乳脂肪是乳汁的主要成分之一，其合成分泌受到乳腺细胞的调控。乳脂肪在乳汁中表现为圆球状的脂肪球(milk fat globules, MFG)[1]。研究发现，乳脂肪的含量受到脂肪球大小的影响[2-3]，而乳脂肪球来源于乳腺上皮细胞内合成的脂滴(lipid droplet，LD)。脂滴运输到细胞质膜顶端后，以双分子膜结构释放进入腺泡腔中[4]，并且乳脂肪球的合成受到乳腺上皮细胞内蛋白的调控[5]。因此，研究乳腺细胞脂滴的形成能够丰富泌乳生理学理论，揭示乳腺脂肪合成分泌的调控机制。
固醇调节元件结合蛋白(sterol-regulatory element binding protein, SREBPs)是调控细胞脂代谢的主要转录因子。固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(srebp cleavage-activating protein, SCAP)是位于细胞内质网的膜蛋白，能够在细胞内感受胆固醇的浓度变化，也是SREBPs的锚定蛋白[6-7]。当细胞内胆固醇浓度降低时，SCAP结合SREBP从内质网转运到高尔基体，SREBP在高尔基体内被蛋白酶裂解释放核片段，进入细胞核与靶基因启动子结合，激活脂肪代谢相关基因的转录，进而调控细胞的脂肪合成[8-9]。最近研究发现，在恒河猴上通过siRNA抑制SCAP的表达，减少了机体内脂肪的合成[10]；在ob/ob小鼠上敲减肝SCAP的表达能够引起脂肪合成显著减少[11]，这些发现表明，SCAP基因沉默会对动物机体的脂肪合成产生影响。在羊的乳腺细胞中沉默SREBP等脂肪代谢基因，影响了乳腺细胞内脂质代谢和脂滴的形成[12-13]。而SCAP作为SREBP的辅助蛋白和主要调控因子[14-15]，沉默SCAP基因对于奶牛乳腺细胞脂滴的影响国内外目前还未见报道。
本研究通过筛选构建奶牛SCAP基因沉默细胞株来研究SCAP基因沉默对乳腺上皮细胞脂滴的影响，为揭示奶牛乳腺脂肪合成的调控机制奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料奶牛乳腺上皮细胞、pcDNA3.1-SCAP质粒、慢病毒载体系统和293T细胞由农业部动物生化与营养重点实验室保存；EcoR I-HF、Age I-HF限制性内切酶购自于Fermentas公司；大肠杆菌感受态E.coli TOP10、DNA Ladder、Prime Script RT Reagent kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂、SYBR Green EX Taq酶购自于大连宝生物工程有限公司；SCAP蛋白抗体(anti-SCAP antibody)购自Abcam公司(货号ab190103)；内参β-肌动蛋白抗体(β-actin antibody)购自于武汉servicebio公司(货号GB11001)；酶标二抗购自于北京鼎国昌盛公司；罗氏蛋白酶抑制剂购自于Roche公司；T4 DNA连接酶购自于NEB公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自于碧云天生物技术研究所；油红O染色液试剂盒、嘌呤霉素购自于Solarbio公司；尼罗河红、超灵敏ECL化学发光试剂盒购自于Sigma公司；SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒以及SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒均购自于上海生工生物工程有限公司；质粒中提试剂盒购自于QIAGEN公司。
引物合成及测序由上海生工生物工程公司完成。
1.2 方法 1.2.1 奶牛SCAP shRNA慢病毒重组载体构建与鉴定[16]根据GenBank中报道的牛SCAP基因序列(NM_001101889)，用Invitrogen公司网站的在线软件BLOCK-iT RNAi Designer设计SCAP短发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)，并筛选4条shRNA序列，合成相应寡核苷酸序列(表 1)。将合成的单链寡核苷酸退火形成双链，退火体系：上游引物4.5 μL，下游引物4.5 μL，退火缓冲液1 μL，共10 μL进行PCR。将PCR回收产物与PLKO.1载体连接，连接体系：pLKO.1回收片段5 μL，shRNA退火片段1 μL，T4酶0.5 μL，T4 buffer 1 μL，水2.5 μL，共10 μL。16 ℃条件下作用3 h。产物转化TOP10感受态细胞，挑选阳性克隆菌并提取质粒，酶切鉴定正确后，送上海生工生物工程公司进行测序验证。
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表 1 奶牛SCAP基因shRNA序列 Table 1 shRNA sequence of dairy SCAP gene |
将生长的293T细胞按6×105的密度接种六孔板中，用PEI转染试剂转染已经构建好的shRNA1~shRNA4 4种慢病毒质粒pKLO.1-shRNA(2 μg)、对照质粒pLenti CMV GFP(2 μg)，分别共转染包装质粒psPAX2(1.5 μg)和包膜质粒pMD2.G(0.5 μg)。转染48 h后通过显微镜观察对照组病毒感染细胞效果，收集培养基病毒液，置于15 mL离心管中，分装后冻存于-80 ℃。
1.2.3 奶牛乳腺上皮细胞嘌呤霉素最适筛选浓度的确定将奶牛乳腺上皮细胞用密度为2 000个·孔-1接种96孔板，培养过夜使其贴壁，第2天将接种细胞的96孔板分为5组，每组3个重复。分别加入含有0、2.5、5、7.5、10 mg·L-1嘌呤霉素(Puro)的10%胎牛血清培养液各100 μL。放入细胞培养箱中，37℃，5% CO2条件下培养4 d后，置于倒置显微镜下观察结果，确定最佳嘌呤霉素筛选浓度。
1.2.4 奶牛乳腺上皮细胞SCAP基因沉默细胞株的筛选乳腺上皮细胞传代到六孔板中，90% DMEM，10%胎牛血清在37 ℃培养，当细胞生长到融合度达到50%时，用1 mL的病毒混合1 mL培养基感染细胞，病毒感染后48 h向培养基中加入终浓度为5 mg·L-1的嘌呤霉素进行筛选，每天更换含有嘌呤霉素的培养基，直至对照组中的细胞全部死亡为止，获得4株SCAP基因沉默稳转细胞株RNAi-SCAP1、RNAi-SCAP2、RNAi-SCAP3、RNAi-SCAP4。
1.2.5 奶牛SCAP基因沉默稳转细胞株沉默效果观察1.2.5.1 Western blot和Real-time PCR检测4种沉默细胞株SCAP基因和蛋白表达情况：将构建好的稳转沉默细胞株培养48 h，Trizol提取细胞总RNA，按照TaKaRa试剂盒操作逆转录合成cDNA，实时定量PCR检测SCAP基因的mRNA表达，以UXT为内参基因(引物序列见表 2)，确定各细胞株SCAP基因沉默效果。在培养细胞中加入RIPA裂解液进行裂解，然后用10 mL针管剪切20次，离心取上清。BCA法测定蛋白浓度，将蛋白样品以30 μg上样，经SDS-PAGE电泳后，转移至PVDF膜上，封闭1 h，加入兔抗SCAP抗体(1:2 000) 4 ℃孵育过夜，TBST洗5次，加二抗(1:5 000)室温孵育1 h，ECL发光显影，多功能凝胶成像仪(GEAI600，USA)照像，观察蛋白表达情况，确定各细胞株SCAP蛋白沉默效果。
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表 2 荧光定量PCR引物 Table 2 Primer of real-time PCR |
1.2.5.2 Real-time PCR检测沉默细胞株RNAi-SCAP3中脂代谢相关基因表达情况：选择沉默效果显著的稳转细胞株RNAi-SCAP3，Trizol提取细胞总RNA，按照TaKaRa试剂盒操作逆转录合成cDNA，实时定量PCR检测SREBP、SCD和FAS基因的mRNA表达，以UXT为内参基因，引物序列见表 2。反应体系为10 μL：cDNA 2.5 μL，Forward Primer (10 μmol·L-1) 0.2 μL，Reverse Primer (10 μmol·L-1) 0.2 μL，SYBR Premix Ex Taq II(2×) 5 μL，ddH2O 2.1 μL。在荧光定量PCR仪上设定反应条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40个循环。根据CT值计算基因表达情况。
1.2.6 奶牛SCAP基因沉默对细胞脂滴形成的影响1.2.6.1 SCAP基因沉默对细胞脂滴含量的影响：在沉默细胞株中选择SCAP基因和蛋白表达显著降低的细胞株RNAi-SCAP3，培养48 h后，采用尼罗河红对细胞脂滴进行荧光染色。先将细胞用预冷PBS洗3遍，每遍5 min；加400 μL 4%的多聚甲醛固定20 min；加400 μL 10 mg·L-1 Nile Red染液染色15 min；PBS洗4遍，每次5 min，染色后在全波长酶标仪中设置激发波长/发射波长为543 nm/598 nm，以正常的乳腺上皮细胞为对照，倒置荧光显微镜观察脂滴荧光染色情况，进行荧光扫描和定量分析。
1.2.6.2 SCAP基因沉默对细胞脂滴直径的影响：将培养好的RNAi-SCAP3细胞弃去培养基，用PBS洗涤3次；按照油红O染色试剂盒的说明进行操作，即先用PBS洗涤3次；固定15 min；再用PBS洗涤3次；加入新配制好的染液浸染15 min，再用PBS洗涤4次；加入60%异丙醇漂洗10~15 s，PBS洗1次后弃去，再用PBS定容至1 mL。在倒置显微镜下观察脂滴，每孔细胞随机挑选40个脂滴，采用显微图像软件Cell Sens测量脂滴直径，分别对小脂滴(直径≤2.0 μm)、中脂滴(直径为2.0~2.5 μm)和大脂滴(直径≥2.5 μm)进行计数。
1.2.7 瞬时转染SCAP质粒对于奶牛细胞中脂滴直径的影响培养RNAi-SCAP3沉默稳转细胞株，细胞达到80%的融合度时，弃去培养基，采用转染试剂(Lipofectamine 3000)转染pcDNA3.1-SCAP质粒6 h后，更换新鲜培养基，同时转染pcDNA3.1空载体作为对照组，转染48 h后用PBS洗涤3次；按照油红O染色试剂盒的说明进行操作。在倒置显微镜下观察脂滴，每孔细胞随机挑选40个脂滴，采用显微图像软件Cell Sens测量脂滴直径，分别对小脂滴、中脂滴和大脂滴进行计数，统计各种脂滴分别占的比例。
1.2.8 数据分析试验中每个处理重复3次，采用SPSS10.0软件中独立样本T检验(independent t test)和单因素方差分析(one-way ANOVA)程序统计分析数据，OrigiPro7.5作图，*表示P < 0.05，**表示P < 0.01。
2 结果 2.1 奶牛SCAP慢病毒载体的构建和包装将构建好的4种shRNA重组载体经BamH I和Kpn I双酶切鉴定后产生2条带，分别大约为679和6 371 bp(图 1)，将鉴定正确的质粒送公司测序，测序结果显示插入序列与设计DNA序列完全一致，分别命名为shRNA1、shRNA2、shRNA3和shRNA4。将慢病毒重组质粒、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞，分别于24和48 h在倒置荧光显微镜下观察对照组绿色荧光蛋白表达情况。结果显示，24 h时已经有60%以上细胞表达GFP(图 2A)，在48 h时荧光强度达到最强(图 2B)，因此在细胞培养48 h后收集病毒上清。
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M. DNA相对分子质量标准; 1、3、5、7.原质粒; 2、4、6、8.质粒BamH I、Kpn I双酶切产物 M. DL5000 DNA marker; 1, 3, 5, 7. Vectors; 2, 4, 6, 8. Vector digested by BamH I and Kpn I 图 1 shRNA载体酶切鉴定 Fig. 1 The restriction enzyme digestion of shRNA vctors |
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A.24 h荧光蛋白表达；B. 48 h荧光蛋白表达 A.Fluorescent protein expression at 24 h; B. Fluorescent protein expression at 48 h 图 2 病毒荧光蛋白转染效率 Fig. 2 Transfection efficiency of viral fluorescent protein |
慢病毒包装成功之后，在96孔板中对乳腺上皮细胞进行攻毒，用不同含量嘌呤霉素的培养液进行筛选，筛选至空白对照细胞全部死亡，倒置显微镜观察结果(图 3)，发现奶牛乳腺上皮细胞最适嘌呤霉素筛选浓度为5 mg·L-1。
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A. 0 mg·L-1嘌呤霉素；B. 2.5 mg·L-1嘌呤霉素；C. 5 mg·L-1嘌呤霉素；D. 7.5 mg·L-1嘌呤霉素；E. 10 mg·L-1嘌呤霉素 A. 0 mg·L-1Puro; B. 2.5 mg·L-1Puro; C. 5 mg·L-1Puro; D. 7.5 mg·L-1Puro; E 10 mg·L-1Puro 图 3 细胞最适嘌呤霉素筛选浓度分析(100×) Fig. 3 The optimum screening concentration of puro in cell lines(100×) |
在基因水平上，沉默SCAP基因减少了其在各组细胞中的表达，RNAi-SCAP1~RNAi-SCAP4组的SCAP mRNA丰度分别为对照组的0.66(P < 0.05)、0.19(P < 0.01)、0.28(P < 0.01)和0.15倍(P < 0.01)。在蛋白水平上，与对照组相比，沉默SCAP基因抑制了SCAP蛋白在细胞中的表达，其中RNAi-SCAP3基因沉默细胞株的SCAP蛋白表达明显减少，为对照组的0.49倍(P < 0.05, 图 4B)，后续可以作为SCAP基因沉默稳转细胞株使用。
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A.4种沉默细胞株中SCAP基因的表达；B. 4种沉默细胞株中SCAP蛋白的表达 A. Expression of SCAP gene in 4 silenced cell lines; B. Expression of SCAP protein in 4 silenced cell lines 图 4 SCAP基因沉默对SCAP基因和蛋白表达的影响 Fig. 4 Effect of SCAP gene silencing on SCAP gene and protein expression |
对RNAi-SCAPA3沉默细胞株进行脂代谢相关基因表达分析发现，与对照组相比，SCD和FAS的基因表达显著下调0.68倍(P < 0.05)和0.55倍(P < 0.05)，SREBP基因的表达也略有下降。
2.5 奶牛SCAP基因沉默对乳腺上皮细胞脂滴合成的影响对细胞进行尼罗红染色，在倒置荧光显微镜下观察，如图 6A所示，用全波长酶标仪扫描细胞内脂滴的含量，对照组细胞扫描值为0.15，RNAi-SCAP3组为0.09，脂滴含量极显著减少(P < 0.01，图 6B)。
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图 5 SCAP基因沉默对脂代谢相关基因表达的影响 Fig. 5 Effect of of SCAP silencing on the expression of lipogenic genes |
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A.脂滴染色图像(40×)；B.脂滴荧光定量扫描 A. Lipid droplet staining images(40×); B. Lipid droplet fluorescence quantitative scanning 图 6 奶牛乳腺上皮细胞脂滴尼罗红染色 Fig. 6 Lipid droplets staining of Nile red in mammary epithelial cells of dairy |
对细胞采用油红O染色后进行脂滴直径分析(图 7)，与对照组细胞相比，在RNAi-SCAP3基因沉默稳转细胞株中，直径≤2.0 μm的脂滴个数增加到19个(P < 0.05)，而直径≥2.5 μm的脂滴个数减少为5.66个(P < 0.05)。
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A.细胞不同直径脂滴示意图：LD.脂滴；B.不同直径脂滴个数 A. The schematic diagram of lipid droplets with different diameters in cell: LD. Lipid droplet; B. Number of lipid droplets with different diameters 图 7 SCAP沉默对奶牛乳腺上皮细胞脂滴直径的影响 Fig. 7 Effect of SCAP silencing on the size of lipid droplets in dairy mammary epithelial cells |
在SCAP沉默细胞中过表达SCAP基因后，RNAi-SCAP3组和RNAi-SCAP3+SCAP组的SCAP mRNA表达分别上调0.28(P < 0.01)和677.32倍(P < 0.001，图 8A)，表明转染SCPA质粒后SCAP基因在细胞中进行超表达。观察细胞中不同直径脂滴占的比例发现，小脂滴比例从44%降低到18%(P < 0.05)，而大脂滴比例从17%增加到35%(P < 0.05)，整个比例变化趋向与对照组细胞相似(图 8B)。
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A.SCAP基因mRNA的表达；B.不同直径脂滴的比例 A.Expression of SCAP mRNA; B. Percentage of lipid droplets with different diameters 图 8 SCAP过表达对奶牛乳腺上皮细胞脂滴直径的影响 Fig. 8 Effect of SCAP overexpression on the size of lipid droplets in dairy mammary epithelial cells |
RNAi是由双链RNA介导的同源mRNA高效特异性降解，从而有效抑制基因表达的新方法，是细胞水平上研究基因功能的技术之一。RNAi技术的关键之一是高效的将双链RNA导入细胞, 而以慢病毒作为RNAi载体比非病毒载体容纳的基因片段大、脱靶效应低、作用范围广[16]。慢病毒介导的RNAi系统能够整合到细胞或动物组织的基因组DNA中，随着细胞的增殖实现shRNA的持续表达，有效地的介导对靶基因的沉默效应，通过抗性基因的筛选能够得到稳定细胞株[17]。曾阳阳等[18]采用慢病毒介导的RNAi抑制了小鼠C2C12细胞中skMLCK基因mRNA和蛋白的表达，蓝林祥等[19]在人肺癌PG细胞中采用慢病毒介导的RNAi抑制myosin Va基因，发现降低了PG细胞的运动和迁移能力。在猪上研究发现，慢病毒介导FUT2基因沉默后筛选得到的小肠上皮细胞系增强了细胞对大肠杆菌感染的抵抗力[17]。本研究针对反刍动物的乳腺上皮细胞进行研究，通过构建4种SCAP重组慢病毒载体，与包装质粒和包膜质粒共转染至293T细胞，收取病毒液感染奶牛乳腺上皮细胞。因为载体中含有嘌呤霉素抗性基因，针对奶牛乳腺上皮细胞用5 mg·L-1嘌呤霉素筛选出能稳定表达的SCAP基因沉默细胞株。对筛选出的细胞检测SCAP基因表达，发现各组细胞SCAP基因的表达均有显著下降，对SCAP蛋白的分析发现，RNAi-SCAP3细胞株的蛋白沉默效果较为明显，可以作为研究SCAP基因沉默的稳转细胞株使用。
乳脂肪球(MFG)作为乳中脂肪的唯一存在形式，其直径大小与乳脂肪含量显著相关[20-21]，而脂滴(LD)作为乳中脂肪球的主要来源，其形成分泌的过程与乳脂肪球密切相关[22-23]。目前主要有两种理论来解释脂滴的直径：一种是认为脂滴的直径大小主要与细胞中储存的三酰甘油含量有关[24-25]；第二种理论认为脂滴的大小主要与脂滴的融合有关，受到脂滴表面的磷脂酰胆碱(PC)或磷脂酰乙醇胺比例(PE)的调控[26]。对于细胞脂滴直径大小的分类目前还没有一个公认的标准。Cohen等[27]在2017年对奶牛乳腺上皮细胞的研究中把直径＞2.5 μm的脂滴定义为大脂滴，Zhang等[28]把小鼠乳腺中直径 < 2.0 μm的脂滴认为是小脂滴，本研究发现，奶牛乳腺上皮细胞中直径≤1.5 μm和直径≥3.0 μm的脂滴数量极少，因此分别以直径≤2.0 μm和直径≥2.5 μm来定义大、小脂滴。SCAP基因沉默后脂滴的含量有显著下降，并且直径≤2.0 μm的小脂滴增多，直径≥2.5 μm的大脂滴减少，表明SCAP蛋白的表达可能会影响到大、小脂滴的融合。进一步在SCAP沉默细胞中转染外源性SCAP质粒，使SCAP基因在沉默细胞株内进行超表达，发现乳腺细胞大、小脂滴的比例又发生回复性的变化(图 8)。据笔者所知，本研究首次在奶牛乳腺上皮细胞观察到SCAP的表达影响到脂滴的直径大小。
脂滴的生成过程是在众多蛋白的精密调控下进行的[29]。在本研究中，SCAP沉默引起细胞的SCD和FAS基因表达显著下降, 而SREBP基因的表达略有减少。脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A合成长链脂肪酸，硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-coenzyme desaturase, SCD)是催化饱和脂肪酸形成单不饱和脂肪酸的限速酶，这两种酶的表达会影响到脂肪酸的合成代谢。研究发现，在FAS和SCD基因的启动子上有转录因子SREBP的结合位点，其基因表达主要受到SREBP通路的调控[8-30]，因此在本研究中SCD和FAS基因表达降低表明沉默SCAP基因影响到了SREBP通路。虽然SREBP基因的表达在本研究中没有发生显著变化，其他研究发现，敲除SCAP会阻断SREBP蛋白的活化[31]，因此SCAP基因沉默引起的FAS和SCD基因表达的减少，是否因为SCAP沉默影响到了SREBP蛋白活性及其下游通路，这是需要下一步去深入研究的问题。
4 结论本研究成功构建了奶牛SCAP基因沉默稳转细胞株，发现SCAP沉默能够增加细胞中的小脂滴数量，减少大脂滴数量，SCAP超表达后能够减少细胞中小脂滴比例，增加大脂滴比例，推测SCAP的表达影响到细胞脂滴的直径。
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