多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, Pm)是各种动物和人的共患性病原菌，是重点防控的疫病病原之一[1]。根据该菌荚膜抗原和脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)的不同，可以将其划分为A、B、D、E和F 5个血清型，不同的血清型常与特定的疾病相关[2-3]，其中感染牛的多杀性巴氏杆菌以B型为主，A和E型次之[2]。为了深入了解多杀性巴氏杆菌的致病机制，研究者们分别从免疫保护[4-5]、致病基因[6-8]乃至全基因组分析[9-10]等方向进行了研究。目前报道的Pm毒力因子包括荚膜、外膜蛋白、脂多糖、多杀性巴氏杆菌毒素、胞外酶、质粒以及一些毒力相关基因(如tbpA、ptfA等)[6-8]，但多杀性巴氏杆菌的毒力因子与致病性之间的关系尚不完全清楚。
细胞毒力因子脂多糖是一种血清型特异免疫原，能够激发宿主细胞的免疫应答和炎症反应[11]。LPS的免疫应答和炎症反应主要由巨噬细胞、树突细胞等免疫细胞表面受体——Toll样受体4(Toll-like receptors 4，TLR4)介导，TLR4可激活、引发一系列趋化因子和促炎性细胞因子的转录、表达和分泌，如提高白细胞介素-6 (IL-6)、白细胞介素-12 (IL-12)和肿瘤坏死因子α (TNF-α)等细胞因子的表达水平，调动炎症反应所需的炎性细胞和炎性分子，发挥机体天然免疫的重要防御作用[12-13]。目前，有少量研究报道巴氏杆菌LPS可以诱导激发TLR4依赖性的信号通路[14-15]。然而，评估多杀性巴氏杆菌不同毒力株的LPS成分对TLR4信号刺激的影响，尚未见报道[16]。在笔者实验室的前期研究中，从肉牛场分离到6株A型多杀性巴氏杆菌，并经感染小鼠的半致死量确定其毒力，分别确定了高毒力株PmCQ2(LD50 2.2×105 cfu)和低毒力株PmCQ6(LD50 1.14×108 cfu)[17]。本试验用PmCQ2和PmCQ6的LPS分别刺激小鼠巨噬细胞，观察TLR4的表达及炎症因子TNF-α和IL-12p40的分泌情况，分析牛A型多杀性巴氏杆菌不同毒力株LPS对小鼠巨噬细胞TLR4-NF-κB信号通路的作用，为阐述不同毒株LPS刺激细胞信号调节及其作用机制，以及了解巴氏杆菌LPS的致病机制提供重要的理论基础。
1 材料与方法 1.1 细胞株及菌株小鼠巨噬细胞(RAW264.7，购自中国科学院昆明动物研究所)；牛A型多杀性巴氏杆菌(高毒力株PmCQ2、低毒力株PmCQ6)，由本实验室分离保存，并经感染小鼠半致死量确定其毒力[17]。
1.2 药品与试剂新生胎牛血清(FBS)和DMEM/F12培养基购自美国Gibco公司，大肠杆菌脂多糖购自Sigma，鼠抗IκBα、p-IκBα、NF-κBp65和β-actin抗体、HRP标记的羊抗鼠二抗购自美国Cell Signaling，鼠抗TLR4购自北京博奥森，小鼠TNF-α和IL-12p40 ELISA试剂盒购自MultiSciences，快速银染试剂盒、ECL发光试剂盒购自碧云天，脂多糖抽提试剂盒购自iNtRON。
1.3 牛A型多杀性巴氏杆菌脂多糖的提取与鉴定将PmCQ2和PmCQ6分别接种于马丁肉汤培养基，于37 ℃、180 r·min-1培养16~18 h。利用脂多糖提取试剂盒分别提取高毒力株脂多糖(LPSPmCQ2)和低毒力株脂多糖(LPSPmCQ6)。对纯化的LPS用10%的分离胶进行SDS-PAGE电泳，之后进行银染分析。
1.4 小鼠巨噬细胞培养和分组RAW264.7细胞培养在含有10% FBS、1%青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基中，5% CO2、37 ℃中培养1~2 d传代，在细胞对数生长期时进行试验。试验分组如下：对照组(no treatment, NT, 下同)，正常培养的RAW264.7细胞，以不同培养时间取样；LPS组，细胞添加终浓度1.0 μg·mL-1的LPS[9, 18]，分别培养20 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h后取样，收集细胞沉淀，分别用于提取总蛋白、核蛋白和总RNA。每组设3次重复。
1.5 实时荧光定量PCR检测LPS刺激下RAW264.7细胞内TLR4 mRNA的表达RAW264.7细胞培养至对数生长期，取经终浓度1.0 μg·mL-1 LPS刺激不同时间的样品及未处理对照，离心收集细胞，采用Trizol法抽提RNA，并反转录成cDNA。TLR4和内参GAPDH的引物由上海Invitrogen公司合成，TLR4(上游：5′-GCTTTCACCTCTGCCTTCAC-3′；下游：5′-CGAGGCTTTTCCATCCAATA-3′)、GAPDH(上游：5′-GGGTGGTCCAGGGTTTCTTACT-3′；下游：5′-AGGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′)。定量PCR反应体系：2×SYBR Green real-time PCR混合液10 μL，模板cDNA 2 μL，上、下游引物各0.5 μL，加水至20 μL。扩增条件：94 ℃ 3 min，40个循环(94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)，72 ℃延伸5 min，利用Bio-Rad CFX Manager实时荧光定量PCR仪进行检测。结果使用比较阀值法进行定量分析，其计算方法是：目的基因相对表达倍数=2-△△Ct [19]。
1.6 ELISA法测定LPS介导的RAW264.7细胞因子释放取对数生长期RAW264.7细胞，加入终浓度1.0 μg·mL-1的LPS[9, 18]刺激RAW264.7细胞，于37 ℃分别孵育1、3、6、12、24 h后，以及未刺激对照细胞，离心取适量细胞上清液，按ELISA试剂盒操作说明分别测定TNF-α和IL-12p40的浓度。
1.7 免疫印迹参照以前的试验方法[10, 20]，收集细胞进行裂解以获取蛋白，BCA方法测定蛋白质浓度。每个泳道加样30 μg总蛋白，经10% SDS-PAGE胶200 V、45 min电泳分离，然后经200 V、60 min转移至PVDF膜上；含5%脱脂奶粉的TTBS缓冲液(200 mmol·L-1 Tris，1.5 mol·L-1 NaCl，0.1% Tween-20，pH7.5)孵育封闭2 h，分别加入相应的稀释抗体4 ℃过夜杂交；TTBS缓冲液洗膜后加入HRP标记的二抗杂交，37 ℃孵育1 h。洗膜后加ECL发光试剂，利用Gel Doc进行图像采集。
1.8 统计学分析试验数据以“x±sx”形式表示，试验重复3次。试验数据采用配对t检验进行统计分析，P < 0.05认为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 牛A型多杀性巴氏杆菌脂多糖的提取及鉴定采用脂多糖抽提试剂盒方法分别提取牛A型多杀性巴氏杆菌高毒力株脂多糖(LPSPmCQ2)和低毒力株脂多糖(LPSPmCQ6)，经银染后用ImageJ软件进行灰度分析，结果如图 1所示，以大肠杆菌LPS标准品为参照，获得纯度较高的LPSPmCQ2和LPSPmCQ6，其浓度分别为1.94和2.14 μg·μL-1。
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1. LPSPmCQ6提取物；2. LPSPmCQ2提取物；3~7.大肠杆菌LPS标准品，其上样量分别是0.625、1.25、2.5、5、10 μg。箭头所示为LPS，黑色方框为灰度分析选取范围 1. LPS of PmCQ6; 2. LPS of PmCQ2; 3-7. Contained 0.625, 1.25, 2.5, 5 and 10 μg of E.coli LPS, respectively, for plotting a standard curve to quantitate LPS in the 2a-protein preparation. The arrow is shown as LPS, and the black box is the selection range for grayscale analysis 图 1 牛A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2和PmCQ6脂多糖的鉴定 Fig. 1 Characterization of LPSPmCQ2 and LPSPmCQ6 by SDS-PAGE and sliver stain |
用终浓度为1.0 μg·mL-1 LPSPmCQ2或LPSPmCQ6分别刺激RAW264.7细胞，在不同时间点(NT、20、60、180、360、720 min)分别收集细胞并提取细胞RNA。以GAPDH为内参，经Real-time PCR检测(图 2)显示：当LPSPmCQ2、LPSPmCQ6分别处理细胞后，细胞内TLR4 mRNA的表达均增多，与未处理组比较，差异均不显著，且LPSPmCQ2和LPSPmCQ6处理组间细胞内TLR4 mRNA表达的变化趋势基本一致。
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图 2 LPSPmCQ2和LPSPmCQ6诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7基因TLR4 mRNA的表达 Fig. 2 Expression of TLR4 mRNA in RAW264.7 cells induced by LPSPmCQ2 and LPSPmCQ6 |
Western blot结果显示，LPSPmCQ2和LPSPmCQ6均能诱导细胞膜受体TLR4的表达，二者的表达趋势基本一致，虽在处理60 min后两个处理组间存在显著差异(P < 0.05)，但差异量较小。当LPSPmCQ2和LPSPmCQ6分别刺激细胞60 min后，其表达量均达到最高，其中高毒力株LPSPmCQ2处理组，其表达量是对照组的2.6倍，低毒力株LPSPmCQ2处理组是对照组表达量的2倍，之后TLR4表达量均略有下降，见图 3。试验结果表明LPSPmCQ2和LPSPmCQ6均能直接诱导TLR4的表达进而作用TLR4下游信号通路。
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* 表示差异显著(P < 0.05)，下图同；箭头所示为目标蛋白TLR4，大小约90 ku The star means significant difference between the treatments (P < 0.05). The same as blow. The arrow shows the TLR4 protein, which is about 90 kD in size 图 3 牛A型多杀性巴氏杆菌LPSPmCQ2和LPSPmCQ6对RAW264.7细胞膜受体蛋白TLR4表达的影响 Fig. 3 Expression of TLR4 in RAW264.7 cells induced by LPSPmCQ2 and LPSPmCQ6 at different time points |
分别收集LPSPmCQ2、LPSPmCQ6处理的细胞培养上清液，采用ELISA试剂盒检测经LPS刺激0(NT)、20 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h后小鼠巨噬细胞分泌的TNF-α和IL-12p40的表达情况。结果显示，经LPS激活后，细胞内TNF-α在0~12 h内分泌量逐渐上升，1~3 h内上升幅度显著，后上升幅度逐渐减小，12~24 h期间TNF-α表达量趋于平稳(图 4A)；IL-12p40在0~6 h内分泌量较为稳定，6~24 h内分泌量大幅上升(图 4B)；高、低毒力株LPS对小鼠巨噬细胞内TNF-α和IL-12p40的表达影响基本一致，这表明高、低毒力株LPS对小鼠巨噬细胞炎症因子分泌的影响无显著差异(P>0.05)，暗示高、低毒力株LPS的毒力可能无差异。
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图 4 牛A型多杀性巴氏杆菌高、低毒力株LPS对RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-12p40的影响 Fig. 4 Expression of TNF-α and IL-12p40 in RAW264.7 cells induced by LPSPmCQ2 and LPSPmCQ6 at different time points |
用LPSPmCQ2和LPSPmCQ6分别处理RAW264.7细胞0、20、60、180、360 min后，发现两组处理中的IκBα磷酸化水平均随着时间的推移，逐渐升高，但无显著差异(P>0.05)，见图 5。同时，对核转录因子NF-κBp65的核转位检测中发现(图 6)，LPSPmCQ2处理组，在刺激细胞60 min后，NF-κBp65在核内表达量最高；而LPSPmCQ6处理组在处理180 min时，核内NF-κBp65表达量最高。此外，仅在处理180 min时，LPSPmCQ6处理组与LPSPmCQ2处理组有显著性差异(P < 0.05)，其他作用时间点二者均无显著差异。以上结果表明，牛A型巴氏杆菌高、低毒力株LPS对TLR4介导的IκBα-NF-κB信号通路的作用未见显著差异，暗示高、低毒力株LPS的毒力可能无差别。
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图 5 牛A型多杀性巴氏杆菌高、低毒力株LPS对RAW264.7细胞内IκBα磷酸化的影响 Fig. 5 Phosphorylation of IκBα in RAW264.7 cells induced by LPSPmCQ2 and LPSPmCQ6 at different time points |
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图 6 牛A型多杀性巴氏杆菌高、低毒力株LPS对RAW264.7内NF-κBp65活化的影响 Fig. 6 Effect of NF-κB activation in RAW264.7 cells induced by LPSPmCQ2 and LPSPmCQ6 at different time points |
LPS在细菌致病过程扮演重要的角色，可以刺激动物机体发生体液免疫，同时因其独特的作用，被当作毒力因子和血清型特异免疫原[16, 21]。LPS的识别是通过与细胞膜受体TLR4发生结合，这种结合是因类脂A能够识别结合到TLR4的胞外富含亮氨酸重复结构域，从而导致特异性配体信号的感知传导，胞内信号级联的始发和先天免疫反应的激活，最终导致NF-κB诱导的炎性细胞因子的释放和黏附分子的表达，以及黏附分子吸引白细胞到感染部位[22]。Galdiero等[14]研究表明，多杀性巴氏杆菌菌体和从多杀性巴氏杆菌中抽提的LPS均能够使嗜中性粒细胞有效黏附到分离的牛内皮细胞上，并在LPS刺激2~4 h后，嗜中性粒细胞转移到内皮细胞层上。巴氏杆菌LPS也能够刺激小鼠脾细胞，激活TLR4-NF-κB通路[23]，诱导表达、释放各种促炎症的和免疫调节的细胞因子，如IL-1α、TNF-α、IFN-γ和IL-12p40[18]。然而，直接比较多杀性巴氏杆菌LPS与市售的LPS制剂对TLR4信号通路的影响，或评估不同的多杀性巴氏杆菌LPS成分对TLR4信号刺激的效果，目前没有可获得的数据和相关报道[16]。前期研究中，本实验室分离到6株A型多杀性巴氏杆菌，并确定了高毒力株PmCQ2和低毒力株PmCQ6[17]。在本试验中，笔者分别以PmCQ2和PmCQ6的LPS分别刺激RAW264.7细胞，发现两组LPS均能够显著提高细胞因子TNF-α和IL-12p40的分泌表达，提示两组LPS均能够激活经典的TLR4信号。
针对革兰阴性细菌细胞壁的主要成分LPS的免疫应答和炎症反应主要由TLR4介导。LPS激活TLR4受体后能够招募特异接头蛋白，在一系列受体相关酶和激酶的作用下，激活下游IKK，促使IκBα磷酸化并随后泛素化降解，NF-κB复合体解体，NF-κB转位入核，进而引起包括炎症细胞因子等目的基因的转录[24]。本试验结果显示牛A型巴氏杆菌高、低毒力株LPS均能够提高IκBα磷酸化，激活NF-κB；且两组LPS对小鼠巨噬细胞TLR4-NF-κB信号途径的影响无差别，这暗示牛A型巴氏杆菌高、低毒力株LPS对小鼠巨噬细胞的毒性水平可能无差异，推测不同毒力的牛A型巴氏杆菌对小鼠巨噬细胞毒力的高低是由其他毒力因子决定，与LPS无明显相关性。
目前报道的杆菌的毒力因子包括荚膜、外膜蛋白、脂多糖、多杀性巴氏杆菌毒素、胞外酶、质粒以及一些毒力相关基因(如tbpA、ptfA等)[6-8]；而且笔者课题组前期通过比较PmCQ2和PmCQ6的基因组发现，PmCQ2有5个编码基因和2个插入片段是PmCQ6中所没有的；进一步分析A型多杀性巴氏杆菌基因组，基因PmCQ2_5g0025、PmCQ2_7g0006和PmCQ2_5g0013存在于高毒力株PmCQ2和Pm36950中，而在低毒力株PmCQ6中缺失[9]。笔者认为这些基因和插入片段将是后期研究多杀性巴氏杆菌毒力因子的重要靶标。总之，本研究初步排除了LPS与多杀性巴氏杆菌对小鼠巨噬细胞的毒力之间的相关性，对进一步探究多杀性巴氏杆菌的致病机制提供了理论基础，为巴氏杆菌引起的感染性疾病防治及基因工程疫苗的研究提供基础与思路。
4 结论利用牛A型多杀性巴氏杆菌高毒力株LPSPmCQ2和低毒力株LPSPmCQ6分别刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7，经检测分析发现：高、低毒力株均能显著提高TLR4的表达，并诱导细胞因子TNF-α和IL-12p40的分泌表达；同时，均能诱导IκBα磷酸化，促进NF-κBp65核转位，但二者没有显著差异。牛A型多杀性巴氏杆菌高、低毒力株LPS均能参与TLR4介导的小鼠巨噬细胞免疫应答，且二者对TLR4介导的IκBα-NF-κB信号通路的作用无显著差异。
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