仔猪生产是整个养猪生产中影响养猪生产效益最关键的环节。当前集约化养殖场的仔猪在断奶期易出现以“肠道氧化应激、水肿、炎症、消化功能紊乱、外来病原菌入侵、微生物区系失调、腹泻”为主的“仔猪断奶应激综合征”[1]。如何防治断奶仔猪应激综合征是现代养猪业急需解决的问题。饲料中添加抗生素可以促进畜禽生长，提高新生仔猪存活率，抗生素在畜禽生产中得到广泛的应用，然而抗生素具有药物残留和抗药性以及对环境的污染等危害。抗生素的替代品正成为动物营养研究的重点。绿原酸具有抗菌消炎、清热解毒、抗氧化、免疫调节、抗癌、降脂降压等作用，是国际公认的“植物黄金”[2]。橙皮苷来源丰富，价廉易得，具有丰富的药理活性，如抗氧化、免疫调节、抗菌抗炎、抗病毒等[3]。这两种天然植物提取物具备缓解“仔猪断奶应激综合征”出现的肠道氧化应激和外来病原菌入侵共同的药理特点。目前有关绿原酸和橙皮苷的研究主要集中在细胞和小鼠的研究上，王宇等[4]主要研究绿原酸对断奶仔猪消化吸收能力的影响，而在断奶仔猪上对橙皮苷和绿原酸抗氧化、免疫能力、肠道微生物区系研究甚少。
本试验旨在探究橙皮苷和绿原酸对断奶仔猪生产性能、抗氧化和免疫能力以及对肠道微生物区系的影响，为天然饲料添加剂的开发利用提供思路。
1 材料与方法 1.1 试验材料绿原酸和橙皮苷(纯度为95%和20%)购自湖南长沙上禾生物有限公司。CAT、T-SOD、ALT、AST、NOS、T-AOC、GR和GSH-Px活性检测试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司。逆转录试剂盒购自生工生物工程股份有限公司，Trizol和荧光定量PCR试剂及SYBR Green Ⅰ均购自Invitrogen。Western blot制胶和转膜等试剂自配，抗体均购自探生科技有限公司，显色液购自密理博有限公司。
1.2 试验设计与日粮组成选择40头初重为(8.97±1.48) kg的健康的((长白×大白)×荣昌猪)三元杂交(28±2) d断奶阉公仔猪，采用单因素完全随机设计，设4个处理：基础日粮组(CON)、基础日粮添加100 mg·kg-1 A杆菌肽组(BT)、基础日粮添加250 mg·kg-1绿原酸组(CHA)、基础日粮添加250 mg·kg-1橙皮苷组(HDN)。每组10个重复，每个重复1头猪。试验期共33 d，其中预试期5 d。采用单栏饲喂，自由采食和饮水。试验日粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 日粮组成及其营养水平(干物质基础) Table 1 Dietary composition and nutrient level (DM basis) |
准确记录每天喂料量和剩余量，正试期第1~28天早上8：00仔猪空腹称重。每组随机挑选5头体重相近公猪前腔静脉采血，肝素钠抗凝，于4 ℃、3 000 r·min-1，离心20 min，分离血浆。采血后屠宰取出内脏组织。准确称量胸腺、脾、空肠和回肠重量，测量空肠和回肠长度。准确称取50 g肝保存于－20℃。取20 cm空肠用生理盐水冲洗后刮取黏膜，液氮速冻后置于－80℃保存。取空肠和回肠中段以及结肠3 cm肠道组织于固定液中制作组织切片。用无菌棉线结扎结肠中段，在厌氧条件下对食糜和黏膜组织进行分离，置于－80℃保存备用。无菌采集结肠内容物10 g于－80℃保存备用。
1.4 仔猪生长性能与器官指数计算根据以下公式计算生长性能：平均日增重(average daily feed intake, ADG)=全期增重(g)/天数(d)；平均日采食量(average daily gain, ADFI)=全期采食量(g)/天数(d)；饲料转化率：料肉比(F/G)=饲料消耗/增重。
根据以下公式计算器官指数：脾脏指数(g·kg-1)=脾湿重(g)/猪活体重(kg)；胸腺指数(g·kg-1)=胸腺湿重(g)/猪活体重(kg)；空肠重量指数(g·kg-1)=空肠湿重(g)/猪活体重(kg)；回肠重量指数(g·kg-1)=回肠湿重(g)/猪活体重(kg)；空肠长度指数(cm·kg-1)=空肠长度(cm)/猪活体重(kg)；回肠长度指数(cm·kg-1)=回肠长度(cm)/猪活体重(kg)。
1.5 仔猪血浆和肝生化指标测定根据试剂盒说明，采用比色法测定血浆和肝中的总抗氧化能力(T-AOC)、一氧化氮合酶(NOS)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽还原酶(GR)、过氧化氢酶(CAT)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活力以及血浆谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力。
1.6 仔猪肠黏膜组织形态测定黏膜形态学测定参照Wang等[5]的方法进行，利用OPTPro图像处理软件进行绒毛高度和绒毛宽度等黏膜形态学指标的测定。
1.7 Western blot测定仔猪肠黏膜β防御素-2、热休克蛋白90和Toll样受体蛋白4蛋白水平空肠黏膜组织中β防御素-2(β-defensins-2，BD2)、热休克蛋白90(90 heat shock protein 90，HSP90)和Toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)蛋白水平采用免疫印迹法(Western blot)进行检测。
1.8 荧光定量PCR法测定仔猪肠黏膜TGF-β1、TNF-α和IL-8 mRNA丰度取空肠黏膜置于冰上剪细，装入1.5 mL离心管，加入小钢珠两颗和1 mL Total RNA Extractor，用高通量组织研磨仪处理后提取RNA。将mRNA用MMLV First Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录得到cDNA。根据GenBank中猪甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)(NM_00206359.1)、TGF-β1 (NM_214198.1)、TNF-α(NM214022.1)和IL-8(NM213867.1)mRNA序列，取保守区域设计引物:GAPDH(F：5′-GAAGGTCGGAGTGAACGGAT-3′，R：5′-CATGGGTAGAATCATACTGGAACA-3′)，TGF-β1(F：5′-GGAACACAGCCCTCATCTAAT-C-3′，R：5′-TCCTGTCGGAAGTCAATGTAGAG-3′)，TNF-α(F：5′-CCACGCTCTTCTGCCTACTGC-3′，R：5′-GCTGTCCCTCGGCTTTGA-3′)，IL-8(F：5′-GCATTCCACACCTTTCCACC-3′，R：5′-TCTTC-AAAAATATCTGTACAACCTTCTG-3′)，引物由生工生物工程股份有限公司合成。荧光定量PCR反应体系总体积为25 μL：Hotstart Fluo-PCR mix 12 μL，上下游引物(25 μmol·L-1)各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 10 μL。荧光定量PCR的反应条件：94 ℃预变性4 min；94℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环。每个样品设3个重复。采用比较Ct法进行相对定量表达差异的计算，目的基因的表达量=2-△△Ct，△△Ct=(Ct目的基因－Ct内参基因)试验组-(Ct目的基因-Ct内参基因)对照组，2-△△Ct表示的是试验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。
1.9 仔猪16S rDNA测序分析结肠微生物区系结肠内容物DNA提取参照试剂盒Power Fecal DNA Isolation Kit。DNA进行微生物高通量测序[6]。具体测定步骤：将检测合格样品DNA构建文库，回收目的Amplicon片段，用T4 DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase和T4 PNK将打断形成的粘性末端修复成平末端，再通过3′端加碱基“A”，使得DNA片段能与3′端带有“T”碱基的特殊接头连接；设计合成含有测序接头的双Index融合引物，以基因组DNA为模板，进行融合引物PCR，磁珠筛选目的Amplicon片段，用合格的文库进行cluster制备和测序，对测序得到的数据进行相应的生物信息分析。
1.10 数据处理与分析试验数据用Excel 2013和SAS 9.0软件进行整理和方差分析，对于差异显著的处理采用Duncan法进行多重比较。P < 0.05确定为差异显著。
2 结果 2.1 日粮添加绿原酸和橙皮苷对断奶仔猪生长性能的影响由表 2可知，与对照组相比，杆菌肽、橙皮苷与绿原酸显著提高断奶仔猪平均日增重和平均日采食量(P < 0.05)，降低料肉比(P < 0.05)。与杆菌肽组相比，橙皮苷与绿原酸显著提高断奶仔猪平均日增重(P < 0.05)，降低料肉比(P < 0.05)。橙皮苷组与绿原酸组之间平均日增重、平均日采食量和料肉比差异不显著(P>0.05)。
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表 2 日粮添加绿原酸和橙皮苷对断奶仔猪生长性能的影响 Table 2 Effects of dietary supplementing chlorogenic acid and hesperidin on the growth performance of weaned piglets |
由表 3可知，各处理组小肠重量指数差异不显著(P>0.05)。与对照组相比，杆菌肽、橙皮苷和绿原酸显著提高断奶仔猪胸腺指数(P < 0.05)，杆菌肽组、橙皮苷组及绿原酸组之间无显著差异(P>0.05)。绿原酸组脾脏指数显著高于对照组和杆菌肽组(P < 0.05)，橙皮苷组脾脏指数显著高于对照组(P < 0.05)，与杆菌肽组差异不显著(P>0.05)。绿原酸组和橙皮苷组小肠长度指数均显著高于对照组(P < 0.05)。绿原酸组回肠长度指数显著高于杆菌肽组(P < 0.05)，橙皮苷组回肠长度指数与杆菌肽组差异不显著(P>0.05)。
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表 3 日粮添加绿原酸和橙皮苷对断奶仔猪器官指数的影响 Table 3 Effect of dietary supplementing chlorogenic acid and hesperidin on organ indexs of weaned piglets |
由表 4可知，4组血浆和肝中NOS活力无显著性差异(P>0.05)。与对照组相比，杆菌肽、橙皮苷与绿原酸显著提高断奶仔猪血浆中T-AOC、T-SOD和GSH-Px浓度(P < 0.05)；杆菌肽组、橙皮苷组及绿原酸组之间断奶仔猪血浆中T-AOC和T-SOD浓度无显著差异(P>0.05)；橙皮苷组和绿原酸组断奶仔猪血浆中GSH-Px浓度低于杆菌肽组(P < 0.05)；橙皮苷组和绿原酸组之间断奶仔猪血浆中GSH-Px浓度无显著差异(P>0.05)。与对照组和杆菌肽组相比，橙皮苷与绿原酸显著提高断奶仔猪血浆中CAT浓度(P < 0.05)，对照组和杆菌肽组之间无差异(P>0.05)，橙皮苷组断奶仔猪血浆中CAT浓度显著高于绿原酸组(P < 0.05)。与对照组相比，杆菌肽、橙皮苷与绿原酸显著降低断奶仔猪血浆和肝中AST和ALT浓度(P < 0.05)，杆菌肽组、橙皮苷组及绿原酸组之间断奶仔猪血浆中ALT以及肝中AST和ALT浓度无显著差异(P>0.05)。橙皮苷组和绿原酸组猪血浆AST浓度显著低于杆菌肽组(P < 0.05)，橙皮苷组和绿原酸组之间无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，杆菌肽、橙皮苷与绿原酸显著提高断奶仔猪肝中T-AOC、T-SOD、CAT和GR浓度(P < 0.05)；杆菌肽组、橙皮苷组及绿原酸组之间断奶仔猪肝中T-AOC和GR浓度无显著差异(P>0.05)。其中绿原酸组T-SOD活力显著高于杆菌肽组(P < 0.05)，橙皮苷组T-SOD活力略高于杆菌肽组(P>0.05)；杆菌肽组CAT活力与绿原酸组无显著性差异(P>0.05)。
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表 4 日粮添加绿原酸和橙皮苷对断奶仔猪血浆和肝生化指标的影响 Table 4 Effect of dietary supplementing chlorogenic acid and hesperidin on plasma and liver biochemical parameters of weaned piglets |
由表 5可知，各处理组回肠绒毛高度差异不显著(P>0.05)。与对照组相比，杆菌肽、橙皮苷与绿原酸显著提高断奶仔猪空肠和结肠绒毛高度(P < 0.05)；绿原酸组空肠绒毛高度与橙皮苷组断奶仔猪差异不显著(P>0.05)，与杆菌肽组差异显著(P < 0.05)；橙皮苷组空肠绒毛高度与杆菌肽组差异不显著(P>0.05)；杆菌肽、橙皮苷与绿原酸组间结肠绒毛高度无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，橙皮苷组、绿原酸组和杆菌肽组显著降低空肠隐窝深度和VH/CD(P < 0.05)，3组之间差异不显著(P>0.05)。与对照组相比，橙皮苷和绿原酸组显著降低回肠和结肠隐窝深度，显著提高VH/CD(P < 0.05)；对照组和杆菌肽组之间无显著差异(P>0.05)。
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表 5 日粮添加绿原酸和橙皮苷对断奶仔猪肠道粘膜形态结构的影响 Table 5 Effects of dietary supplementing chlorogenic acid and hesperidin on intestinal mucosa morphology structure of weaned piglets |
由图 1可知，仔猪断奶后，空肠、回肠和结肠绒毛明显变短，排列稀疏散乱，部分绒毛粘附在一起，绒毛顶端出现断裂、脱落现象，且数量明显减少，部分细胞坏死脱落。与对照组相比，其他处理组空肠、回肠和结肠绒毛排列紧密且整齐，数量明显增多，长度也得到提升，断裂的绒毛明显减少，整个肠绒毛段轮廓清晰。绿原酸和橙皮苷组空肠、回肠和结肠在绒毛排列、数量和长度上与抗生素组效果相当。
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图 1 断奶仔猪肠黏膜组织形态(400×) Fig. 1 The intestinal mucosa morphology of weaned piglets(400×) |
由图 2可知，与对照组相比，绿原酸组BD2蛋白浓度显著提高(P < 0.05)，杆菌肽组显著降低(P < 0.05)，橙皮苷组无显著变化(P>0.05)；杆菌肽组、绿原酸组、橙皮苷组之间差异显著(P < 0.05)。各处理组HSP90和TLR4蛋白表达量差异不显著(P>0.05)。
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A.各组Western blot结果；B.目标蛋白与β-actin灰度比值 A. The result of Western blot; B. The gray level ratio (target protein/β-actin) 图 2 日粮添加绿原酸和橙皮苷对断奶仔猪空肠黏膜β-defensins 2、HSP90和TLR4蛋白水平的影响 Fig. 2 Effects of dietary supplementing chlorogenic acid and hesperidin on the protein level of β-defensins 2, HSP90 and TLR4 in jejunum mucosa of weaned piglets |
由图 3可知，各处理组TGF-β1 mRNA丰度之间差异不显著(P>0.05)，绿原酸和橙皮苷组较对照组有上升趋势。绿原酸组TNF-α mRNA丰度显著高于对照组(P < 0.05)；橙皮苷组与对照组差异不显著(P>0.05)，但有上升趋势。与对照组相比，绿原酸和橙皮苷组IL-8 mRNA丰度有不同程度的上升，但差异不显著(P>0.05)，橙皮苷组IL-8 mRNA丰度显著高于杆菌肽组(P < 0.05)。
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图 3 日粮添加橙皮苷和绿原酸对断奶仔猪空肠黏膜TGF-β1、TNF-α和IL-8 mRNA表达量的影响 Fig. 3 Effects of dietary supplementing hesperidin and chlorogenic acid on the mRNA level of TGF-β1, TNF-α and IL-8 in jejunum mucosa of weaned piglets |
图 4A为各组结肠微生物样品中物种注释分析图和物种热图，绿原酸组结肠中链球菌和大肠杆菌含量明显高于其它3组。橙皮苷和绿原酸组结肠中罗氏属菌含量略低于对照组和杆菌肽组。杆菌肽组结肠中普氏菌属含量最高，绿原酸组次之，对照组含量最低。各组其它细菌含量差异不明显。图 4B为各组结肠微生物样品间多样性和聚类的分析，橙皮苷组与对照组结肠微生物组成相似度最高，绿原酸组与对照组和橙皮苷组结肠微生物组成相似度次之，杆菌肽组结肠微生物组成与其它3组之间相似度差异较大。
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1、2、3和4分别代表对照组、杆菌肽组、绿原酸组和橙皮苷组。A.属水平的相对丰度(左)和热图(右)；B.组间相似性分析 1, 2, 3 and 4 represent CON, BT, CHA and HDN groups, respectively. A. Relative abundance (left) and thermogram at genus level (right); B. Similarity analysis among groups 图 4 日粮添加绿原酸和橙皮苷对断奶仔猪肠道微生物区系的影响 Fig. 4 Effects of dietary supplementing chlorogenic acid and hesperidin on the intestinal microflora of weaned piglets |
在本试验中，绿原酸和橙皮苷显著提高了断奶仔猪血浆中T-AOC、T-SOD、CAT、GR、GSH-Px的活力和肝中T-SOD、CAT和GR的活力，结果证明了橙皮苷和绿原酸具有抗氧化作用，且抗氧化能力优于BT。橙皮苷能够有效地抑制急性肝功能障碍发展过程中NO自由基的形成，避免肝氧化损伤[3]。体内外试验表明，绿原酸能减轻氧化应激和炎症应激[6]。本试验中，绿原酸和橙皮苷组血浆和肝中ALT与AST活力均显著低于对照组，效果均优于BT组。原因可能有以下两个方面：1)绿原酸和橙皮苷能提高仔猪采食量，摄入足够的蛋白质和能量能促进机体生长发育。2)绿原酸和橙皮苷具有抗氧化作用，能够提高机体抗氧化能力，降低细胞膜脂质反应水平，保护细胞膜的完整性，维持肝功能的正常，减少ALT和AST从组织细胞间逸出。
3.2 绿原酸和橙皮苷对断奶仔猪肠黏膜组织形态的影响本试验中，绿原酸组和橙皮苷组空肠、回肠和结肠的隐窝深度显著低于对照组。绿原酸组和橙皮苷组空肠、回肠和结肠VH/CD值显著高于对照组，回肠和结肠VH/CD值显著高于杆菌肽组。绿原酸组和橙皮苷组空肠和结肠绒毛高度显著高于对照组。橙皮苷和绿原酸对肠道绒毛高度的提升效果与杆菌肽组相当。空肠、回肠和结肠的组织切片也显示，橙皮苷和绿原酸能促进肠道绒毛的发育，降低绒毛损伤。结果表明，绿原酸和橙皮苷具有缓解仔猪断奶后肠道应激反应的作用。作用机制与它们的抗氧化功能相关，通过降低机体氧化应激水平从而避免肠道受到氧化损伤，促进肠道发育，提高肠道形态结构的完整性。
3.3 绿原酸和橙皮苷对断奶仔猪空肠黏膜BD2、HSP90和TLR4蛋白浓度和TGF-β1、TNF-α和IL-8 mRNA丰度的影响本试验结果发现，绿原酸组空肠黏膜中防御素BD2蛋白浓度显著高于对照组，表明绿原酸通过促进的肠道上皮BD2的表达进而抑制外来病原菌的入侵。防御素是哺乳动物体内一种重要的抗菌肽，具有抗细菌、抗真菌和抗病毒的作用。BD2对革兰氏阴性、阳性菌和某些真菌均有杀伤活性[7]。本试验结果显示，各处理热休克蛋白HSP90和Toll样受体TLR4蛋白浓度之间无显著性差异，试验表明，绿原酸组和橙皮苷组仔猪肠道中热休克蛋白HSP90和TLR4不具备激活和抑制作用。与对照组和杆菌肽组相比，绿原酸组和橙皮苷组对断奶仔猪空肠黏膜TGF-β1无显著影响但有上升趋势，TGF-β1是一种多效生长因子，具有促进细胞增殖与分化的功能[8]。绿原酸和橙皮苷能提高空肠绒毛高度与其促进TGF-β1分泌有一定联系。与对照组相比，杆菌肽显著降低IL-8的mRNA丰度，绿原酸和橙皮苷对IL-8 mRNA无显著影响，IL-8是一种炎性趋化因子，与多种疾病尤其是肿瘤的发生发展密切相关。橙皮苷能下调IL-8 mRNA的表达，从而对动物体起免疫调节作用[9-10]。而关于绿原酸对动物体组织IL-8表达调节的作用还未见报道。与对照组相比，杆菌肽、绿原酸和橙皮苷均具有提高肿瘤坏死因子TNF-α，而生理浓度范围内TNF-α是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子。小檗碱、绿原酸和黄芩苷的抗炎作用与其下调肠黏膜微血管内皮细胞的表达有关[11]。由此可见，绿原酸通过促进肠道上皮BD2的表达发挥其抗菌作用，绿原酸和橙皮苷通过提高TGF-β1和TNF-α发挥其促进空肠黏膜生长和抗炎作用。
3.4 绿原酸和橙皮苷对断奶仔猪肠道微生物区系与胸腺器官指数的影响本试验结果表明，橙皮苷对断奶仔猪肠道微生物区系的影响趋于平稳，作用效果缓慢；绿原酸作用效果较为明显，总体效果也趋于平稳，对肠道微生物组成的刺激小于杆菌肽组。说明橙皮苷和绿原酸能够有效地维持断奶仔猪结肠微生物群落的多样性，温和的改善微生物组成，降低强刺激带来的微生物区系紊乱，从而保护肠道微生态平衡。绿原酸抑制大肠杆菌和沙门氏菌的生长[12]。Chung等[13]研究发现，橙皮苷能抑制大肠杆菌、沙门氏菌以及李斯特氏菌的活性。本试验中，绿原酸组和橙皮苷组胸腺指数均显著高于对照组，与杆菌肽组差异不显著。Abuelsaad等[14]试验表明，橙皮苷具有免疫调控作用。王海良等[15]试验发现，在日粮中添加橙皮苷，肉鸡的胸腺指数均高于对照组。Ren等[16]报道，注射绿原酸能促进小鼠脾和胸腺细胞的增殖。Wu等[17]研究表明，绿原酸能通过激活神经钙蛋白，从而增加巨噬细胞的功能。
3.5 绿原酸和橙皮苷对断奶仔猪器官指数和生长性能的影响本试验发现，添加绿原酸后断奶仔猪日增重和采食量均显著提高，料肉比显著降低。刘英等[18]在断奶仔猪饲料中添加绿原酸，发现绿原酸组比对照组的平均日增重提高了4.3%，平均日采食量提高了1.39%，料肉比降低了2.75%。张纯和温安祥[19]研究表明，在建鲤饲料中添加绿原酸使其增重率显著高于对照组。吕武兴等[20]在肉鸡日粮中添加杜仲提取物，结果显示，肉鸡日增重提高10.65%，饲料利用率提高6%。本试验发现，添加橙皮苷能显著提高断奶仔猪日增重和采食量，其促生长作用优于杆菌肽。刘英等[18]报道，在断奶仔猪饲料中添加橙皮苷，相比对照组其平均日采食量提高了4.06%、平均日增重提高了12.86%、平均饲料转化率降低了7.14%。Park等[21]发现，在饲料中添加橙皮苷提高生长猪的饲料转化率，但对日增重无显著影响。
4 结论日粮添加绿原酸和橙皮苷能显著提高断奶仔猪的平均日增重、平均日采食量、空肠黏膜绒毛高度，显著降低料肉比。绿原酸通过促进肠道上皮BD2的表达发挥其抗菌作用，绿原酸通过提高TNF-α发挥抗炎作用，绿原酸和橙皮苷具有抗氧化作用，能维持断奶仔猪肠道微生物区系的多样性。
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