2. 湖南畜禽安全生产协同创新中心, 长沙 410128;
3. 兽用蛋白质工程疫苗湖南省重点实验室, 长沙 410128
2. Hunan Co-Innovation Center of Animal Production Safety, Changsha 410128, China;
3. Hunan Provincial Key Laboratory of Protein Engineering in Animal Vaccines, Changsha 410128, China
褐黄血蜱(Haemaphysalis flava)是一类广泛分布于东亚地区的多宿主体外寄生虫[1]，文献显示，该蜱主要寄生于刺猬，也见于猪、黄牛、大熊猫等[2]，褐黄血蜱叮咬人的事件近年来也曾有报道。它携带新布尼亚病毒[3]、包柔螺旋体[4]、立克次体[5]等多种病原微生物，具有潜在的公共卫生意义。
雌性成蜱在吸食宿主血液后，消化血餐、吸收营养并合成多种化学物质，其中一些经卵巢转移、富集于卵原生质中，以供蜱类胚胎发育所需。但蜱卵原生质中有哪些成分以及对蜱发育的意义，迄今尚无研究报道。随着蜱类学研究的深入，一些学者也开始关注此方面问题，刘光远等[6]建立了长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)卵cDNA转录组文库；蜱类卵巢蛋白质组学的相关研究已有报道[7]；蜱类卵黄蛋白原(vitellogenins, Vg)相关研究也逐步深入，且已证实，饱血雌蜱的中肠和脂肪体合成Vg后释放入血淋巴，转运至卵巢，由受体介导的内吞作用而进入卵母细胞，经过修饰加工成为卵黄蛋白(vitellins, Vn)[8-9]。卵黄蛋白原家族蛋白数量众多，属于载脂蛋白超家族[10]，其既参与物质转运，也是卵黄蛋白的前体物质[11]。
免疫控蜱安全、易行、高效，是当前蜱虫防治的研究方向，但疫苗种类少，仅有基于微小扇头蜱(Rhipicephalus microplus)Bm86成功制备的商业化疫苗TickGARD和GAVAC[12-13]，且存在明显的局限性，仅对微小扇头蜱产生免疫保护作用，对其他蜱种无交叉免疫保护力，亟待人们发现更多的抗原分子。本研究拟采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)揭示褐黄血蜱卵内蛋白组分，结合褐黄血蜱唾液腺转录组文库和中肠转录组文库鉴定并确定蛋白的一级结构及其编码基因，为今后探索卵内蛋白的功能和利用蛋白免疫宿主，干扰卵内成分合成，影响雌蜱产卵及卵的孵化，发展绿色、环保的免疫控蜱措施奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂及仪器氯仿、甲醛、乙腈、甲酸均购于国药集团化学试剂有限公司；胰蛋白酶购于美国Promega(北京)生物技术有限公司；Q Exactive质谱仪(Thermo Fisher)；液相色谱仪(Agilent Technologies)。
1.1.2 褐黄血蜱卵褐黄血蜱采自河南省信阳市刺猬体表，饱血褐黄血蜱雌蜱采集后放置于环境培养箱9 d后产的第一批卵收集用于试验。
1.2 方法 1.2.1 卵蜡质层的去除取0.3 g卵均分为三等份，置于3个1.5 mL离心管中，每管各加入1.5 mL三氯甲烷/甲醇混合液(2：1)后涡旋15~20 s，弃去上清液。加入1 mL无菌去离子水，涡旋15~20 s，弃去上清，保留蜱卵。
1.2.2 卵总蛋白的提取取三管去除蜡质的卵分别于3支灭菌的玻璃匀浆器中，各加入0.3 mL无菌生理盐水研磨，直至卵彻底匀浆。移取匀浆液于3个1.0 mL离心管中，定容至0.5 mL。4 ℃静置30 min后5 000 r·min-1离心5 min，吸取上清备用。
1.2.3 FASP酶解取总蛋白提取液经过冻干处理，加入40 μL胰蛋白酶，37 ℃孵育16~18 h。
1.2.4 毛细管高效液相色谱液相A液为0.1%甲酸水溶液，B液为0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈为84%)。色谱柱以95%的A液平衡。样品由自动进样器上样到色谱柱，再经色谱柱分离，相关液相梯度如下：第0-50分钟，B液线性梯度从4%到50%；第50-54分钟，B液线性梯度从50%到100%；第54-60分钟，B液维持在100%。
1.2.5 ESI质谱鉴定酶解产物经毛细管高效液相色谱脱盐及分离后用质谱仪进行质谱分析。检测方式：正离子。多肽和多肽碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描后采集10个碎片图谱。
1.2.6 ESI质谱数据分析原始文件用Mascot 2.2软件搜索相应数据库，最后得到鉴定的肽段和蛋白质结果。本次样品检索使用的数据库分别为自建的褐黄血蜱唾液腺(NCBI文库登录号GSE67247)和中肠转录组翻译文库(GSE69721)，以及Uniprot Ixodoidea蜱总科蛋白数据库(包含183 323条序列，下载时间为2018/06/06，http://www.uniprot.org/taxonomy/297308)。软件检索所用相关参数如下：Enzyme=Trypsin、Missed cleavage=2、Fixed modification：Carbamidomethyl(C)，Variable modification：Oxidation(M)。Peptides tolerance：20 ppm，MS/MS tolerance：0.1 Da，Mascot结果过滤参数：Mascot Score≥20。
2 结果 2.1 SDS-PAGE卵总蛋白检测BCA法测定表明，卵总蛋白提取液蛋白含量2.7 μg·μL-1；SDS-PAGE电泳显示，卵内含有多种蛋白，其相对分子质量多在10~150 ku，而大小在10~25 ku的丰度较高(图 1)。
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图 1 卵总蛋白提取液SDS-PAGE图(1、2、3为重复样品) Fig. 1 Proteins extracted from the eggs of Haemaphysalis flava (1, 2 and 3 were the paired samples) |
本次从卵总蛋白提取物中检出特异性肽段(unique peptide) 221条(质谱图见图 2)，以此搜索唾液腺转录组翻译文库、中肠转录组翻译文库和Uniprot数据库(蜱总科)，鉴定蛋白53种，其中高可信蛋白(unique peptide≥2)12种(unique peptide≥2搜库结果见表 1), 各文库鉴定肽段情况见图 3。将搜索唾液腺转录组翻译文库和中肠转录组翻译文库得到的蛋白序列上传Uniprot，基于同源蛋白对其进行注释，结果见表 2。
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保留时间：0.00~60.00 min；离子强度：7.70×109；基峰F：FTMS+p NSI; 全扫描：350.0000~1800.0000；质谱扫描：R866-1 RT:0.00-60.00 min; NL:7.70×109; Base Peak F:FTMS+p NSI; Full ms:350.0000-1800.0000;MS:R866-1 图 2 卵总蛋白质谱图 Fig. 2 Mass spectrogram of total proteins |
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表 1 特异性狀段搜库结果（unique peptides≥2) Table 1 Unique peptide search results |
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图 3 三库鉴定肽段分布旭日图 Fig. 3 Three library identification peptide distribution map |
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表 2 高可信蛋白注释结果 Table 2 Highly confident protein annotation results |
本研究基于褐黄血蜱卵特异性肽段鉴定蛋白53种，其中高可信蛋白12种。登录Uniprot数据库进行搜索、比对显示，仅cds.Contig217、cds.Contig27530和cds.Contig6575有高同源性蛋白(identity≥70%)，另外9种高可信蛋白无高同源性蛋白(identity < 70%)，这充分说明蜱类卵蛋白信息尚不充足。
唾液腺转录组翻译文库(GSE67247)中的Contig217推定蛋白序列206个氨基酸残基，与微小扇头蜱属的Rhipicephalus zambeziensis和Rhipicephalus microplus的肌动蛋白(actin)相似性100%[14]，与非洲钝缘蜱(Ornithodorus moubata)的相似性99%[15]，由此断定，cds.Contig217为褐黄血蜱的actin。Actin几乎存在于所有的肌肉和非肌肉细胞结构[16]，参与细胞运动和胞内运输[17]，该蛋白也存在于蜱卵中，它可能是构成卵原生质网的主要成分。
在本研究检出的特异性肽段中，107个肽段与cds.Contig6575匹配。笔者基于Contig6575克隆出其mRNA全长(GenBank ID: MH891495)，它编码的氨基酸序列与希伯来花蜱(Amblyomma hebraeum)的卵黄蛋白原Ⅱ(vitellogenin 2，Vg-2)高度相似(70.7%)，故认为它是褐黄血蜱的卵黄蛋白原；107个特异性肽段匹配于中肠转录组翻译文库(GS69721)中cds.Contig6575的不同部位(图 4)，即在蜱类中肠合成的该蛋白原未经Vg转化为Vn的修饰过程[18-20]，而是直接为卵巢所用，储存于卵中。
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图 4 希伯来花蜱Vg-2(Uniprot ID: V9NJJ9)与cds. Contig6575相似性比对及褐黄血蜱卵中Vg-2特异性肽段分布图 Fig. 4 The homology comparison between Amblyomma hebraeum Vg-2 (Uniprot ID: V9NJJ9) and cds. Contig6575 and the distribution of Vg-2 unique peptides in Haemaphysa-lis flava eggs |
在之前的研究中，从褐黄血蜱唾液中检出三种卵黄蛋白原，它们与长角血蜱的Vitellogenin 1、Vitellogenin 2、Vitellogenin 3相似度依次为86.72%、87.8%、84.3%[21]。基于褐黄血蜱唾液腺转录组文库[22]中相应的Unigene克隆出的三种蛋白编码基因见GenBank:MH178299、MH178300、MH178301。本研究显示，褐黄血蜱卵无上述三种卵黄蛋白原，即它们不是胚胎发育所需的营养物质。已有研究表明，蜱类卵黄蛋白原有两大主要功能，其一由蜱脂肪体和中肠合成[23]，经卵巢转化为卵黄蛋白[11]，储存于卵中，满足胚胎发育中的营养需求；其二属于载脂蛋白超家族成员，参与脂类物质的转运[9]。结合先前的研究发现[24]，上述三种卵黄蛋白原在唾液腺中表达，而中肠中不表达，故笔者认为上述三种卵黄蛋白原的作用重在转运营养物质，之前人们分离、鉴定的蜱的卵黄蛋白原的生物作用需要进一步考察确定。
高可信蛋白cds.Contig27530与Rhipicephalus pulchellus的Putative secreted peptide相似率为75.9%，但其功能不得而知。
登录Uniprot数据库，搜索、比对结果显示：cds.Contig23972、cds.Contig228、cds.Contig28无高同源蛋白，cds.Contig11351、cds.Contig8352、cds.Contig58213暂被注释为uncharacterized protein，此两类蛋白结构特点和生物活性尚无法预知。
以HPEVKEWTR、SECRKTQGSSQLTVGFTCLNR、VRELGTVGVLPSTYPVTLEEK、TIGPACTADCQR等特异性肽段搜库显示，褐黄血蜱卵中含有与蛋白编号A5Z1D7和G3MMR5同源的两种蛋白，它们并非唾液腺和中肠表达，故其来源、结构、活性及其编码基因均未可知。
利用LC-MS/MS技术进行蛋白质组学研究，鉴定出的蛋白数量与可利用的数据库完善程度密切相关，但由于人们对蜱卵内蛋白研究的缺失，以检出的资料搜索Uniprot蜱总科蛋白数据库仅成功鉴定两种高可信蛋白。考虑到卵内蛋白的来源无外乎消化系统和生殖系统，笔者构建了褐黄血蜱唾液腺转录组翻译文库和中肠转录组翻译文库，搜索、鉴定了10种高可信蛋白，但总体来说，种类较少。能够明确的两种功能蛋白中，Actin可能在胚胎肌肉组织形成中发挥作用；卵内的卵黄蛋白原家族蛋白仅有Vg-2，Vg-2为胚胎发育提供了营养保障。设法敲除或消减它们在卵中的含量，对蜱产卵率和卵孵化率有何影响，能否有作为抗原分子的潜力，有待进一步探究。为了探明褐黄血蜱卵中的更多蛋白及完善蜱类蛋白数据库，笔者正在构建褐黄血蜱生殖系统转录组文库。未来，笔者将对褐黄血蜱卵黄蛋白原家族在胚胎发育过程中的变化情况进行追踪，以期探明卵黄蛋白原的代谢通路及在胚胎发育过程中的消减情况，从而为根源防蜱提供理论参考。
4 结论从褐黄血蜱卵黄蛋白提取液中检出特异性肽段221条，由此鉴定蛋白53种，其中高可信蛋白12种，能够确定的功能蛋白有肌动蛋白、卵黄蛋白原Ⅱ(Vg-2)；Vg-2与卵黄蛋白(Vn)一级结构相同；Vg-2是蜱卵内存在的唯一一种卵黄蛋白原。
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