牦牛(Bos grunniens)是分布在我国青藏高原及其毗邻海拔3 000米以上高寒牧区的特有牛种资源。高原地区环境艰苦，物种稀缺，牦牛素有“高原之舟”的美誉。然而牦牛较其他畜种繁殖性能低，生产性能低下，并不能满足肉类生产的发展。因此通过牦牛有目的性的与其他普通牛(黄牛、肉牛、奶牛)杂交得到的F1代犏牛可以达到比亲本产肉量高、产奶量大、役用能力强、营养价值肉质风味优等杂种优势。但是犏牛的雄性不育阻碍了其杂种优势的利用，尽管能够通过回交或人工授精生育F2、F3代犏牛，但与F1代比较其杂种优势减弱且接近消失，适应能力较弱。因此犏牛在农业生产不能被广泛的利用[1]。
睾丸是雄性哺乳动物产生精子和分泌雄性激素的场所，其发育程度在雄性生殖系统中占据重要的地位。犏牛雄性不育近年来一直是牦牛学研究的重点。造成犏牛雄性不育主要是染色体和基因差异、激素内分泌失调、细胞核质互作、基因型不育等原因。
随着RNA-seq高通量测序技术的迅速发展与应用，高通量测序技术已经被证明是一种分析真核生物基因组转录组的高度敏感和精确的方法[2]，通过在RNA水平上转录组深度测序的技术对犏牛雄性不育的研究更加深入。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是长度＞200 bp的非编码RNA，可以与染色质修饰蛋白质，RNA结合蛋白，小RNA和其他的lncRNA相互作用，以调节各种生理过程。近年来，在人、牛、绵羊、鼠、野猪上鉴定到lncRNA[3]。lncRNA在转录调控、表观遗传、细胞分化、相关疾病及其他生物过程中起关键作用[4-5]。部分lncRNA可以通过调节转录状态作用于单个mRNA基因甚至整个染色体[6-7]。Liang等[8]通过对小鼠精原细胞lncRNA/mRNA相关性的分析，结果表明，精子发生的协调变化与lncRNA在转录和转录后的水平上相关，lncRNA可以调节复杂的基因。虽然目前已经有牦牛和犏牛转录组比较分析，其中曾贤彬等[9]通过高通量测序结果筛选并比较牦牛和犏牛与精原干细胞的更新和分化、精子形成以及减速分裂、细胞凋亡等相关基因的表达差异，同时也证实了F1代犏牛生精细胞只能分化至圆形细胞期。Xu等[10]通过对牦牛与犏牛睾丸组织microRNA的差异分析，研究与精子发生相关的miRNA有助于更好地了解精子发生阻滞机制。但是关于牦牛和犏牛睾丸组织转录组lncRNA的比较还属于空白。鉴于此，本研究将通过利用RNA-seq转录组差异比较，并进行生物信息学分析，为进一步从分子水平阐释犏牛雄性不育的发育过程及遗传机理奠定基础，并提供重要的理论数据。
1 材料与方法 1.1 材料本研究牦牛与犏牛的睾丸组织样本均采自于四川省阿坝州红原县屠宰场(北纬31°51′~33°19′，东经101°51′~103°23′；海拔3 600 m左右)，选取健康成年(3~4岁)的雄性牦牛、犏牛各3头，屠宰后迅速使用无菌剪刀采集睾丸组织，剥离睾丸组织白膜装进冻存管，放入液氮中带回实验室，-80 ℃保存备用。
1.2 RNA的提取，文库构建及高通量转录组测序利用TRIzol(Invitrogen公司，美国)法提取3头牦牛和3头犏牛睾丸组织样本的RNA，分别各取等量30 μL并混合组成两个RNA池(RNA pool)，使用Nanodrop ND-1000分光光度计和Bioanalyzer 2100生物分析仪(Agilent公司，美国)对试验过程中的RNA浓度以及RNA完整性进行鉴定。利用生物素标记的特异性探针(Ribo-ZeroTMrRNA Removal Kit)去除核糖体rRNA，通过乙醇沉淀得到无rRNA的剩余物，接着使用TruSeq RNA Sample Prep Kit(Illumina公司，美国)在一定的温度和离子条件下通过混合仪将已经纯化的mRNA进行约200 bp的片段化，随后使用TruSeq® Stranded kit(Illumina公司，美国)中的随机引物、反转录酶以及将mRNA打断后作为模板合成第1条链cDNA，使用合成缓冲液，DNA聚合酶Ⅰ和RNase H进行第2条链cDNA的合成，将末端纯化以及利用外切核酸酶和聚合酶将突出端修复为平端后，又将得到的产物双链cDNA的3′端加上碱基“A”，并使cDNA片段连接到测序接头对其进行PCR扩增反应，最后建立出双末端测序文库。将构建好的文库使用Agilent 2100和qRT-PCR方法对文库质检以保证文库质量之后，在Illumina HiSeq 2500平台进行测序。
1.3 转录组数据分析通过使用SOAPnuke(v1.5.2)对测序产生的原始数据进行去除含adapte的reads、含N比率＞10%的reads、低质量的reads(质量值Q≤10)处理后得到clean reads。利用HISAT2将处理后的净测序序列比对到参考基因组上并使用String Tie进行组装，将重构后的转录本再通过cuffcompare与已知的mRNA及lncRNA比较，获得相互的位置关系。通过CPC、txCdsPredict、CNCI以及pfam数据库对保留下来的转录本编码能力进行预测，使用RSEM计算通过Bowite2比对到参考序列的净测序序列基因和转录本的表达量，使用FPKM标准化处理便于样本间的相互比较。两组文库间的比较通过|log2(Fold change)|≥1，FDR(false discovery rate)≤0.01作为显著差异表达的参考。将lncRNA在mRNA上、下游10 k内判定为顺式作用cis，超过此范围值的用RNAplex分析lncRNA与mRNA的结合能 < -30则判定为反式作用tran，同时它们需满足相关系数斯皮尔曼系数spearman≥0.6及皮尔森系数pearson_cor ≥0.6定义为相关，利用Blast2 GO软件和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库比对分别对lncRNA候选靶基因进行GO(GO term)分析和KEGG富集分析。
1.4 lncRNA的荧光定量PCR差异验证通过随机筛选出8个lncRNA，其中LTCONS_00070732、LTCONS_00028984、LTCONS_00024814、LTCONS_00056498在转录组数据中表现为上调，LTCONS_00054787、LTCONS_00056576、LTCONS_00023375、LTCONS_00074328在转录组数据犏牛中表现为下调，其中log2(犏牛/牦牛)的数值≥1代表上调，≤-1代表下调。对上述lncRNA进行荧光定量PCR(qRT-PCR)反应，内参基因选择RPS18，引物均由南京金斯瑞公司合成，引物序列信息见表 1。荧光定量PCR反应总体系15 μL:上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 5.5 μL，SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ 7.5 μL；PCR反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s, 共40个循环，3个重复。用2-ΔΔCt法计算比较牦牛和犏牛lncRNA的相对表达量，并对转录组结果进行验证分析。
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表 1 lncRNAs引物信息 Table 1 Primers for lncRNAs |
本研究通过选用成年健康牦牛和犏牛共计6个样本进行测序。组成了2个cDNA文库，共生成测序得到牦牛和犏牛睾丸组织原始序列分别为83.3 Mb、84.4 Mb，经过过滤处理后得到净测序序列81.7 Mb、83.7 Mb，clean reads比对达到了98.09%、98.82%。Q30质量值百分率分别达到了94.87%、94.51%，将clean reads比对到参考基因组映射率分别达到82.78%、82.54%，RNA-seq数据已上传至NCBI(登录号SRP156262)。测序结果质量较高，满足后续的分析需要。
2.2 lncRNA的鉴定及差异表达分析利用Cuffmerge工具将组装结果进行合并筛选组装后，保留其中在NONCODE数据库中分类统计i、j、u、x和o 5类lncRNA较多的转录本。共获得候选牦牛和犏牛lncRNA转录本共25 365个(图 1)，其中得到犏牛lncRNA 24 133个，牦牛lncRNA 20 363个。整体看来mRNAs表达量高于lncRNAs。mRNAs与lncRNAs转录本长度也体现出不同(图 2)。通过Bowite2处理后，计算出相关表达量，筛选条件下共获得6 178个表达差异的lncRNA。其中，表达上调的有2 470个，表达下调的有3 708个(图 3)。
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CPC、txcdspredict、CNCI 3种方法与pfam蛋白数据库比对预测编码能力 The illustration shows the results compared with CPC, txcdspredict, CNCI and pfam protein database 图 1 lncRNA预测结果维恩图 Fig. 1 The Venn diagram of lncRNA predicted results |
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图 2 牦牛和犏牛lncRNA和mRNA转录本长度分布图 Fig. 2 Transcript length distribution of yak and cattle-yak lncRNAs and mRNA |
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黄色.上调基因；棕色.无显著差异基因；蓝色.下调基因 Yellow is the up-regulated gene; brown is the no significantly different gene; blue is the down-regulated gene 图 3 样本间的差异lncRNA散点图 Fig. 3 Differentially expressed lncRNA scatter plot |
通过计算lncRNA与mRNA的两个相关系数spearman_cor和pearson的值，以及lncRNA与mRNA的位置关系和结合能的判定。结果显示，得到15 350个潜在相关靶基因，其中潜在顺式作用(cis)靶基因13 907个，潜在反式作用(trans)靶基因1 448个；在|log2(Fold change)|≥1，FDR≤0.01显著选择下，差异显著的靶基因2 676个。犏牛与牦牛差异倍数前10的lncRNA及其靶基因如表 2所示。
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表 2 差异倍数最大的前10 lncRNA及其上调和下调靶基因 Table 2 Top 10 up-regulated and top 10 down-regulated lncRNA with the greatest flod changes and its targer genes |
GO分析结果显示，差异显著lncRNA的靶基因参与到58个功能分类，注释到生物学过程、细胞组分及分子功能3大类，其中生物学过程中主要注释到细胞过程、单有机体过程、生物调节、代谢过程、生物过程的调控等，细胞组分主要涉及到细胞、细胞部分、细胞器、细胞膜、细胞器部分、细胞膜部分等，分子功能主要涉及到结合、催化活性、核酸绑定转录因子活性、单传感器活性、分子功能活性等(图 4)。
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图 4 GO分析差异lncRNA靶基因 Fig. 4 GO analysis of the target genes of DElncRNAs |
KEGG富集分析结果显示，牦牛睾丸组织和犏牛睾丸组织差异表达lncRNA的靶基因共富集到306个通路上，富集程度较高的前10的通路如表 3所示，其中富集程度最高的是轴突指导(axon guidance)，其次为内吞(endocytosis)和Hedgehog信号通路(hedgehog signaling pathway)等。
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表 3 DElncRNAs差异靶基因KEGG富集前10通路 Table 3 Top 10 enriched KEGG pathways in DElncRNAs |
根据荧光定量PCR结果的差异倍数log2(犏牛/牦牛)与转录组测序结果中log2(Fold change)的比较，结果表明：LTCONS_ 00024718、LTCONS_00056498、LTCONS_00041936、LTCONS_00028984的荧光定量结果与转录组结果都上调；LTCONS_00054787、LTCONS_ 00056576、LTCONS_00023375、LTCONS_00074328的荧光定量结果与转录组结果都下调(图 5)，表明荧光定量PCR的验证与转录组测序数据趋势一致。
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图 5 qRT-PCR结果与测序结果比较 Fig. 5 Comparison of the results between RNA-seq and qRT-PCR |
本研究以F1代犏牛雄性不育为出发点，对牦牛与犏牛睾丸组织分别进行高通量测序，鉴定出lncRNA，并筛选出差异表达候选lncRNA的靶基因，在转录组层面上为探讨犏牛F1代雄性不育与lncRNA可能存在的关联提供有价值的数据。在犏牛样本中结果鉴定得到24 133个候选lncRNA，其中在|log2(Fold change)|≥1，FDR≤0.01的过滤条件下，与牦牛对比存在显著差异lncRNA 6 178个，并预测出差异靶基因2 676个，GO分析靶基因表达注释涉及到3大功能中有25个注释到生物过程，19个注释到细胞组成部分，15个注释到分子功能部分；在生物过程中, 差异显著的靶基因较为富集包括细胞过程、单有机体过程、代谢过程等，但是除了这些常规的富集过程外，发育、生殖和细胞组成或生物发生也占了部分比重，此结果可能与犏牛较牦牛睾丸组织结构的异常相关[11]。在细胞组成部分, 差异靶基因较为富集除包括细胞、细胞部分、细胞器等这类常规的富集类别外，还包括高分子复合物、超分子复合物、细胞结合等类别。犏牛精子发生的阻滞是造成犏牛雄性不育的主要原因之一，核酸、蛋白质是生物体内重要的高分子化合物，而核酸中DNA担负传递遗传信息并通过转录翻译后表达为蛋白，推测这可能与犏牛多基因遗传不平衡相关[12]。染色体、核糖体属于超分子复合物，研究发现犏牛仅有少数的精母细胞能够形成联会复合体[13]，并且F1代犏牛异源的X染色体和Y染色体不能够协调共存，平衡被扰乱等异常可能与此富集相关；另外，F1代犏牛生精细胞无精子，支持细胞和间质细胞等存在异常可能与细胞组成差异相关。在分子功能类别中，差异的靶基因主要富集于结合、催化活性外、核酸结合转录因子的活性与蛋白结合转录因子活性，DNA同转录因子的相互作用可以调控基因的表达，从而在犏牛的生长和发育中发挥重要作用[14]。
KEGG结果显示富集程度前10通路中，包括轴突指导、Hedgehog信号通路、cGMP-PKG信号通路、Wnt信号通路与钙信号通路。其中，轴突内不同的第二信使水平包括钙离子(Ca2+)、环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)等是决定导向信号能发生何种反应的因素。因此，轴突导向与信号通路有密不可分的联系，不同的信号通路决定了不同的调控作用。Hedgehog信号通路在控制细胞增殖、调节细胞分化及保持成体干细胞的自稳态中起着非常重要的作用，甚至该通路的异常激活也会导致许多疾病发生[15]。在Hedgehog信号通路中参与精原干细胞分化更新相关的CCND1基因和细胞抗凋亡基因BCL-2等出现了下调，推测可能是因为lncRNA LTCONS_00072845的下调影响其靶基因CCND1的低水平表达，低水平的CCND1会影响细胞的增殖，诱导细胞凋亡[16]，从而导致各级生殖细胞发育与凋亡过程的异常造成精子不能正常的发育与成熟。Hedgehog家族成员作为细胞间的信号蛋白是胚胎发育过程中许多基本过程的关键介质，信号是由一种胶质瘤相关癌基因同系物(GLI)家族的锌指转录因子介导的，其中可能是lncRNA LTCONS_00004788的调控改变了靶基因GLI3的表达，GLI3的下调可能对犏牛早期生长发育有影响[17]。cGMP-PKG信号转导途径可以影响精子的运动性、睾丸生殖细胞的发育、腹周膜的放松、睾丸激素的合成以及睾丸血管的扩张[18]。Wnt信号通路对于发育过程中的不同过程和成年动物组织内环境稳态来说是至关重要的。Wnt信号的扰动会导致先天缺陷、癌症和其他疾病，规范的Wnt信号是成年哺乳动物正常睾丸功能的一部分[19-20]。在Wnt信号通路中的轻微扰乱会引起生殖细胞的损失与凋亡，并证明通过灭活β-连环蛋白(β-catenin)的功能能够使小鼠的精子发生失败以及使Wnt信号升高后造成成年小鼠精子发生障碍[21]。另外，Ca2+是个普遍的第二信使，它调节各种生理功能，如收缩、分泌、新陈代谢、增殖等[22]。通过对Ca2+的正调控可以促使睾丸支持细胞中调节精子形成的两种激素睾酮和促卵泡素的增加[23]，推测犏牛促卵泡素分泌不足以及细胞扩张[24]与钙离子的调控相关。内吞作用机制是控制着细胞膜的脂质和蛋白质组成，从而调节细胞与环境的相互作用。与内吞通路相关的早期内体抗原1(early endosome antigen 1，EEA1)基因受雄性激素调控影响成年小鼠睾丸中的精子发生[25]，推测是EEA1受到lncRNA LTCONS_00007420的调控表达量降低，影响内吞通路细胞和环境相互作用，从而对犏牛的精子发生产生影响。micro-RNAs在调节哺乳动物精子发生过程中也发挥重要的作用[10]，其中已证实与精子发生相关的microRNA如miR-122、miR-383、miR-34等在该通路中出现了失调。另外3个富集通路都是与疾病相关的，基底细胞癌通路中因为其中涉及到Wnt信号通路以及Hedgehog信号通路中部分基因的介导，在基底细胞癌通路中除了肿瘤抑制因子补丁蛋白同系物1(patched 1，PTCH1)基因上调外，其他与通路相关的差异基因均出现了下调，通路中抑制肿瘤的增殖，促进了细胞凋亡的发生。在前列腺癌通路中，成纤维生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1，FGFR-1)作为精子发生的必要条件[26]，犏牛睾丸中FGFR-1受到lncRNA LTCONS_00023912的调控出现下调，从而可能影响到犏牛的精子发生；有研究表明前列腺癌通路的激活与雄性不育存在一定关联[27]，雄激素大多数生理作用是由雄激素受体(androgen receptor，AR)介导的，AR作为lncRNA LTCONS_00012265的靶基因，其功能在男性中是必不可少的，用于适当的性别分化、青春期发育和正常精子形成的调节[28]，推测前列腺癌症通路中FGFR-1、AR、BCL-2以及细胞周期蛋白D1的下调可能对犏牛较牦牛呈现出性情温顺、睾酮表达下调以及精子发生阻滞产生一定的影响。有研究发现高能量密度饮食造成血清中睾酮和雌二醇、芳香化酶和促黄体激素受体的基因和蛋白质的异常表达以及睾丸形态的改变，通过血管紧张性转化酶抑制剂可以恢复正常[29]。由此推测肾素-血管紧张素通路可能在睾丸和激素正常的生殖调控中起关键作用。
在lncRNA差异中，在前10的lncRNA(表 2)上调中，其靶基因前列腺素D2合成酶21 ku (prostaglandin D2 synthase 21 ku，PTGDS)在公鸡弱精子症的研究中，弱精症的公鸡睾丸中PTGDS的表达极显著高于正常公鸡[30]，上调与雄性不育相关除PTGDS外，笔者并未发现其他的前10上调lncRNA的靶基因与雄性不育有相关联系性的研究。其中，亮氨酸拉链转录因子样1(leucine zipper transcription factor-like 1，LZTFL1)、蛋白酪氨酸磷酸酶非受体4(tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 4，PTPN4)同样作为肿瘤抑制因子，程序性细胞死亡6相互作用蛋白(programmed cell death 6 interacting protein，PDCD6IP)作为细胞凋亡基因，其相对的高表达能诱导细胞凋亡[31-33]。在前10 lncRNA下调的靶基因中，胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor II，IGF2)是细胞增殖、分化和发育的有效刺激因子；中胚层特异性转录本(mesoderm specific transcript，MEST)是位于人染色体7q32上的印记基因，已有研究发现在特发性不育患者存在IGF2的低甲基化和MEST的高甲基化情况与其精子质量差相关[34]，由此可推测可能是其对应lncRNA的介导基因的甲基化，从而下调了基因的表达。锌指转录因子Gli类似物3(GLI-similar 3，GLIS3)是一种转录因子，通过敲除小鼠睾丸的GLIS3基因发现小鼠睾丸显著变小，生殖细胞显著减少，纯合敲除小鼠几乎没有精子产生[35]，可见犏牛中GLIS3的下调可能是其雄性不育原因之一。同源框基因A10(homeo box A10，HOXA10)和同源框基因A11(homeo box A11，HOXA11)基因的突变会导致睾丸的异常发育，精子生成障碍[36-37]。NOTCH信号的激活增加了精原细胞的凋亡和睾丸重量的减小，在生殖细胞中有条件地敲除NOTCH1(neurogenic locus notch homolog protein 1)对精子形成和男性生殖力没有影响，可能是其它家族成员的补偿作用[38]，犏牛较牦牛NOTCH2的下调可能与犏牛雄性不育相关，仍需进一步研究证实。
4 结论本研究采用RNA-seq测序技术对成年健康雄性犏牛和牦牛睾丸组织进行转录组测序，筛选出差异lncRNAs，并对差异显著的lncRNAs与其共表达的差异顺式和反式作用靶基因进行生物信息学分析，推测lncRNA可能在犏牛的进化发育中对其雄性不育具有重要的调节作用，为从lncRNA的角度分析犏牛与牦牛睾丸组织在转录组中的差异及犏牛雄性不育的进一步研究提供理论依据。
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