2. 青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室, 成都 610041
2. Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization, Chengdu 610041, China
牛轮状病毒(bovine rotavirus, BRV)是引起犊牛腹泻的重要病原，给全世界养牛业带来巨大的经济损失P[1]。血清流行病学调查显示，我国牛群中BRV血清抗体阳性率达到90%以上，而我国目前尚无可供使用的疫苗，表明BRV感染严重[2]；本实验室前期对青藏高原部分地区牦牛的病原流行病学调查结果显示，牦牛腹泻粪便中BRV的检出率高达60%~98.86%，表明我国牦牛BRV的感染较为普遍，是导致犊牦牛腹泻的重要原因[3-4]。
BRV属于呼肠弧病毒科轮状病毒属，无囊膜，由三层衣壳构成，其基因组为双链RNA，分为11个节段，共编码6种结构蛋白(VP1~VP4、VP6、VP7)和6种非结构蛋白(NSP1~NSP6)[5]，其中VP4、VP6、VP7这3种结构蛋白的免疫原性与轮状病毒的抗原特性有重要关系[6]。VP4和VP7蛋白共同组成轮状病毒的外衣壳，二者都是重要的中和抗原，可以诱导机体产生中和抗体[7]。VP4蛋白是胰酶敏感蛋白，可在胰酶的作用下裂解成带氨基末端的VP8和带羧基末端的VP5两个片段，进而提高轮状病毒的感染能力和细胞穿入能力，增强轮状病毒的繁殖能力[8]；VP7蛋白是一种钙离子结合蛋白，对促进病毒颗粒的成熟和维持病毒稳定性极其重要[9]。VP6蛋白是轮状病毒的内衣壳蛋白，同时也是病毒分组的特异性抗原，具有较强的免疫原性，根据VP6抗原性的不同，可将轮状病毒分为A~G七个群，感染牛的主要是A群轮状病毒[10]。
根据轮状病毒的命名原则，11个基因节段分别对应不同的基因型，具体表示为：VP7-VP4-VP6-VP1-VP2-VP3-NSP1-NSP2-NSP3-NSP4-NSP5，相对应的基因型为Gx-P[x]-Ix-Rx-Cx-Mx-Ax-Nx-Tx-Ex-Hx，通过比对每个基因节段对应的基因型编码区核苷酸序列的一致性，来确定每个毒株的基因型[11]。通常以轮状病毒VP4决定的P型和VP7决定的G型代表轮状病毒基因型[12]。迄今为止，在BRV中已发现12个G型和11个P型，其中G6、G8、G10和PP[1]、P[5]、P[11]基因型在BRV中最常见[13]。轮状病毒不同基因型之间交叉免疫保护性差[14]，因此确定流行毒株的基因型对BRV的防控很重要。
病毒的分离鉴定是研究其生物学特性和疫苗研制的基础，有着重要的意义[8]。目前国内已有对BRV成功分离鉴定的报道，确定分离到的基因型有G6PP[1]、G6P[5]、G10P[11]型[15-18]。另外有部分毒株确定为G6和G10型，但未鉴定出P型[19-20]。1985年，张敏等[21]曾分离得到了牦牛源BRV毒株，但未确定其基因型；本实验室前期分离得到了牦牛源BRV毒株，并扩增到部分VP4片段，确定了P[11]和P[14]型BRV在牦牛中的存在[3]，但还未见对牦牛源BRV毒株G型研究以及完整VP4和VP7基因特征的研究报道。鉴于BRV是青藏高原地区引起牦牛腹泻的重要原因[3-4]，本研究分离得到一株致细胞病变的牦牛源BRV，并进一步确定了其分子特征。
1 材料与方法 1.1 临床样本及细胞系用于病毒分离的5份牦牛腹泻粪便样本采集自四川省阿坝藏羌自治州红原县，采集时间为2017年6月，样本经RT-PCR检测证实为BRV阳性，由本实验室保存；病毒的分离采用MA-104(恒河猴胚肾细胞)传代细胞系，由本实验室保存。
1.2 主要试剂及仪器TrizolTM Reagent、PrimescriptTM、pMD19-T克隆载体、2× Taq PCR Master Mix等购于TaKaRa公司；胶回收试剂盒购于OMEGA公司。DNA Marker、E. coli DH5α感受态细胞购于宝生物工程(大连)股份有限公司；DMEM培养基、胎牛血清购自GIBCO公司；胰蛋白酶、戊二醛(25%)购自SIGMA公司；异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG购于ABCAM公司；兔抗牦牛源牛轮状病毒VP6重组蛋白的阳性血清由本实验室制备；高速离心机5804购自Eppendor公司；基因扩增仪TC-96/G/H(b)C购于杭州博日科技有限公司；凝胶成像系统VersaDov2000 (Bio-Rad公司)；OLMPS荧光倒置显微镜(Olympus公司，日本)；CO2细胞培养箱(Thermo公司，美国)。
1.3 临床样本的处理及接种将粪便样本与PBS按照1:5的比例涡旋混合，反复冻融3次，置于4 ℃的离心机中10 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液过0.22 μm滤器除菌后加入终浓度为15 μg·mL-1的胰酶，37 ℃激活1 h，接种到铺满单层MA-104细胞的25 cm2细胞瓶中，37 ℃孵育1 h，然后弃掉悬液，加入含1 μg·mL-1胰酶的无血清DMEM维持液，置于37 ℃ 5% CO2细胞培养箱中培养，逐天观察，接毒后96 h收毒。按上述方法继续盲传，直至出现细胞病变，待细胞病变达到70%以上时收毒。
1.4 病毒的纯化及毒价测定待细胞病变稳定出现3代后，对分离株进行蚀斑纯化。纯化后的细胞培养物加入终浓度为15 μg·mL-1的胰蛋白酶，37 ℃激活1 h后，用DMEM营养液做10倍梯度稀释，从10-1稀释到10-12；依次吸取100 μL病毒液接种到长成单层MA-104细胞的96孔板上，每一个稀释度接种8个孔，37 ℃孵育1 h，然后弃掉悬液，加入胰蛋白酶浓度为1 μg·mL-1无血清DMEM维持液，置于37 ℃ 5% CO2细胞培养箱培养，逐天观察并记录细胞病变情况，同时设立未接毒的正常细胞作对照。根据Reed-Muech法计算病毒的TCID50。
1.5 RNA的提取及反转录取已纯化的病毒液，-80 ℃反复冻融3次，10 000 r·min-1离心10 min，上清液按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA，用PrimeScriptTMRT试剂将RNA反转录成cDNA，置于-20 ℃待用。
1.6 病毒的鉴定 1.6.1 RT-PCR鉴定采用本实验室建立的RT-PCR方法[22]，对分离的病毒进行检测，PCR产物经2%琼脂糖电泳进行鉴定，并将阳性PCR产物送生物工程(上海)股份有限公司测序。
1.6.2 间接免疫荧光鉴定取“1.4”中纯化后的病毒液0.1 mL按“1.3”中方法接种于6孔板中，设3个复孔，同时设置空白阴性对照，加入维持液培养一段时间后，弃去维持液并用pH 7.4的PBS洗涤3次，每次1 min。每孔加入80%丙酮1 mL，在4 ℃条件下固定10 min，弃掉丙酮后用PBS洗涤3次，每次1 min。每孔加入1 mL 1:400倍稀释的兔抗牦牛源牛轮状病毒VP6重组蛋白的阳性血清作为一抗，37 ℃孵育40 min。弃去一抗，PBS洗涤3次，再加1:1 000倍稀释的FITC标记的羊抗兔IgG作为二抗，每孔1 mL，37 ℃孵育40 min。弃去二抗，再用PBS洗涤5次以上，采用倒置荧光显微镜观察。
1.6.3 病毒的电镜观察将已纯化的细胞毒接种于长成单层MA-104细胞的25 cm2细胞瓶中，待细胞出现明显的CPE后加入终浓度为2.5%的戊二醛，4 ℃过夜。用刮刀刮取固定好的细胞层，固定包埋后做超薄切片，在透射电镜下观察。
1.7 分离株VP4、VP6、VP7完整基因的扩增分析GenBank中已发表的所有BRV的VP4、VP6、VP7完整基因序列，采用Primer 5.0引物设计软件，设计扩增其完整基因的引物，引物信息见表 1。PCR扩增条件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40个循环；72 ℃ 10 min。反应体系：采用25 μL体系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL, 上、下游引物各1.5 μL，病毒分离株的cDNA 2 μL，ddH2O补足25 μL。
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表 1 BRV VP4、VP6、VP7完整基因扩增引物信息 Table 1 Primer information of BRV VP4, VP6, VP7 complete genes |
扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像系统进行检测。目的条带用胶回收试剂盒回收，连接pMD19-T载体后，转化到DH5α感受态细胞中，筛选重组质粒，送生物工程(上海)股份有限公司测序，利用RotaC软件进行分型[23]。
1.8 分离株VP4、VP6、VP7完整基因的遗传演化和重组分析应用DNAStar软件将本研究获得的序列与GenBank中已登录的BRV VP4、VP6、VP7完整基因序列分别进行比对，应用MEGA 6.0软件中的Neighbor-joining法(Bootstrap值为1 000)构建进化树。使用RDP 4.0软件和SimPlot 3.5.1软件进行重组分析。
2 结果 2.1 病毒的分离、纯化及毒价测定5份阳性病料接种MA-104细胞后，1份盲传至第3代开始出现明显的细胞病变(CPE)，连续传代至第7代后，细胞病变稳定出现。在接毒后15 h，细胞出现圆缩、拉网状，20 h后细胞界限不清晰，30 h后细胞大面积脱落，出现明显CPE，正常MA-104阴性对照细胞没有发生病变。经蚀斑纯化，病毒滴度为108.39TCID50·mL-1。
2.2 病毒的鉴定 2.2.1 RT-PCR鉴定从每一代细胞培养物中均扩增出231 bp的目的条带，测序结果经BLAST比对，与GenBank中BRV VP6基因序列一致性为96%~98%，从分子水平证实分离得到的病毒为牦牛源BRV(图 1)。
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M. DNA相对分子质量标准(markerⅠ)；P.阳性对照；N.阴性对照；1~7. HY-1株的第1~7代培养物 M. DNA markerⅠ; P. Positive control; N. Negative control; 1-7. The 1st to the 7th cultures of HY-1 strain 图 1 HY-1株RT-PCR检测结果 Fig. 1 RT-PCR test results of HY-1 strain |
荧光显微镜下观察，未接毒的细胞没有出现荧光，阴性对照成立。分离株感染细胞可见明亮的特异性荧光，荧光细胞的数量和荧光强度随感染时间的延长而增加(图 2)，从血清学水平证明分离得到牦牛源BRV, 命名为HY-1株。
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A.阴性对照细胞；B.病毒感染后12 h的细胞；C.病毒感染后24 h的细胞；D.细胞对照 A.Negative control cells; B. Cells at 12 h post virus infection; C. Cells at 24 h post virus infection; D. Control cells 图 2 HY-1株间接免疫荧光鉴定(200×) Fig. 2 Indirect immunofluorescence of HY-1 strain(200×) |
透射电镜观察HY-1株的细胞培养物，能见到直径为60~80 nm的圆形病毒颗粒(图 3)。
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图 3 HY-1株细胞培养物的透射电镜图 Fig. 3 Transmission electron micrograph of cell culture of HY-1 strain |
测序结果显示，HY-1株VP4完整基因的序列长度为2 352 bp，编码区长度为2 316 bp，共编码772个氨基酸。核苷酸序列输入RotaC分型软件，显示为P[11]型，与GenBank中全部12条P[11]型BRV的核苷酸一致性为91.2%~96.9%，氨基酸一致性为96.2%~98.2%，与国内DQ-75株一致性最高。与GenBank中全部12条P[11]型BRV的完整VP4氨基酸序列比对发现，HY-1株发生了4处特有的氨基酸变异(T216K、R248G、Q534R、A586T)。与GenBank中仅有的1株中国P[11]型VP4完整基因毒株DQ-75进行氨基酸比对发现，HY-1株发生14处氨基酸变异(R2A、N59S、C80Y、N98S、A198V、T216K、Q244R、R248G、L471S、R502K、Q534R、T542S、A586T、S642N)，其中7处发生在轮状病毒与宿主受体结合区域VP8，见表 2。
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表 2 HY-1株与中国P[11]型DQ-75株VP8蛋白氨基酸比较 Table 2 Amino acid changes in the VP8 protein of HY-1 strain compared Chinese P[11] strain DQ-75 |
HY-1株与GenBank中全部48条BRV的VP4完整序列推导氨基酸构建的系统发育树显示，HY-1株与P[11]型BRV聚在一起，与中国DQ-75株和北美B223株(GenBank号：GU181281.1、M92986.1)遗传关系最近，共聚在一大支，HY-1株单独聚为一小支。由于篇幅原因，本进化树只显示了P[11]型毒株(图 4)。
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图 4 HY-1株及其他BRV毒株完整VP4基因推导氨基酸进化树 Fig. 4 Phylogenetic tree of HY-1 strain and other BRV strains based on deduced amino acid sequences of complete VP4 gene |
测序结果显示，HY-1株VP7完整基因的序列长度为1 062 bp，编码区长度为978 bp，共编码326个氨基酸。核苷酸序列输入RotaC分型软件，显示为G6型，与GenBank中G6型BRV的核苷酸一致性为80.6%~90.8%，氨基酸一致性为81.0%~97.5%，一致性最高的为印度RUBV319和C91株。与GenBank中全部99条G6型BRV的VP7氨基酸序列比对，发现HY-1株发生了1处特有的氨基酸变异(E97V)。HY-1株与GenBank中仅有的2株中国G6型CHLY和HQ09株完整VP7序列的核苷酸一致性分别为85.5%、84.5%，氨基酸一致性均为91.7%，与CHLY和HQ09株的VP7氨基酸序列相比，HY-1株发生了27处氨基酸变异(T14I、M22I、L39F、I40M、T46A、I47V、I48T、A66T、D69N、S73N、P/L75S、V87I、E97V、D100N、L118F、E130D、Q148L、T187M、I209T、N211D、D213N、N238D、A242T、T278A、I287V、T309A、F317L)，见表 3。
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表 3 HY-1株与中国G6型毒株CHLY、HQ09株VP7蛋白氨基酸比较 Table 3 Amino acid changes of VP7 protein of HY-1 strain compared with Chinese G6 strains CHLY and HQ09 |
HY-1株与GenBank中全部224条BRV的VP7完整序列推导氨基酸构建的系统发育树显示，HY-1株与G6型BRV聚在一起，与印度P-43、RUBV319、C91、PBC、B82、B111株(GenBank号：HM591496.1、EF199501.1、JN638724.1、JX442784.1、JX442766.1、JX442777.1)遗传关系最近，共聚在一大支，HY-1株单独聚为一小支。由于篇幅原因，本进化树只显示了部分G6型代表性毒株(图 5)。
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图 5 HY-1株及其他BRV毒株完整VP7基因氨基酸进化树 Fig. 5 Phylogenetic tree of HY-1 strain and other BRV strains based on deduced amino acid sequences of complete VP7 gene |
测序结果显示，HY-1株VP6完整基因的序列长度为1 356 bp，编码区长度为1 191 bp，共编码397个氨基酸。核苷酸序列输入RotaC分型软件，显示为I2型，与GenBank中I2型BRV的核苷酸一致性为86.3%~95.1%，氨基酸一致性为90.4%~99.2%。与GenBank中仅有的2株中国完整VP6序列DQ-75和HQ09株的核苷酸一致性为94%和91.4%，氨基酸一致性均为98.5%。比对HY-1株与DQ-75和HQ09株的VP6核苷酸序列发现，HY-1株发生了57处核苷酸变异(G35A、A89G、A104G、A135C、A158G、A185G、G188A、A194G、A236G、T245C、C269T、C/G299A、T326C、A338G、A398G、A399G、C437T、T452C、T482C、A/T509G、G536A、C548T、C569T、A581G、T/A620C、G650A、T665C、G671A、T699C、C/A704G、G755A、C797T、G809A、T854C、G860A、C863T、A872G、T887C、A896G、G959A、A968G、A977C、G981A、C989T、A1022T、A1046G、A1079G、T1106C、C1166T、T1167C、T1181C、G1203A、C1231T、A1252G、T1251G、A1269G、G1336A)；比对HY-1株与DQ-75和HQ09株的VP6氨基酸序列，发现HY-1株共发生了3处氨基酸变异(I38L、R126G、V320I)。
HY-1株与GenBank中全部35条BRV的VP6完整序列核苷酸构建的系统发育树显示，HY-1株与I2型BRV聚在一起，与印度86、BRV133、M-1、CC156、Bov1毒株(GenBank号：GU984759.1、JF720875.1、HM235508.1、JF720879.1、JF742649.1)遗传关系最近，共聚在一大支，与中国毒株DQ-75和HQ09株有显著遗传距离，HY-1株单独聚为一小支。由于篇幅原因，本进化树只显示了部分I2型代表性毒株(图 6)。
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图 6 HY-1株及其他BRV毒株完整VP6基因核苷酸进化树 Fig. 6 Phylogenetic tree of HY-1 strain and other BRV strains based on complete VP6 gene nucleotide sequences |
牦牛BRV感染是引起犊牦牛腹泻的重要原因，对青藏高原地区牦牛的养殖造成严重的危害[3-4]。虽然曾有牦牛BRV分离的报道，但其分子特征却不清楚。本试验成功分离得到一株致细胞病变的G6P[11]型牦牛源BRV，该型在世界范围的牛群中广泛流行，对牛群的健康造成极大的危害[24-26]。在我国，已有G6PP[1]、G6P[5]、G10P[11]型BRV的存在，虽然G6型和P[11]型都曾分别有过报道，但G6P[11]型组合尚属首次发现[15-20]，丰富了我国BRV的分子特征资料，有必要进一步调查G6P[11]型在我国牛群中的流行情况，为BRV的防控提供参考。
轮状病毒的重配是其演化过程中的常见现象，不同毒株在同一宿主细胞内，基因节段之间可以相互作用，极易发生交换、交叉或重排，引起病毒的变异，导致基因重配毒株的出现[13, 27-28]。目前已有大量的文献显示，人、牛、猪等均有轮状病毒重配现象的出现[29-30]。本试验中HY-1株的VP4节段与我国牛源DQ-75株遗传关系最近，VP6和VP7节段分别与印度喜马拉雅地区牛源M-1和RUBV319株[31-32]遗传关系最近，因此HY-1株可能是DQ-75株与M-1和RUBV319株的重配毒株，笔者将进一步研究该毒株的基因组特征，为研究牦牛源BRV遗传演化提供参考。
VP4和VP7蛋白均是RV的中和抗原，可诱导机体产生中和抗体[7]。VP4蛋白可裂解为VP8和VP5两个片段，其中VP8亚基是VP4蛋白中和抗原的主要抗原位点[33]。本试验中的HY-1株VP4蛋白与国内BRV同型的毒株相比，在VP8区域发生了7处氨基酸变异(表 2)，可能会引起VP4蛋白抗原性的变化[33-35]。VP7蛋白中允许逃避抗体中和的突变位点集中在暴露于蛋白表面的7-1 (aa 87、91、94、96、97、98、99、100、201、211、213、238、291)和7-2 (aa 147、148、190、217、221、223、242、264)两个区域[36]，本试验中的HY-1株VP7蛋白与国内BRV同型的毒株相比，在7-1和7-2区域发生了8处氨基酸变异(表 3)，可能对VP7蛋白逃避抗体中和的能力产生影响，进而影响其毒力[7, 36-37]。
综上，牦牛源BRV与国内牛源BRV的VP4和VP7蛋白有多处重要氨基酸位点出现变异，有可能对HY-1株的毒力和抗原性产生影响[33-37]。进一步研究牦牛源BRV的VP4和VP7蛋白重要氨基酸位点变异对抗原性的影响，可以为BRV疫苗的研发提供参考。
4 结论成功分离得到1株能够致细胞病变的G6P[11]型牦牛源BRV，命名为HY-1株，首次证实了G6P[11]型BRV在我国的存在；HY-1株可能为中国牛源DQ-75毒株和印度牛源M-1和RUBV319株的重配毒株；HY-1株的VP4和VP7蛋白与国内同型毒株相比，有多处重要氨基酸位点出现变异，有可能对该毒株的毒力和抗原性产生影响，值得进一步研究。
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