoxS1R；SR8D、SR5)[12]，进行PCR扩增，送至北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序，鉴定虫种。
1.2.2 巨型住肉孢子虫可溶性抗原的制备[13]包囊可溶性抗原的制备:将包囊在-80 ℃冷冻6 h后，加液氮于玻璃匀浆器内研碎，按1:3比例加PBS稀释制成匀浆，-20 ℃反复冻融三次，超裂三次。4 ℃冷浸3 d后15 000 r·min-1离心30 min，上清即为包囊的可溶性抗原。浓缩后-20 ℃保存。
缓殖子和包囊液抗原的制备：剪碎包囊，加适量0.15 mol·L-1 PBS(pH 7.2)过滤。滤液1 500 r·min-1离心15 min，上清为包囊液抗原，沉淀为缓殖子。收集缓殖子-20 ℃反复冻融三次，超裂5 min。加入10倍的PBS 4 ℃冷浸3 d后15 000 r·min-1离心30 min，上清即为缓殖子的可溶性抗原。浓缩后-20 ℃保存。
1.2.3 优势抗原的筛选蛋白免疫印迹分析：将制备的可溶性抗原样品进行SDS-PAGE凝胶电泳后，电转移到PVDF膜上，以羊住肉孢子虫阳性血清(1:100)为一抗，以Donkey anti-goat IgG HRP(1:10 000)为二抗，超敏发光显色液显色，暗室曝光。
质谱分析：根据Western blot结果，选择反应区域，将SDS-PAGE蛋白胶中相应条带切下，送至北京华大蛋白质研发中心有限公司质谱分析。
1.2.4 目的基因的扩增由于目前尚无巨型住肉孢子虫完整基因数据库，本研究以S. dasypi Enolase2基因(NCBI基因登陆号：AY874059.1)序列为参考，设计引物SdENO-F：5′-GGAGGAATTGGACGGCACGAA-3′、SdENO-R：5′-CCTGCCAGGGTAGCGATGTAT-3′；以神经住肉孢子虫(S. neurona) Enolase基因(ToxoDB基因登陆号：SN3_00500190)序列为参考，设计引物SnENO-F1：5′-CTTATGGTGGAGGAGCTGGACG-3′、SnENO-R1：5′-GCTTACCCGCAAGTGTGGCAAT-3′、SnENO-F2：5′-ACGGTGGAGGTGGATTTGCTGA-3′、SnENO-R2：5′-CATTGAGGGGGATGCCTGAA-3′。进行PCR扩增，反应体系：DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，2×Taq酶25 μL，DDH2O补足至50 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸10 min。PCR产物经核酸胶电泳后，将大小正确的条带切胶测序。测序结果在NCBI数据库和ToxoDB数据库中进行比对。
染色体步移扩增已知序列两侧翼的未知序列：根据上一步骤测序及分析结果，获得目的基因部分序列，进行拼接，根据获得的序列，分别在其正向(5′→3′)和反向(3′ →5′)设计三条同向的特异性引物，正向引物为SgENO-SP1(正)：5′-GTTCTGAAACCTACCACCACCTGA-3′、SgENO-SP2(正)：5′-TACGGACTGGACGCCACTAATGT-3′、SgENO-SP3(正)：5′-TCAGGACGCCTTCTCAGATTTTG-3′；反向引物为SgENO-SP1(反)：5′-CACCATCTTGTCAGTTGGCTTACC-3′、SgENO-SP2(反)：5′-ACGCCATAGAAACACCCAGAATCG-3′、SgENO-SP3(反)：5′-TGCCTGGTCACAAGGGTCTTTTCC-3′。按照Genome Walking Kit说明书进行扩增。
1.2.5 生物信息学分析使用DNASTAR软件中的MegAlign程序对该序列进行分析，比较住肉孢子虫烯醇酶与弓形虫和新孢子虫等其他顶复亚门烯醇酶的相似性(表 1)。
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表 1 几种烯醇酶的序列信息 Table 1 Sequence information of several enolase |
以cDNA为模板，根据扩增出的片段设计特异性引物，在引物的两端引入pET28a(+)载体的同源臂(下划线标记)。F：5′-AGCAAATGGGTCGCGGATCCAAATATTTGGG-GAAAGGAGTGC-3′，R：5′-TCGAGTGCGGCCGCAAGCTTCAAGAAGGCAAGCCTCGATGGC-3′。扩增产物经核酸凝胶纯化回收后，以单片段连接方式连接到pET-28a载体骨架中，将原核表达载体pET-28a-SgENO转化至表达菌Transetta感受态细胞中，IPTG(0.8 mol·L-1)诱导重组蛋白表达，分离上清和包涵体，包涵体复性，最后以Ni2+亲和层析的方法进行蛋白纯化。SDS-PAGE电泳分析纯化蛋白大小。
重组蛋白的鉴定：以His单抗(1:500)为一抗，Goat anti-mouse IgG HRP(1:5 000)为二抗进行免疫印迹分析。同时，分别以羊住肉孢子虫阳性血清(1:100)、鼠/兔源弓形虫阳性血清(1:500)、兔源新孢子虫阳性血清(1:500)为一抗；以Donkey anti-goat IgG HRP(1:10 000)、Goat anti-rabbit IgG HRP(1:10 000)、Goat anti-mouse IgG HRP(1:5 000)为二抗进行免疫印迹试验，分析重组蛋白的反应原性及抗原特异性。
2 结果 2.1 巨型住肉孢子虫的鉴定从羊食道肌分离得到住肉孢子虫白色米粒状包囊(图 1 A)及从包囊中分离出的呈月牙形的缓殖子(图 1 B )，经PCR鉴定(图 1 C)，泳道2、4、5扩增到的18S rRNA、cox1(引物为SF1、CoxS1R)和cox1(引物为SF1、SR8D)基因在NCBI数据库中比对，发现与巨型住肉孢子虫(S. gigantea)符合率均为100%，确定该虫为巨型住肉孢子虫。
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A.羊食道肌肉内的住肉孢子虫组织包囊；B.住肉孢子虫缓殖子；C.住肉孢子虫种的PCR鉴定(M. DL5000 DNA相对分子质量标准；1.引物为18s48F、18s359R；2.引物为18s58F、18s348R；3.引物为SF1、SR5；4.引物为SF1、CoxS1R；5.引物为SF1、SR8D) A. Tissue cysts of S. gigantea in esophageal muscle of sheep; B. Bradyzoites of S. gigantea; C. Identification of Sarcocystis.spp by PCR (M. DL5000 DNA marker; 1. The primers are 18s48F and 18s359R; 2. The primers are 18s58F and 18s348R; 3. The primers are SF1 and SR5; 4. The primers are SF1 and CoxS1R; 5. The primers are SF1 and SR8D) 图 1 住肉孢子虫的形态学及分子生物学鉴定 Fig. 1 Morphological and molecular biological identification of Sarcocystis |
免疫印迹分析表明，可溶性抗原能与阳性血清在60及35 ku(图 2 B)左右处产生明显印迹，说明这两种蛋白能有效识别住肉孢子虫血清抗体，具有很好的反应原性，其中能与阳性血清反应的相对分子质量为35 ku的蛋白主要存在于包囊液中，推测该蛋白很有可能是巨型住肉孢子虫的分泌蛋白。
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M.蛋白质相对分子质量标准；1.包囊可溶性抗原；2.包囊液抗原；3.缓殖子全虫抗原 M. Protein marker; 1. Soluble antigen of cyst; 2. Cyst fluid antigen; 3. Bradyzoite antigen 图 2 全虫可溶性抗原SDS-PAGE(A)及免疫印迹结果(B) Fig. 2 SDS-PAGE (A) and Western blot (B) of soluble antigen in whole parasite |
将图 2泳道2相对分子质量为35 ku的蛋白条带切胶后送质谱分析，将得到的多肽序列通过NCBI数据库BLAST，得到的结果为S. dasypi 烯醇酶(enolase)，因此将该蛋白命名为巨型住肉孢子虫烯醇酶(SgENO)，并将其作为候选诊断抗原进行后续试验。
2.4 SgENO基因的克隆PCR扩增后电泳显示，四条泳道均有明显条带，条带测序结果经对比分析发现与SnENO基因序列相似性极高(85%~91%)，并可拼接成867 bp基因序列。染色体步移结果显示，使用随机引物AP2可扩增得到5′侧翼和3′侧翼的基因序列。对测序结果进行拼接，在此基础上重新设计特异性引物进行扩增，经过测序比对及分析，最终获得巨型住肉孢子虫烯醇酶大小为1 181 bp的基因序列。
2.5 重组蛋白的表达、纯化及鉴定PCR扩增得到SgENO基因大小为946 bp的片段(图 3 A)与pET-28a(+)骨架进行单片段连接，成功构建了原核表达载体pET-28a-SgENO；重组蛋白rSgENO主要在包涵体中表达，大小约为40 ku(图 3 B)，与预测大小(42 ku)相符。Western blot结果表明，rSgENO与Anti-his单抗在40 ku的位置上出现了明显的免疫印迹条带(图 3 C)，表明该重组蛋白为带有6×His标签的SgENO融合蛋白。
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A. SgENO基因的PCR扩增(M. DL5000 DNA marker；1. SgENO基因PCR扩增产物；2.阴性对照)；B. rSgENO的表达及纯化(M.蛋白质marker；1.未诱导；2.诱导；3.上清液；4.包涵体；5.纯化后蛋白)；C. rSgENO的Western blot鉴定 A. PCR amplification of SgENO gene (M. DL5000 DNA marker; 1. PCR amplification products of SgENO gene; 2. Negative control); B. Expression and purification of rSgENO (M. Protein marker; 1. Not induced protein; 2. Induced protein; 3. Supernatant; 4. Inclusion body; 5. Purified protein); C. Western blot identification of rSgENO 图 3 rSgENO的表达及鉴定 Fig. 3 Expression and identification of rSgENO |
通过对蛋白序列相似性及差异性分析发现，本研究获得的巨型住肉孢子虫烯醇酶蛋白序列与ToxoDB数据库中的神经住肉孢子虫两种烯醇酶SnENO(1)、SnENO(2)序列的相似率分别为72.0%和92.1%，与SnENO(2)序列相似性最高、差异性最小；与弓形虫、新孢子虫烯醇酶序列相似性也较高，与TgENO1、TgENO2、NcENO1、NcENO2的相似性分别为79.1%、71.0%、72.3%、79.4%。这几种顶复亚门原虫的烯醇酶氨基酸同源性较高，可能不适合作为特异性的诊断抗原，是这几种原虫的交叉抗原，具有交叉免疫保护性抗原的潜力。
2.7 重组蛋白反应原性和特异性鉴定Western blot以住肉孢子虫阳性血清作为一抗时，在40 ku位置出现了免疫印迹条带(图 4泳道1)，说明rSgENO具有反应原性。rSgENO与弓形虫、新孢子虫阳性血清进行免疫印迹反应显示出条带，说明该重组蛋白可被弓形虫(图 4泳道3)、新孢子虫(图 4泳道4)阳性血清所识别，是这几种原虫的交叉抗原，该结果也验证了生物信息学分析的结果。
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1.羊源住肉孢子虫阳性血清；2.羊源住肉孢子虫阴性血清；3.兔源弓形虫阳性血清；4.兔源新孢子虫阳性血清 1. Positive serum of Sarcocystis from sheep; 2. Negative serum of Sarcocystis from sheep; 3. Positive serum of Toxoplasma from rabbit; 4. Positive serum of Neospora from rabbit 图 4 rSgENO重组蛋白反应原性及特异性鉴定 Fig. 4 Reactive and specificity of rSgENO recombinant protein |
本研究筛选到能被住肉孢子虫阳性血清所识别的虫体蛋白，经克隆比对分析，证明为巨型住肉孢子虫的烯醇酶基因。烯醇酶是糖酵解过程中限速酶之一，能催化2-磷酸甘油酸(2-PGA)形成高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，生成ATP并释放出大量能量[14]，在细胞能量代谢过程中起重要作用。同时烯醇酶还是一种多功能蛋白，通过参与细胞分化、转录、凋亡的调控等过程而在细胞其他生物学活动中发挥重要作用[15]。该酶也在寄生虫的感染与免疫调节、能量代谢中发挥重要作用[16]。弓形虫体内表达两种烯醇酶，TgENO1存在于缓殖子阶段，TgENO2存在于速殖子阶段[17]。这两种酶的核酸序列以及氨基酸序列相似性极高，但其表达的阶段及作用却十分不同。TgENO1可能与其在包囊形成时的无氧条件下依赖于糖酵解有关，具有糖酵解酶和转录调节因子的不同功能，可作为潜在药物靶标用于脑弓形虫的治疗[18]。弓形虫速殖子表达的TgENO2具有较好的反应原性[19]，可以作为免疫保护抗原，用于弓形虫的防治。
住肉孢子虫(Sarcocystis spp.)、弓形虫(Toxoplasma gondii)和新孢子虫(Neospora caninum)均为细胞内寄生原虫，同属于顶复亚门肉孢子虫科[20]，都能感染羊。新孢子虫与弓形虫除形态结构相似外，二者之间还存在多种交叉抗原，如MIC3[21]、AMA1[22]、HSP70[23]、PDI[23]、RP1[23]、BAG5[24]等。与这两种原虫相比，住肉孢子虫抗原及功能蛋白的研究进展滞后，目前尚无该原虫的特异性抗原和与其他顶复亚门原虫的交叉抗原的报道。但是，这三种原虫亲缘关系接近，感染宿主广泛，它们之间存在某些氨基酸序列相似性很高的蛋白，可能会引起不同虫种之间的交叉反应，影响诊断结果。因此，在建立血清学诊断方法时，选择合适的诊断抗原十分关键。
在相近物种之间，不同的烯醇酶亚型可能存在交叉反应。对巨型住肉孢子虫烯醇酶与弓形虫、新孢子虫等顶复亚门原虫的烯醇酶蛋白序列进行生物信息学分析发现，SgENO与SnENO(2)的相似性最高，相似性达92.1%，与其他顶复亚门烯醇酶相似性也在70%以上，说明烯醇酶蛋白在生物进化过程中十分保守，在诊断过程中容易出现交叉反应。随后的蛋白免疫印迹试验也显示rSgENO可被弓形虫、新孢子虫的阳性血清所识别，证明该抗原确实与其他顶复亚门原虫存在交叉反应，因此不适于作为住肉孢子虫诊断抗原。但由于该蛋白具有良好的交叉反应性，而住肉孢子虫、弓形虫和新孢子虫都是羊易感的重要寄生原虫，寻找一种能够为这三种原虫提供交叉保护的蛋白对有效防控这几种寄生虫病具有重要意义。本次克隆表达获得的烯醇蛋白酶可能成为潜在的疫苗候选分子，但是否具有交叉免疫保护效果还需要进一步的试验来验证。
4 结论克隆到巨型住肉孢子虫烯醇酶基因并成功表达其重组蛋白；对rSgENO作为诊断抗原进行初步评价发现该蛋白也能被弓形虫、新孢子虫血清所识别，具有交叉反应性，不宜作为住肉孢子虫的特异性诊断抗原，但是具有作为交叉保护抗原的潜在应用价值。
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