结核病(tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)感染引发的致死性人畜共患传染病[1]。世界卫生组织的调查结果显示，2016年全球结核菌感染人数约占总人口的1/4，且因结核病死亡人数约130万[2]。近年来，随着MTB与人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)共感染和多重耐药(multi-drug resistant, MDR)菌株的出现使得结核病愈加难以控制[2-3]。因此，深入探究结核病发病过程中结核分枝杆菌与其靶细胞——巨噬细胞的博弈及二者命运对结核病的预防及治疗具有重要意义。
受体相互作用蛋白激酶1(RIP1)是一种蛋白质Ser/Thr激酶，它可与多种蛋白相互作用, 广泛参与机体免疫、细胞凋亡等信号转导, 发挥多种生理功能[4]。作为参与调节细胞死亡途径的重要蛋白之一[5]，RIP1在MTB感染巨噬细胞过程中的调控作用倍受关注[6]。研究表明，当MTB感染巨噬细胞时，RIP1作为控制巨噬细胞自噬和细胞死亡的关键介质促进细胞存活[7]。另一方面，RIP1也可作为促凋亡适配器发生泛素化，从而诱导细胞凋亡[8]；在研究紫草素(SK)对癌细胞死亡的调控作用时，SK通过调节RIP1的表达诱导胰腺癌细胞发生凋亡和坏死[9]；在保护黑色素瘤细胞免受内质网(ER)应激所诱导的细胞凋亡过程中RIP1也功不可没[10]。尽管RIP1在生命活动中发挥的作用已被广泛研究[11]，但RIP1在卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)诱导巨噬细胞凋亡过程中的研究尚未见系统报道。因此深入探讨RIP1在BCG致小鼠巨噬细胞凋亡过程中的调控作用对于进一步揭示二者之间的互作机制具有重要意义。
本研究通过构建RIP1的腺病毒干扰载体，并用BCG和腺病毒干扰载体处理小鼠巨噬细胞RAW264.7，检测各处理细胞凋亡率以及凋亡相关指标，探讨RIP1对BCG感染小鼠巨噬细胞RAW264.7后细胞凋亡的调控作用及调控机制，为揭示MTB的致病机制和开发靶向药物提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器SDS-PAGE蛋白质缓冲液(5×)购于碧云天生物技术公司。β-actin、RIP1、Bcl-2、Bax单克隆抗体、荧光二抗均购自Proteintech公司。全蛋白提取试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒Annexin V-APC//PI (KGA106)、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)、ROS检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒均购自凯基生物。
流式细胞仪购自默克密理博Guava。蛋白电泳装置、酶标仪购自Bio-Rad公司。GE化学发光检测仪购自Amersham Bioscience有限公司。
1.2 细胞、菌株与腺病毒载体RAW264.7细胞购自中国科学院上海细胞研究所。卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)疫苗购自上海生物制品研究所有限公司。ADV4-NC和RIP1腺病毒干扰载体购自上海吉玛制药技术有限公司。
1.3 BCG培养采用Middlebrook7H10固体培养基对BCG菌株进行复苏，挑取菌落加入Middlebrook7H9液体培养基，在37 ℃、5%CO2培养箱中进行培养，每3周传代1次。
1.4 细胞培养和转染RAW264.7细胞培养在完全DMEM培养基(含10%胎牛血清、100 μmol·mL-1青霉素和100 μmol·mL-1链霉素)中，37 ℃、5% CO2培养箱。选择生长状态良好的RAW264.7细胞按5×105·孔-1接种到6孔板，待细胞贴壁生长融合率为75%~80%时，将RIP1腺病毒干扰载体和对照组分别转染入细胞中，36 h后再用BCG诱导RAW264.7细胞(感染复数为10)，继续培养12 h后收集样品，进行后续试验。
1.5 Annexin V-APC/PI法检测细胞凋亡率当细胞贴壁生长密度达80%~90%时，弃培养皿中全部原培养液，PBS洗涤细胞，使用不含EDTA的胰酶消化细胞，收集细胞悬液，800 g离心5 min，加入500 μL 1×Binding Buffer重悬细胞，对照组分别用AV单染、PI单染和不染，各处理组分别加入Annexin V-APC5 μL，混匀后加入PI染色液5 μL。室温，避光孵育10 min。1 h内上流式细胞仪检测。按常规三色标记流式细胞术检测，调好荧光间补偿，通过两两搭配，分别以Annexin V-APC为横坐标、PI为纵坐标作图作为Annexin VAPC/PI显示体系，细胞凋亡率等于AV占总细胞数的百分比。
1.6 JC-1检测RAW264.7细胞的线粒体膜电位当细胞贴壁生长密度达80%~90%时，弃培养皿中全部原培养液，PBS洗涤细胞，使用不含EDTA的胰酶消化细胞，收集细胞悬液，800 g离心5 min，首先用配制好的JC-1工作液重悬细胞，800 g离心收集沉淀细胞。吸取2 mL细胞培养液重悬细胞(具体步骤参见试剂盒说明书)。1 h内用流式细胞仪检测。
1.7 流式细胞术检测RAW264.7细胞ROS水平根据南京凯基ROS试剂盒说明书，按试验设计处理细胞后，用DCFH-DA荧光探针检测细胞活性氧水平(具体步骤参见试剂盒说明书)。1 h内上流式细胞仪检测，每个样品收集1× 104个细胞，CellQuest软件分析结果。
1.8 免疫印迹用凯基蛋白提取试剂盒提取细胞全蛋白，按照30 μg的蛋白上样量对蛋白样品进行定量，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)2 h，300 mA转膜2 h，SuPerblock 37 ℃恒温摇床封闭1 h，分别加入“1.1”所示一抗，β-actin单克隆抗体作为内参(1:5 000)，4 ℃孵育过夜后，TBST缓冲液洗涤5 min·次-1，加入二抗(1:5 000)，室温孵育2 h，TBST缓冲液洗涤5 min·次-1，加入ECL显色液，利用GE化学发光检测仪成像。结果用Imagine J软件计算各组条带的灰度值。
1.9 细胞周期分析用RIP1腺病毒干扰载体和NC处理细胞12 h，收获细胞。在-20 ℃、70%乙醇中固定过夜，并用含有400 μg·mL-1 RNase的碘化丙啶(36 μg·mL-1)染色。然后将它们在冰上避光摇晃，染色30 min。收集细胞并通过流式细胞术分析细胞周期谱和细胞凋亡情况。该数据用MODFIT的软件进行分析。
1.10 统计学处理采用Excel整理和分析数据，均值比较时采用OneWay ANOVA分析进行显著性检验，试验数据用“x±s”表示。多个组间的两两比较使用LSD检验，通过绘图软件GraPh Pad Prism 8. 0绘制图形。
2 结果 2.1 BCG感染上调RAW264.7细胞内RIP1的表达量前期研究显示BCG感染能诱导巨噬细胞发生凋亡[12]，既然RIP1在细胞凋亡与坏死过程发挥重要调控作用，那么BCG感染过程是否上调了RIP1的表达，RIP1是否参与BCG诱导的细胞凋亡过程?为此，通过检测BCG感染RAW264.7细胞后RIP1蛋白的表达水平发现，BCG感染后，RAW264.7细胞RIP1蛋白的表达量极显著上调(P < 0.001)(见图 1)。
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A.Western blot；B.RIP1蛋白表达灰度分析，***.P < 0.001 A.Western blot; B. The gray scale analysis, ***.P < 0.001 图 1 BCG诱导的RAW264.7细胞RIP1蛋白的表达水平 Fig. 1 RIP1 protein expression level of BCG-infected RAW264.7 cells |
既然BCG感染上调了RAW264.7细胞RIP1蛋白的表达量，为了研究BCG诱导的小鼠巨噬细胞凋亡是否与RIP1有关，通过构建RIP1腺病毒干扰载体并验证其干扰效果，结果如图 2所示，RIP1干扰后其表达水平极显著低于对照组(图 2A、C)(P < 0.01)，由此可知，成功构建RIP1腺病毒干扰载体。同时，用BCG和RIP1i同时处理RAW264.7细胞后发现，RIP1干扰载体可极显著下调RIP1的表达量(图 2B、D)(P < 0.001)。
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A. WB检测RIP1i转染的RAW264.7细胞RIP1蛋白的表达水平；B.不同处理组中RIP1蛋白表达水平；C、D. RIP1蛋白表达灰度分析结果，**.P < 0.01，***.P < 0.001 A. The RIP1 protein expression of RAW264.7 cells transfected with RIP1i plasmid; B. The WB results of RIP1 in RAW264.7 cells; C, D. The gray scale analysis results of RIP1 protein expression, **.P < 0.01, ***.P < 0.001 图 2 RIP1腺病毒干扰载体的验证 Fig. 2 Verification of RIP1 adenovirus interference vector |
为了探究RIP1对BCG感染诱导的RAW264.7细胞凋亡有何影响，利用Annexin V-APC/PI法检测了细胞凋亡率。流式细胞仪检测结果(图 3)显示，BCG感染上调了RAW264.7细胞凋亡率，而RIP1i极显著(P < 0.01)下调了BCG感染RAW264.7细胞的凋亡水平，并且早期凋亡与晚期凋亡相比明显增加，由此可见，RIP1参与BCG诱导的RAW264.7细胞凋亡调控。
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**.P < 0.01，****.P < 0.000 1 图 3 RIP1对BCG诱导的RAW264.7细胞凋亡率的影响 Fig. 3 The effect of RIP1 on BCG-induced apoptosis rate of RAW264.7 cells |
线粒体膜电位下降是凋亡的早期表现，一旦线粒体膜电位损耗，细胞就会进入不可逆的凋亡过程。通过检测线粒体膜电位水平探究RIP1是否通过影响BCG感染后RAW264.7细胞的线粒体膜电位来调控细胞凋亡，如图 4E所示，与BCG组相比，RIP1i处理极显著降低线粒体膜电位水平(P < 0.000 1)。因此，RIP1能够通过上调BCG感染的RAW264.7细胞线粒体膜电位下降幅度，促使细胞发生凋亡。
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****.P < 0.000 1 图 4 RIP1对BCG诱导的RAW264.7细胞线粒体膜电位的影响 Fig. 4 The effect of RIP1 on mitochondrial membrane potential in BCG-infected RAW264.7 cells |
由于ROS参与细胞凋亡，细胞存活等信号转导过程，所以按试验设计处理细胞后，采用2, 7-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA)荧光探针测定了细胞活性氧水平，流式细胞仪检测结果如图 5所示。BCG诱导RAW264.7后，与对照组相比，细胞活性氧水平极显著上调(图 5B)(P < 0.000 1)，RIP1i处理RAW264.7细胞的活性氧水平相对于BCG组极显著下调(图 5D)(P < 0.000 1)。
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****.P < 0.000 1 图 5 RIP1对BCG诱导的RAW264.7细胞活性氧水平的影响 Fig. 5 The effect of RIP1 on ROS level of BCG-induced RAW264.7 cell |
为进一步证实RIP1是否参与调控BCG感染的RAW264.7细胞凋亡相关蛋白。本试验利用WB检测了转染RIP1i后促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2的表达水平(图 6A)。灰度分析结果显示，与BCG单独感染组相比，RIP1干扰结合BCG感染组Bcl-2蛋白表达水平极显著地上升(P < 0.01，图 6B)，而Bax的表达水平则极显著下调(P < 0.000 1，图 6C)，与此同时Bax/Bcl-2比值极显著下降(P < 0.001，图 6D)。由此推测当BCG感染RAW264.7细胞后，RIP1通过上调Bax蛋白并下调Bcl-2蛋白表达水平从而诱导其凋亡。
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A.WB检测各蛋白表达水平；B.Bcl-2蛋白表达灰度分析结果；C.Bax蛋白表达灰度分析结果；D.不同处理组中Bax/Bcl-2蛋白表达水平；*.P < 0.05，**.P < 0.01，***.P < 0.001，****.P < 0.000 1 A. The WB result of each protein in RAW264.7 cells; B. The gray scale analysis results of Bcl-2 protein expression in RAW264.7 cells; C. The gray scale analysis results of Bax protein expression in RAW264.7 cells; D. The Bax/Bcl-2 in RAW264.7 cells; *.P < 0.05, **.P < 0.01, ***.P < 0.001, ****.P < 0.000 1 图 6 RIP1对BCG诱导的RAW264.7细胞凋亡相关蛋白表达的影响 Fig. 6 The effect of RIP1 on expression of BCG-induced apoptosis-related proteins in RAW264.7 cells |
用流式细胞仪检测各试验组细胞周期结果如图 7所示，BCG感染RAW264.7后，其G1期细胞与对照组相比极显著增加(P < 0.01)；RIP1i处理后，G1期细胞显著下降(P < 0.05)。而G2/M期细胞没有明显变化(图 7)。由此可知，RIP1可导致细胞周期运行滞留于G1期，延缓细胞周期进程，以致发生细胞凋亡。
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*.P < 0.05，**.P < 0.01 图 7 RIP1对BCG诱导的RAW264.7细胞周期的影响 Fig. 7 The effect of RIP1 on BCG-infected RAW264.7 cell cycle |
细胞凋亡是许多生物学和病理学过程的重要组成部分，参与多种疾病的发生和发展进程, 因此，研究细胞凋亡过程成为揭示某些疾病发病机制的焦点[13-14]。结核分枝杆菌作为一种典型胞内致病菌，当其侵染宿主细胞时，首先巨噬细胞被激活以清除结核分枝杆菌，阻止其在体内播散, 并促进细胞因子TNF-α、IL-6等的释放, 增强机体对MTB的杀伤能力。与此同时，凋亡也是巨噬细胞感染结核分枝杆菌后通常会出现的应答方式之一[15-16]，这种方式不同于坏死会引发过度的炎性反应，因此结核分枝杆菌不会逸散出来感染其他细胞，这在某种程度上遏制了结核病的发展进程[17-18]。细胞凋亡是个复杂的生命过程，有许多蛋白参与其中，而RIP1作为该过程的重要效应分子发挥着重要的调控作用[19]，但是关于其在BCG诱导巨噬细胞凋亡过程中的调控作用尚未见系统报道。BCG作为WHO规定的唯一在全球广泛使用的抗MTB疫苗[20]。其对机体的保护作用有限，已不足以应对现实的结核病疫情挑战[21]，有研究证明从BCG感染的巨噬细胞中纯化的凋亡小体，对患者进行接种可以更好地预防结核病[22]。同一研究小组证实重组rBCG △ureC::hly+疫苗可通过增强巨噬细胞凋亡以达到比普通BCG更好的预防效果[23]。那么增强BCG诱导的巨噬细胞凋亡能否作为提高疫苗效力和阻止MTB扩散的替代方法？因此，探讨BCG感染引发的巨噬细胞凋亡机制对结核病的预防及治疗具有重要指导意义。
本研究小组前期研究证实BCG可以诱发细胞凋亡[18]，在本试验中发现BCG上调了RAW264.7细胞中RIP1的表达量。这二者是否有内在联系？有报道显示，干扰或者抑制RIP1后，细胞凋亡过程可以被阻断[24-25]。为了证明RIP1是否参与BCG诱导的细胞凋亡，本研究通过干扰RIP1后发现BCG感染的细胞凋亡率极显著下降(P < 0.01)。而Wang等[25]研究证实，RIP1参与TAKI诱导的巨噬细胞凋亡，这与本研究结果基本一致。但是，Chen等[9]发现，RIP1干扰明显促进SK诱导的细胞凋亡。这表明，RIP1对细胞凋亡还可以发挥抑制作用。进一步研究发现，RIP1还可下调BCG诱导的RAW264.7细胞线粒体膜电位。还有报道认为，RIP1的激活也可能会导致线粒体中ROS的产生[26]。这主要是由于RIP1参与由TNFR家族介导所引起的细胞凋亡过程[27]，而TNFR1激活NADPH氧化酶以产生细胞溶质ROS[28]，本研究中，RIP1上调了BCG诱导的RAW264.7细胞活性氧水平。除此之外，RIP1还对凋亡相关蛋白Bcl-2和Bcl-2相关蛋白(Bax)起调节作用。其中Bax可以通过自身形成的同源二聚体破坏线粒体膜，启动凋亡起始复合体的形成来促进细胞凋亡。另外，它可与Bcl-2形成异源二聚体，导致细胞凋亡的发生[29-30]。当BCG感染的RAW264.7细胞中RIP1被干扰后，细胞的Bcl-2蛋白水平发生上调，Bax则极显著下调(P<0.01)，这表明RIP1通过提高凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值诱导其凋亡。通过对细胞周期进行检测发现，RIP1还参与调控BCG诱导巨噬细胞的细胞周期，有研究发现，RIP1在p27Kip1的调节和细胞周期进程中尤为重要，RIP1可影响G1期到S期转换的关键调节因子并阻断G1期中细胞的积累[31]。而细胞周期的延迟也是细胞凋亡的主要原因之一，其作用机制还有待于进一步研究。综上表明，BCG感染诱导的细胞凋亡与RIP1有关，RIP1通过下调BCG感染后RAW264.7的线粒体膜电位，上调活性氧含量并提高凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值，使细胞周期阻滞于G1期从而参与诱导细胞凋亡。
4 结论BCG感染可有效上调RIP1表达量并诱导RAW264.7细胞凋亡。BCG感染诱导的细胞凋亡与RIP1有关，RIP1通过下调BCG感染后RAW264.7的线粒体膜电位，上调活性氧含量并提高凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值，使细胞周期阻滞于G1期从而参与诱导细胞凋亡。
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