2. 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心, 扬州 225009
2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China
镉是一种有毒重金属，也是一种重要的环境污染物。环境中的镉进入机体严重危害健康，镉对体内多种器官和系统产生毒性作用，其中骨是重要的靶器官之一[1-2]。研究表明，环境水平镉暴露与骨密度降低有密切联系[3-4]。早期认为，镉诱导的骨损伤是由肾功能障碍所致，镉能够增加钙的排泄，减少肾中有活性的维生素D产生，最终导致钙在体内沉积量减少[4-5]。近年来研究认为，镉能直接作用于骨骼细胞，尤其是成骨细胞和破骨细胞[6]。然而其作用机制尚不明确。
作为机体重要的代谢过程，“骨重建”是维持骨正常发育所必需的，其失衡可能严重影响骨的形成和功能。成骨细胞和破骨细胞在骨重建中起着决定性作用，其数量或活性的变化，均会造成骨代谢失衡，引发骨质疏松等骨损伤类疾病。体外研究证明[7]，低水平镉暴露可引起成骨细胞的凋亡，进而抑制骨形成。但是，镉对破骨细胞分化的影响仍不清楚。
破骨细胞是终末多核细胞，不能分裂增殖，只能由单核巨噬细胞分化而来[8]。本文在诱导RAW 264.7细胞生成破骨细胞的过程中，研究了低水平(微摩尔水平)镉暴露对破骨细胞分化的影响，为揭示镉对骨的毒性机制提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 细胞RAW264.7细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库(ATCC Number：TIB-71)。
1.2 主要试剂与仪器CdCl2·xH2O，TRAP染色试剂盒购自美国Sigma公司；胎牛血清(FBS)购自美国GEMINI公司；DMEM，α-MEM，L-谷氨酰胺购自Gibco公司；PrimeScript® RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real-Time)和SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)购自日本TaKaRa公司；Trizol购自Invitrogen公司；CCK-8试剂盒购自日本DOJINDO公司；sRANKL、M-CSF购自美国R & D公司；TRAP、组织蛋白酶K、GAPDH、Beta3抗体、鬼笔环肽，Rat mAb to Tubulin，Goat pAb to Rat IgG H & L(Alexa Fluor® 488)均购自英国Abcam公司；青链霉素购自北京索莱宝公司；RIPA裂解液，蛋白酶抑制剂购自北京普利莱基因技术有限公司；DAPI染液购自碧云天生物技术公司。其他试剂均为国产分析纯。
二氧化碳培养箱购自美国Thermo公司；Tecan Sunrise光吸收酶标仪购自Tecan公司；5810R型冷冻离心机购自德国Eppendorf公司；IM-AGEQUAMT400型凝胶成像仪、电泳仪、电泳槽、转膜仪均购自美国BIORAD公司；SW-CJ-1F型单人双面净化工作台购自苏州净化设备有限公司；AXIO倒置显微镜购自美国ZEISS公司；快速定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司；Leica-sp8激光共聚焦显微镜购自德国Leica公司。
1.3 细胞培养RAW264.7细胞复苏后，在DMEM(含有10% FBS, 100 U·mL-1青霉素, 100 μg·mL-1链霉素和2 mmol·L-1 L-谷氨酰胺)中传代培养。细胞培养在α-MEM培养液(含有10%FBS、25 ng·mL-1 M-CSF和20 ng·mL-1RANKL)中，并放置于37 ℃和5%CO2环境的培养箱中，第3天换液后产生大量破骨细胞。
1.4 CCK-8法检测Cd对细胞活性的影响将RAW264.7细胞(500个细胞·孔-1)接种于96孔板内，添加不同浓度的Cd(0、2、5和10 μmol·L-1)，在M-CSF和RANKL存在的条件下诱导培养至第3天时换液，第4天向各孔内加入20 μL CCK-8试剂溶液。在37 ℃条件下孵育3 h后，于450 nm波长处测量光密度(OD)值。
1.5 TRAP染色试验观察破骨细胞生成情况将RAW264.7细胞重悬于α-MEM(含有10%FBS)中，以1.6×104个细胞·孔-1接种于6孔板中，添加不同浓度的Cd(0、2和5 μmol·L-1)，在M-CSF和RANKL存在下诱导培养至第3天，换液。第4天，根据TRAP染色试剂盒说明书进行染色。在光学显微镜下观察，将有3个或3个以上核的TRAP阳性细胞认定为破骨细胞，并在每个孔的不同区域随机选择视野进行计数。
1.6 免疫荧光观察破骨细胞形态变化将RAW264.7细胞重悬于α-MEM(含有10%FBS)中，以3.2×103个细胞·孔-1接种于24孔板中，添加不同浓度的Cd(0、2及5 μmol·L-1)诱导至第3天，换液。第4天，弃去培养基，第1次用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3遍，用4%多聚甲醛固定细胞15 min；第2次用PBS洗涤3遍，用0.4% TritonX-100透膜10 min；第3次用PBS洗涤3遍，用5%BSA室温封闭1.5 h；第4次用PBS洗涤后添加罗丹明-鬼笔环肽和大鼠抗α-tubulin抗体混合液，4 ℃过夜孵育；第5次用PBS洗涤3遍，添加抗大鼠488荧光二抗，室温孵育2 h；第6次用PBS洗涤3遍，添加DAPI，室温孵育15 min；第7次用PBS清洗3遍，封片；Leica-sp 8激光共聚焦显微镜观察、拍照。
1.7 qRT-PCR检测破骨细胞标志性基因表达变化将RAW264.7细胞重悬于α-MEM(含有10%FBS)中，以1.6×104个细胞·孔-1接种于6孔板中，添加不同浓度的Cd(0、2和5 μmol·L-1)，诱导至第3天，换液，培养至第4天。用Trizol试剂提取各孔总RNA，RNA的产量和纯度可以根据260 nm处吸光度值和A260 nm/A280 nm值确定。根据PrimeScript® RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real-Time)试剂盒说明书进行反转录。合成的cDNA保存在-20 ℃备用。
cDNA稀释10倍后根据SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书在荧光定量PCR仪上测定不同基因的Ct值。其中，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参基因。根据定量结果进行mRNA表达分析。目的基因引物序列见表 1。
|
表 1 本研究所用引物序列 Table 1 Primer sequences used in this study |
将RAW264.7细胞重悬于α-MEM(含有10%FBS)中，以1.6×104个细胞·孔-1接种于6孔板中，添加不同浓度的Cd(0、2和5 μmol·L-1)，诱导至第3天，换液，培养至第4天。将培养液弃去，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗1遍。向各孔加入细胞裂解液，用细胞刮刀刮取细胞，收集3个孔的细胞裂解液作为1个样品，并置于冰上裂解30 min。细胞充分裂解后，4 ℃ 12 000 g·min-1离心10 min。收集上清液。使用BCA法测定蛋白浓度。随后加入6×loading buffer与蛋白样品以1:5混合。100 ℃沸水中煮10 min，-20 ℃保存。
每组蛋白样品取30 μg进行SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜上，5%脱脂乳室温封闭1 h，4 ℃孵育TRAP、CTSK、Beta 3和GAPDH抗体(1:1 000)过夜。孵育二抗(1:8 000)37 ℃ 1 h。加入发光液进行显影。其中，GAPDH为内参蛋白。
1.9 数据分析所有试验重复3次，数据表示为“x±sx”。用SPSS v.19.0软件进行单因素方差分析，P < 0.05为差异显著性判断标准。
2 结果 2.1 Cd对RAW264.7细胞活性的影响在M-CSF和RANKL存在的条件下，检测RAW264.7暴露于不同浓度的Cd至第4天时的细胞活性变化。结果显示(图 1)，与对照组相比，随着Cd浓度增加，细胞活性逐渐下降(P < 0.01)。当Cd浓度为10 μmol·L-1时，细胞活性下降50%以上，细胞存活数目少。因此，后续试验选取Cd浓度为0、2和5 μmol·L-1。
|
与对照组相比，*. P < 0.05；**.P < 0.01。下同 Compared with control group, *. P < 0.05; **. P < 0.01. The same as follows 图 1 CCK-8检测细胞活性变化 Fig. 1 Cell viability detected by CCK-8 assay |
在M-CSF和RANKL存在的条件下，检测不同浓度Cd(0~5 μmol·L-1)处理对破骨细胞生成的影响(图 2)。结果显示，随着Cd浓度增加，破骨细胞产生量呈现下降趋势。与对照组相比，2和5 μmol·L-1 Cd处理组破骨细胞产生的数目和面积均显著或极显著下降(P < 0.05或P < 0.01)。
|
图 2 Cd对破骨细胞生成数目和面积的影响 Fig. 2 Effect of Cd on the number and area of osteoclast formation |
在M-CSF和RANKL存在的条件下，细胞Cd(0~5 μmol·L-1)处理并且诱导至第4天对细胞核、微丝(F-actin)及微管(α-tubulin)染色(图 3)。结果显示，对照组形成大量具有完整封闭带的破骨细胞，2 μmol·L-1 Cd处理组形成的破骨细胞多数仅有伪足小体带或未形成伪足小体簇，5 μmol·L-1 Cd处理组形成大量聚集存在的前体细胞以及少数无封闭带的破骨细胞。这说明，低微摩尔水平镉能抑制破骨细胞封闭带的形成。
|
图 3 Cd对破骨细胞细胞骨架的影响 Fig. 3 Effect of Cd on the cytoskeleton of osteoclasts |
在M-CSF和RANKL存在的条件下，细胞Cd(0~5 μmol·L-1)处理并且诱导至第4天时提取总RNA。实时荧光定量PCR分析mRNA表达量变化(图 4)。TRAP、组织蛋白酶K(CTSK)、基质金属蛋白酶-9 (MMP-9)和Ⅱ型碳酸酐酶(CAⅡ)基因在破骨细胞中表达量很高，是破骨细胞标志性基因。与对照组相比，Cd处理组破骨细胞标志性基因转录水平均显著或极显著下降(P < 0.05或P < 0.01)，并呈剂量效应关系。
|
图 4 Cd对破骨细胞TRAP、CTSK、CA Ⅱ和MMP-9 mRNA水平的影响 Fig. 4 Effects of Cd on mRNA levels of TRAP, CTSK, CA Ⅱ and MMP-9 in osteoclasts |
在M-CSF和RANKL存在的条件下，细胞Cd(0~5 μmol·L-1)处理并且诱导至第4天时提取总蛋白，Western blot检测TRAP、CTSK和整合素3(Beta 3)表达量变化(图 5)。结果显示，随着Cd浓度增加，破骨细胞标志性蛋白表达量逐渐下降。在5 μmol·L-1时，各蛋白表达量极显著下降(P < 0.01)。
|
图 5 Cd对破骨细胞TRAP、CTSK和Beta3蛋白表达的影响 Fig. 5 Effects of Cd on TRAP, CTSK and Beta3 protein expression in osteoclasts |
镉是一种广泛分布的环境污染物，可通过食物链系统进入体内蓄积，代谢速度缓慢，半衰期可达10~30年。流行病学研究表明，镉暴露可引起骨质丢失，骨质疏松和骨软化症等骨损伤类疾病[9-10]。因此，镉被认为是骨质丢失的环境风险因素之一[11-13]。破骨细胞可能在其中发挥关键作用。
破骨细胞是体内唯一具有骨吸收活性的细胞，其骨吸收与成骨细胞骨形成之间的动态平衡在机体骨重建过程中扮演着重要角色[14]。据报道[9-10, 15-16]，镉的长期低水平暴露可导致人和动物的骨质丢失，然而不会引起肾功能障碍。因此，我们从镉对骨骼细胞的直接作用入手，深入研究镉致骨质丢失机制。本实验室前期研究表明[17]，低水平镉能引起成骨细胞的凋亡，进而抑制骨形成。但是低水平镉对破骨细胞分化的影响需进一步研究。
本研究表明，镉抑制破骨细胞及其前体细胞的活力，对破骨细胞的形成呈现剂量依赖性的毒性作用，类似于镉对成骨细胞的凋亡作用。通过TRAP染色试验发现，随着镉浓度增加，破骨细胞生成数目减少，且多为面积较小的破骨细胞，说明镉抑制了前体细胞的融合。免疫荧光技术观察破骨细胞的细胞骨架变化，发现Cd能抑制封闭带的形成。封闭带的完整性是破骨细胞进行骨吸收的必要条件[18-20]，故Cd通过抑制封闭带的形成进而降低破骨细胞骨吸收功能。破骨细胞分化和活性与特异性蛋白的表达有关，TRAP蛋白在前体细胞和破骨细胞中高表达，组织蛋白酶K是降解有机骨基质的关键酶；MMP-9和CAⅡ是与破骨细胞骨吸收功能相关蛋白，能分泌到封闭带内，参与骨质和矿物质的代谢；Beta3蛋白参与破骨细胞黏附结构的形成[8]。本研究结果显示，低微摩尔水平镉暴露后破骨细胞标志性基因和蛋白表达量均呈剂量依赖性下降，与破骨细胞生成、活性和结构相一致。低水平镉暴露能抑制破骨细胞的分化进而降低骨质吸收，也能引起成骨细胞的凋亡进而抑制骨形成。然而，低水平镉暴露可引起机体骨软化和骨质疏松等骨质丢失类疾病，可能是由于镉对骨形成的抑制作用大于对骨质吸收的抑制作用。因此，低水平镉致骨质丢失机制需进一步探究。
4 结论从细胞水平上证明，低微摩尔水平镉能够抑制前体细胞向破骨细胞分化，进而降低骨吸收功能；这为镉致骨质疏松以及骨软化等骨质丢失类疾病的研究提供了新的理论基础。
| [1] | XIE D D, SHENG Z F. Low-level cadmium exposure and bone health[J]. J Bone Miner Res, 2017, 32(2): 419. DOI: 10.1002/jbmr.3049 |
| [2] | WALLIN M, BARREGARD L, SALLSTEN G, et al. Response to "low-level cadmium exposure and bone health"[J]. J Bone Miner Res, 2017, 32(2): 420–421. DOI: 10.1002/jbmr.3050 |
| [3] | SINGHANIA S, SINGH S, PARIKH P. Cadmium as a risk factor for osteoporosis in COPD[J]. Int J Tuberc Lung Dis, 2017, 21(2): 244. DOI: 10.5588/ijtld.16.0736 |
| [4] | SCIMECA M, FEOLA M, ROMANO L, et al. Heavy metals accumulation affects bone microarchitecture in osteoporotic patients[J]. Environ Toxicol, 2017, 32(4): 1333–1342. DOI: 10.1002/tox.22327 |
| [5] | WEAVER V M, KIM N S, JAAR B G, et al. Associations of low-level urine cadmium with kidney function in lead workers[J]. Occup Environ Med, 2011, 68(4): 250–256. DOI: 10.1136/oem.2010.056077 |
| [6] | CHEN X, ZHU G Y, GU S Z, et al. Effects of cadmium on osteoblasts and osteoclasts in vitro[J]. Environ Toxicol Pharmacol, 2009, 28(2): 232–236. DOI: 10.1016/j.etap.2009.04.010 |
| [7] | LIU W, ZHAO H Y, WANG Y, et al. Calcium-calmodulin signaling elicits mitochondrial dysfunction and the release of cytochrome c during cadmium-induced apoptosis in primary osteoblasts[J]. Toxicol Lett, 2014, 224(1): 1–6. DOI: 10.1016/j.toxlet.2013.10.009 |
| [8] | VÄÄNÄNEN H K, LAITALA-LEINONEN T. Osteoclast lineage and function[J]. Arch Biochem Biophys, 2008, 473(2): 132–138. DOI: 10.1016/j.abb.2008.03.037 |
| [9] | WALLIN M, BARREGARD L, SALLSTEN G, et al. Low-level cadmium exposure is associated with decreased bone mineral density and increased risk of incident fractures in elderly men:the MrOS sweden study[J]. J Bone Miner Res, 2016, 31(4): 732–741. DOI: 10.1002/jbmr.2743 |
| [10] | AKESSON A, BJELLERUP P, LUNDH T, et al. Cadmium-induced effects on bone in a population-based study of women[J]. Environ Health Perspect, 2006, 114(6): 830–834. DOI: 10.1289/ehp.8763 |
| [11] | CHEN X, GAN C H, ZHU G Y, et al. Benchmark dose for estimation of cadmium reference level for osteoporosis in a Chinese female population[J]. Food Chem Toxicol, 2013, 55: 592–595. DOI: 10.1016/j.fct.2013.01.044 |
| [12] | TAHA M M, ABDALLAH H, SHAHY E M, et al. Impact of occupational cadmium exposure on bone in sewage workers[J]. Int J Occup Environ Health, 2018, 24(3-4): 101–108. DOI: 10.1080/10773525.2018.1518745 |
| [13] | LIM H S, LEE H H, KIM T H, et al. Relationship between heavy metal exposure and bone mineral density in korean adult[J]. J Bone Metab, 2016, 23(4): 223–231. DOI: 10.11005/jbm.2016.23.4.223 |
| [14] |
宋瑞龙. OPG对破骨细胞分化过程中细胞骨架的影响及其分子机理[D].扬州: 扬州大学, 2014.
SONG R L. Influences of osteoprotegerin on the cytoskeleton of osteoclast and the involve signalling pathways in the process of osteoclast differentiation[D]. Yangzhou: Yangzhou University, 2014. (in Chinese) http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-11117-1015664698.htm |
| [15] | BRZÓSKA M M, MONIUSZKO-JAKONIUK J. Low-level lifetime exposure to cadmium decreases skeletal mineralization and enhances bone loss in aged rats[J]. Bone, 2004, 35(5): 1180–1191. DOI: 10.1016/j.bone.2004.07.010 |
| [16] | ENGSTRÖM A, MICHAËLSSON K, SUWAZONO Y, et al. Long-term cadmium exposure and the association with bone mineral density and fractures in a population-based study among women[J]. J Bone Miner Res, 2011, 26(3): 486–495. DOI: 10.1002/jbmr.224 |
| [17] | LIU W, DAI N N, WANG Y, et al. Role of autophagy in cadmium-induced apoptosis of primary rat osteoblasts[J]. Sci Rep, 2016, 6: 20404. DOI: 10.1038/srep20404 |
| [18] |
赵鸿雁.骨保护素对破骨细胞及其前体黏附结构和融合的影响[D].扬州: 扬州大学, 2015.
ZHAO H Y. Effects of osteoprotegerin on the peripheral adhesive structures and fusion of (pre) osteoclast[D]. Yangzhou: Yangzhou University, 2015. (in Chinese) http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-11117-1015662650.htm |
| [19] | TAKITO J, INOUE S, NAKAMURA M. The sealing zone in osteoclasts:a self-organized structure on the bone[J]. Int J Mol Sci, 2018, 19(4): 984. DOI: 10.3390/ijms19040984 |
| [20] | BATSIR S, GEIGER B, KAM Z. Dynamics of the sealing zone in cultured osteoclasts[J]. Cytoskeleton (Hoboken), 2017, 74(2): 72–81. DOI: 10.1002/cm.21350 |