2. 河北科技师范学院, 秦皇岛 066600;
3. 河北省牛羊胚胎工程技术研究中心, 保定 071000
2. Hebei Normal University of Science & Technology, Qinhuangdao 066600, China;
3. Research Center of Cattle and Sheep Embryo Engineering Technique of Hebei, Baoding 071000, China
水貂作为一种小型珍贵毛皮动物，被毛颜色是决定貂皮质量与价值的重要品质特征，毛色形成是一个复杂的生物学过程，包括黑色素细胞的形成、细胞内部的生物合成过程以及外部环境激素的调控。黑色素细胞的特异产物黑色素是动物毛色特征的物质基础，黑色素生物合成的限速酶酪氨酸酶与酪氨酸酶相关蛋白1和多巴色素异构酶(dopachrome tautomerase，DCT)共同参与黑色素的合成[1]。
Hirobe等[2]发现，DCT(slt)基因型鼠的被毛中真黑素生成量降低，而伪黑素的合成不受影响[2]。Cai等[3]首次对水貂基因组进行测序，为水貂毛色的分子基础研究提供了重要参考，Song等[4]对水貂皮肤组织转录组测序发现，黑貂皮肤组织的DCT表达显著高于白貂，课题组通过RNA测序发现，1月龄黑貂皮肤组织的DCT表达高于咖啡貂。绵羊黑色皮肤组织中的DCT表达高于白色皮肤[5]，南平黑羊(Ovis aries)DCT基因编码区的SNP与肌肉和骨骼的黑色性状并没有直接相关，但其mRNA和蛋白表达水平与黑色素含量有关，可能由其启动子调控活性的变化引起的[6]。启动子作为基因表达调控的“指挥者”，不仅能决定转录起始，还能调控基因表达的强弱。DCT基因启动子如何调控不同被毛颜色水貂的基因表达，尚未见相关报道。
本研究旨在发现水貂DCT基因启动子的活性区域，并对其活性调控域进行分析。深入探究水貂毛色形成的调控机理，对培育丰富被毛的水貂品种具有重要的理论与实践意义。
1 材料与方法 1.1 材料和试剂利用EasyPure Genomic DNA Kit提取河北某养殖场1月龄黑貂、白貂和咖啡貂各3只的肝组织DNA。
Trans StartTaq DNA Polymerase、PCR产物纯化试剂盒购自北京全式金公司；T4 DNA连接酶、限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ以及pMD19-simple载体购自大连宝生物公司；质粒DNA小量提取试剂盒、无内毒素质粒DNA大量提取试剂盒购自上海生工公司；pGL3-Basic与pRL-TK载体、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；EZ DNA Methylation-GoldTM Kit试剂盒购自ZYMO公司。引物合成和测序由北京六合华大基因公司完成。
1.2 水貂DCT基因5′UTR克隆以雪貂(Mustela putorius furo)基因组序列(NCBI：NW_004569159.1)为模板，利用Primer 5.0设计引物(表 1)，扩增黑、白和咖啡貂DCT基因5′UTR。PCR反应体系和反应条件同1.3(退火温度见表 1)。
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表 1 水貂DCT基因5′UTR序列扩增引物 Table 1 Primer sequences for amplifying 5′UTR of mink DCT gene |
以咖啡貂DCT基因5′UTR序列(KY412852)为模板，设计启动子活性检测片段引物，各片段上游(F)和下游(R)引物的5′端分别引入Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点与其保护碱基(表 2)。以咖啡貂基因组DNA为模板，扩增DCT基因上游5′UTR的P7片段，反应体系：10×PCR Buffer 5 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各4 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1)4 μL，Trans Start Taq酶(10 U·μL-1)0.5 μL，DNA模板2.5 μL，加水补足50 μL。PCR反应条件：95 oC预变性4 min；36个循环(95 oC变性30 s，67.5 oC退火30 s，72 oC延伸2 min)；最后72 oC延伸10 min。1.0%琼脂糖凝胶检测PCR产物，送华大测序。
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表 2 水貂DCT基因启动子活性检测片段引物 Table 2 Primers for detecting promoter activity of different fragments of mink DCT gene |
P7片段与pMD19-Simple载体连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞提取质粒。以该质粒为模板，扩增5′端逐渐缺失的P1~P6片段(引物见表 2)，获取重组质粒。KpnⅠ /XhoⅠ双酶切P1-P7重组质粒和荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic，产物连接构建7种荧光素酶报告基因重组质粒。重组体经菌落PCR和测序鉴定确认构建成功后，分别被命名为pGL3-1~pGL3-7。以黑貂基因组为模板，构建黑貂DCT基因荧光素酶报告基因重组质粒pGL3-4~pGL3-6。反应体系和步骤与咖啡貂重组质粒构建一致。
1.5 细胞转染与双荧光素酶检测用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养A375，转染前24 h接种于24孔板中，每孔加入500 μL无抗生素的培养基，设3个重复，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，细胞融合度达到80%~90%转染报告基因重组质粒pGL3-1~pGL3-7。转染6 h后换含血清培养液培养48 h裂解细胞，利用双荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性。
1.6 水貂DCT基因启动子甲基化状态检测按照DNA甲基化试剂盒说明书步骤对水貂基因组进行亚硫氢酸盐处理，利用MethPrimer[7]预测3种毛色水貂DCT基因5′UTR的CpG岛，并设计检测引物F：5′-AGTTTAATGTTATGGGGATGATATAGAT-3′，R：5′-CCACCCTAATACTTCTAAAAACAAC-3′。以3种毛色水貂血液基因组为模板，PCR克隆扩增，每个样品测序10个单克隆，利用BISMA(http//services.ibc.uni-stuttgart.de/BDPC/BISMA)比对分析，统计不同毛色水貂DCT基因CpG位点甲基化水平差异。
1.7 数据统计分析使用SPSS 24.0对缺失片段启动子活性和CpG岛的总甲基化水平进行单因素方差分析和Duncan多重比较，利用描述统计的列联表χ2检验分析DCT基因CpG岛各位点甲基化水平的差异。P < 0.05为统计学差异显著。
2 结果 2.1 水貂DCT基因5′UTR克隆和结构特征以黑、白和咖啡貂基因组为模板，扩增水貂DCT基因5′UTR，1.5%琼脂糖凝胶检测，PCR扩增片段与目的片段大小一致(图 1)，送华大基因测序。序列拼接后获得黑貂、白貂和咖啡貂DCT基因5′UTR长8 203 bp序列，提交NCBI数据库(登录号：KY412850-KY412852)。
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D1~D8为8对引物的扩增产物；M. DNA相对分子质量标准 D1-D8 are the amplified products of 8 pairs of primers; M. Trans2K@ Plus DNA marker 图 1 水貂DCT基因5′UTR片段克隆检测 Fig. 1 Detection of cloned fragments for 5′UTR of mink DCT gene |
以黑貂DCT基因序列为参考比对发现，5′UTR共有36个SNPs(图 2)，其中A/G和C/T转换分别为8个和18个；其余10个为颠换，转换和颠换比率为2.6:1。由图 2可以发现，SNP基本均匀分散在水貂DCT基因5′UTR，但在长105 bp的g.3285-3389区域发现6个SNPs，在长1 038 bp的g.1970-3007区域未发现SNP。
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图 2 水貂DCT基因8 203 bp序列SNPs分布及其特殊元件 Fig. 2 SNPs distribution and some elements in 8 203 bp sequence of mink DCT gene |
水貂DCT基因5′UTR与雪貂基因组序列(NCBI：NW_004569159)比对覆盖度99%，相似度96%，其中g.2114-2556区域与雪貂DCT基因mRNA序列(NCBI：XM_004746149)的g.1-444相似度为97%；g.1728-2132区域与课题组对水貂转录组测序获得的DCT基因mRNA g.1-405区域相似度为99%(图 2)，定义水貂DCT基因mRNA转录起始位点的g.1728位为+1位。
水貂DCT基因g.7133-7336区域为长204 bp的转座子，其5′末端和3′末端为(AAAGTTTGTACTTCTT) 16个碱基的正向重复，并且该转座子在DCT基因5′UTR中存在两处反向重复，分别位于g.8045-7844和g.3655-3458(图 2)，相似度分别为85%和75%。Blast比对发现，NCBI核苷酸数据库中，100条与204 bp转座子相似度高于81%、覆盖度高于86%的序列一条为蜕皮动物总门(Ecdysozoa)线虫纲(Nematoda)的索巴利吸虫(Soboliphyme baturini)序列，相似度83%，覆盖度96%；其他均为犬形亚目(Caniformia)的核苷酸序列。DCT基因的204 bp SINE元件具有犬型亚目特异Can-SINEs元件的典型结构特征，包括5′和3′末端16 bp正向重复序列、A-box、B-box、(CT)n微卫星和Poly-A尾巴(图 3)。
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图 3 水貂DCT基因g.7133-7336区间Can-SINEs结构特征 Fig. 3 Structure of Can-SINEs in g.7133-7336 of mink DCT gene |
DCT基因5′UTR系列缺失片段P1~P7的PCR克隆产物和重组质粒的双酶切结果与目的片段大小一致(图 4)。P7~P1序列分别位于黑貂DCT基因序列(KY412850)的g.1-1250、g.613-2150、g.977-2150、g.1191-2150、g.1318-2150、g.1631-2150和g.1809- 2150区域；以转录起始位点第1个碱基为+1，定义序列位置分别为-1727~+422、-1115~+422、-751~+422、-537~+422、-410~+422、-97~+422、+81~+422。
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A.PCR克隆检测；B.双酶切检测图；M. DNA相对分子质量标准 A.Detection for PCR; B. Detection of double-enzyme digestion; M. Trans2K@ Plus DNA marker 图 4 DCT基因5′UTR系列缺失片段凝胶检测图 Fig. 4 Gel detection of deleted fragments in 5′UTR of DCT gene |
图 5A显示了7个片段的相对位置，将水貂DCT基因的P7序列与EPD(http://epd.vital-it.ch/cgi-bin/get_doc?db=mmEpdNew&format=genome&entry=Itch_1)公布的人和鼠DCT基因启动子活性区比对，发现了与鼠启动子相似度为76%的区域(g.1341-2041)和与人启动子相似度为81%的区域(g.1156-2013)。
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A.系列缺失片段位置，Mouse PM和Human PM分别为EPD公布的人和鼠DCT基因启动子区域与水貂基因比对高相似度区域，片段上标记数字为在水貂DCT基因序列的碱基位置；B.各片段启动子活性 A.Position of deletion fragments, Mouse PM and Human PM are the high similarity region blasted with promoter of human and mouse DCT gene, respectively. The numbers on columns are the base position in mink DCT gene sequence. B. The promoter activity of the serial fragments 图 5 水貂DCT基因缺失片段的启动子活性 Fig. 5 Promoter activity of serial deleted fragments of DCT gene |
启动子活性检测(图 5B)发现，最短片段pGL3-1和pGL3-2与阴性对照pGL3-B活性没有显著差异(P>0.05)，长度增加的2个片段pGL3-3和pGL3-4活性显著升高(P < 0.05)，而继续增长的3个片段pGL3-5、pGL3-6和pGL3-7活性显著降低(P < 0.05)，并且其活性与阴性对照没有显著差异(P>0.05)。
P4基本包含与人启动子比对成功的g.1156-2013，也包含与鼠启动子成功比对的g.1341-2041；P3只包含与鼠启动子比对成功区域，不包含与人启动子成功比对的g.1156-1317。pGL3-4的高启动子活性(12.89)与pGL3-3的相对低活性(9.03)，说明P3片段缺失的-537~-409区域可能包含某些增强子的调控元件。P5~P7长度高于P4，但启动子活性却与阴性对照没有显著差异，推测DCT基因-1727~-537的上游区域可能存在负调控元件。
2.3 水貂DCT基因5′UTR重要调控元件分析图 6显示了利用WWW Signal Scan(https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/signal/)和Promoter Scan(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)[8]预测的各片段转录启动调控元件。P1和P2包含与人和鼠DCT基因启动子成功比对的部分区域，但无启动子活性。P1位于水貂DCT基因的转录起始位点下游+81~+422，虽然预测的启动子位于该区域，但该片段不包含任何调控元件，没有启动子活性。P2片段位于-97~+422区域，同样包含部分人和鼠DCT基因启动子区域，还包含近端域的部分区域，含有1个M-box(-79~-68)、2个CANNTG结构(-76~-71和+276~+281)、2个TATA框(+29~+45和+47~+62)和1个CAAT框(-60~-57)，但这些调控元件并没有使P2具备启动子活性，说明这些调控元件组合不能启动DCT基因的转录。
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图 6 水貂DCT基因缺失片段的调控元件 Fig. 6 Regulatory elements in serial deletion fragments of mink DCT gene |
P3片段表现出高于P2(0.49)片段18倍的启动子活性，该区域相对P2增加了1个32 bp元件(-392~-361)、3个TATA框(-351~-331、-252~-221和-104~-87)和1个近端域(-211 ~+4)，该近端域包括2个CANNTG(-159 ~ -154和-108~-103)结构、1个TATA框(-104~-87)和1个CRE(-182~-175)。P4比P3增加-537~-410区域，但该区域没有发现任何转录调控元件，P4和P3的启动子活性没有显著性差异。
P5、P6和P7包含了与人、鼠启动子同源的全部区域(-572~-285和-387~+313)，但其启动子活性与阴性对照没有显著差异，推断在-1 727~-537区域可能存在负调控元件，抑制了启动活性。通过比对人、鼠DCT基因启动子的调控元件发现1个GC-box位于水貂DCT基因的-636~-608区域(图 6)。利用MethPrimer(GC%>50.0，Obs/Exp>0.6)预测P7片段中g.-735~-608区域为CpG岛，Emboss Cpgplot(http://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/embosscpgplot/)与MethPrimer的预测结果一致(图 6和图 7)。
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图 7 水貂DCT基因5′UTR的CpG岛预测 Fig. 7 Prediction of CpG islands in 5′UTR of DCT gene |
对3种毛色水貂DNA进行亚硫氢酸盐测序，发现DCT基因g.-735~-608区域包含10个甲基化位点(表 3)，3种毛色水貂平均DNA甲基化水平以黑貂、白貂、咖啡貂顺序依次升高，并且相互间均存在显著差异(P < 0.05)。g.-684 T>C和g.-621 T>C 2个SNPs位点黑貂、白貂和咖啡貂的单倍分别为TT、TC和CC型，黑貂在这2个位点的甲基化水平均为0。
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表 3 3种毛色水貂DCT基因启动子区CpG岛甲基化水平 Table 3 Methylation level of promoter region of DCT gene in 3 kinds of mink |
g.-684 T > C和g.-621 T > C 2个SNPs位点分别位于DCT基因pGL3-5和pGL3-6 2个片段中，pGL3-4片段黑貂和咖啡貂活性没有显著差异(P>0.05)，但pGL3-5和pGL3-6片段黑貂活性均显著高于咖啡貂(P < 0.05)。
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不同小写字母表示差异显著(P < 0.05) The different lowercase letters mean significant difference(P < 0.05) 图 8 黑貂和咖啡貂DCT基因片段启动子活性 Fig. 8 Promoter activity of fragments of DCT gene in black and coffee minks |
基因启动子活性区域研究对揭示基因功能具有重要意义[9-10]。本试验发现，水貂DCT基因5′UTR的P1和P2没有启动子活性，虽然P2片段包含M-box、CANNTG、AP-2结合位点、TATA框和CAAT框等重要调控结构，但其启动子活性表现出与阴性对照和P1片段一致，说明这些调控元件没有发挥启动子活性。P4和P3包括32 bp元件和近端域，两个片段具有最高的启动子活性，并且二者活性没有显著性差异，P3缺失的序列区域没有发现相关转录调控元件。Yokoyama等[11]发现，人DCT基因的2个结构元件(32 bp和近端域)共同存在时，才能在色素细胞中发挥转录功能，2个结构元件都包含CANNTG基序(螺旋-环-螺旋结构转录因子MITF结合位点E-box)，近端域单独存在时DCT只有基础转录功能。山羊DCT基因32 bp元件中的两个位点突变后，启动子活性显著降低[12-13]。Jiao等[14]利用突变缺失试验揭示了459 bp的近端域在鼠DCT基因的黑色素细胞高表达中发挥重要作用。水貂DCT基因5′UTR的32 bp结构和近端域与其他哺乳动物的DCT基因一样，在启动基因转录中发挥关键作用。
5′UTR长度增加的P5、P6和P7片段启动子活性显著降低，与阴性对照没有显著差异，这3个片段比P4增加的区域中包含GC-box结构和CpG岛。GC-box由GGGCGG序列组成，是调节蛋白Sp1的识别结合位点。哺乳动物大约40%的基因启动子区包含CpG岛，而人启动子约70%含CpG岛。DNA甲基化发生在CpG岛位点胞嘧啶的5′嘧啶环形成5甲基化胞嘧啶，CpG岛的多个甲基化位点导致基因的稳定沉默[15]。由此可以认为，P5、P6和P7片段中的CpG岛与GC-box使3个长片段的启动活性沉默。Araki等[15]发现，鼠srada1基因启动子区的GC-box甲基化使其转录活性降低；Nagasawa等[16]发现，GC-box结构负调控甲状腺激素受体基因的转录；刘春杨等[12]揭示了GC-box和CpG岛结构对山羊DCT基因启动子活性具有抑制作用。说明GC-box和CpG岛结构在水貂DCT基因中发挥负调控作用，抑制32 bp和近端域元件的启动子活性。
3.2 水貂DCT基因5′UTR的SNP突变、甲基化水平与启动子活性关系基因启动子区甲基化水平与机体癌变发生存在密切关系，在医学领域有广泛的研究[17]，SNP突变与动植物基因启动子活性关系研究已有相关报道[18-20]。试验发现，水貂DCT基因g.-684和g.-621的两个突变位点位于CpG岛。黑貂的2个位点均为纯合TT型，咖啡貂均为CC纯合型，而白貂均为TC杂合型，CC基因型形成了CpG岛的特殊结构，而TT基因型破坏了CpG岛结构，黑貂在两个位点的甲基化水平为0.0，而咖啡貂为93.3。g.-684和g.-621的T > C突变可能是导致黑色和棕褐色被毛水貂DCT基因CpG岛甲基化水平差异的分子基础，CpG岛的胞嘧啶碱基高甲基化可能抑制DCT启动子活性，从而抑制真黑色素的合成。而白貂甲基化水平处于黑貂和咖啡貂之间，其被毛中色素合成被抑制可能同时受其他基因调控。本研究发现，黑色被毛水貂DCT基因的CpG岛甲基化水平最低，咖啡貂最高，这与黑貂被毛主要色素为真黑素而咖啡貂的真黑素合成受到抑制相关。
3.3 水貂DCT基因中Can-SINEs的进化起源本研究发现，水貂DCT基因中204 bp转座子元件可能在犬形亚目分化之前，来源于蜕皮动物门的索巴利吸虫侵入动物基因组中不断复制转座，而广泛分散在犬形亚目动物的基因组中。二十世纪九十年代早期，在美洲貂的X染色体上首次发现犬型亚目基因组中特异SINEs，其与啮齿动物tRNA-赖氨酸衍生的B2 SINEs结构有55%的相似度，标记为Can-SINEs[21-22]。(40~65)百万年前，食肉目分化为犬型亚目和猫型亚目后，Can-SINEs插入到犬型亚目动物基因组中[23]，成为物种进化研究的重要材料，其对基因组构成和基因功能的影响被逐渐认识[24]。有研究发现，狗血液中Can-SINEs拷贝数与乳腺癌后存活时间呈负相关[25]。本研究提出204 bp的Can-SINEs是犬型亚目感染蜕皮动物门的索巴利吸虫后的残骸，为Can-SINEs在犬型亚目中的进化和功能研究提供参考依据。
4 结论水貂DCT基因5′UTR长204 bp的Can-SINEs，由索巴利吸虫侵入基因组形成；基因上游32 bp元件和近端域结构共同作用发挥启动子活性，而GC-box和CpG岛结构沉默启动子活性；g.-684和g.-621位点的T > C突变形成的CC单倍型导致咖啡貂DCT基因的高甲基化与低启动子活性，从而抑制真黑素合成，产生棕褐色被毛特征。
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