2. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室, 北京 100193;
3. 天津市畜牧兽医研究所, 天津 300381
, LIU Qiuyue2, WANG Xiangyu2, DI Ran2, HU Wenping2, ZHANG Xiaosheng3, ZHANG Jinlong3, ZHAO Yongju1
, CHU Mingxing2
2. Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction of Ministry of Agriculture, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China;
3. Tianjin Institute of Animal Sciences, Tianjin 300381, China
产羔性状是绵羊最重要的经济性状之一，提高每胎绵羊产羔数是提升生产经济效益的重要方法[1]。目前，提高绵羊繁殖力的研究主要体现在两个方面，一个是通过应用繁殖技术，如同期发情与超数排卵；另一个是利用分子标记技术选择与产羔性状相关的基因型，而后者随着近些年科技的发展，成为了人们普遍利用的研究方法[2]。应用基因组学是在整个基因组中筛选与绵羊繁殖性状相关的基因和分子标记，这样学者们能够更加深入地学习绵羊产羔性状的遗传机理，这对我国绵羊业的可持续发展将带来巨大的经济效益[3]。
促黄体素(luteinizing hormone，LH)是一种糖蛋白类激素，它控制哺乳动物的生殖，由垂体前叶嗜碱性细胞合成分泌[4]，它由α和β 2个亚基组成。LH在雌性哺乳动物中的主要作用是和FSH协同促进卵泡发育成熟，并且参与合成雌激素，诱发排卵，最终促进黄体生成[5]。LH和促黄体素受体(luteinizing hormone receptor，LHR)的胞外功能区相结合，激活G蛋白，然后激活cAMP系统，引起甾体激素的合成与分泌，进而参与雌性哺乳动物一系列生理活动的调节[6-7]。胡威等[8]研究表明，在黄体期和卵泡期牦牛的卵巢、子宫、输卵管组织中LHR基因的表达量存在差异，提示LHR在牦牛的繁殖过程中具有重要的调节作用。Wohlres-Viana等[9]在瘤牛中观察到，通过LHR亚型表达模式的连续变化来调节LHR功能可能在优势卵泡的早期选择性差异中起重要的作用。狄冉等[10]研究表明，在济宁青山羊中，LHR基因第11外显子对其性早熟和高繁殖力没有显著影响。吴井生等[11]在小梅山猪LHR基因第11外显子1 351 bp处发现1个SNP(C→T)，并且其多态性与小梅山猪的产仔数显著相关(P＜0.05)。
近年来，全基因组重测序是发掘功能基因最主要的方式[12-15]，本实验室前期通过对10个绵羊品种99个绵羊个体进行全基因组重测序[16]，筛选出与绵羊产羔数相关的候选基因LHR的g.75741060A>C、g.75747399C>G、g.75747421A>C、g.75747646C>T、g.75748150A>G、g.75748191A>T和g.75748200T>A 7个SNPs位点。另外，本试验在小尾寒羊群体中，使用Taqman探针法对FecB基因进行分型，确定了FecB基因突变++型中产多羔和产单羔的小尾寒羊个体，并将其作为研究对象，利用实时荧光定量PCR技术检测LHR基因在HPOA轴相关组织的表达情况，同时对LHR基因7个位点的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)进行研究，旨在探讨LHR基因表达、多态性与小尾寒羊繁殖性状之间的联系，为小尾寒羊多羔性状的机理研究提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验样品及主要试剂随机选取2~3周岁健康的小尾寒羊母羊6只(其中3只FecB ++型多羔小尾寒羊和3只FecB ++型单羔小尾寒羊)，对6只小尾寒羊用孕酮阴道栓(CIDR)方法进行处理，12 d后撤栓，撤栓后45 h屠宰并采集大脑、卵巢、下丘脑、垂体、小脑、子宫和输卵管7种组织，置于-80 ℃冰箱保存。
分型样品：共760只绵羊，其中小尾寒羊380只(有产羔数记录)，其他品种绵羊380只：滩羊(22)、小尾寒羊(27)、湖羊(101)、草原型藏羊(161)、苏尼特羊(21)和策勒黑羊(48)，其中单羔品种为滩羊、苏尼特羊和草原型藏羊，多羔品种为小尾寒羊、湖羊和策勒黑羊。
RNAprep pure动物组织总RNA提取试剂盒购于天根生化科技有限公司(北京)；反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT Reagent Kit)购于TaKaRa公司(大连)；荧光定量染料(SYBR ®Premix Ex TaqTM Ⅱ)购于TaKaRa公司(大连)。
1.2 RNA提取使用Trizol和RNA提取试剂盒提取上述组织总RNA。利用Nanodrop 2000检测总RNA的浓度和OD值，用1.2%的琼脂糖凝胶检测RNA，最后置于-80 ℃冷冻备用。
1.3 cDNA合成用反转录试剂盒反转录合成cDNA，反应体系总体积为20 μL：12 μL RNase-Free ddH2O，1.0 μL Oligo dT Primer，1.0 μL PrimeScript RT Enzyme Mix E，1.0 μL Random 6 mers，1.0 μL RNA，4.0 μL 5×PrimeScript Buffer (for Real Time)。反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。将反转录后得到的产物5倍稀释，用持家基因β-actin进行PCR检测。最终，将检测达标的cDNA置于-20 ℃保存。
1.4 引物设计使用GenBank提供的绵羊LHR基因mRNA序列(登录号为：NM_001278566.1)，用Primer Premier 6.0软件设计引物，以β-actin(NM_001009784.2)作为内参基因。引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成。引物名称、序列和产物大小见表 1。
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表 1 荧光定量引物信息 Table 1 The primer information for qPCR |
利用Roche Light Cycler®480Ⅱ型荧光定量PCR仪进行荧光定量检测，以β-actin基因为内参基因。反应体系总体积为20 μL：forward primer 0.8 μL，reverse primer 0.8 μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL，RNase-Free ddH2O 6.4 μL和cDNA 2.0 μL。PCR程序：95℃预变性5 s；95℃变性10 s，60℃ 30 s，40个循环。
1.6 基因分型对LHR基因g.75741060A>C、g.75747399C>G、g.75747421A>C、g.75747646C>T、g.75748150A>G、g.75748191A>T和g.75748200T>A位点分型，采用SequenomMassARRAY®SNP技术对这7个位点进行基因型检测。分型样品为DNA，每个样品20 μL，DNA浓度40~80 ng·μL-1。
1.7 统计分析采用2-ΔΔCT法计算LHR基因的相对表达量，用SPSS 19.0软件对数据进行显著性分析，用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行组间比较，用最小显著差异法(least significant difference, LSD)进行多重比较。
应用Microsoft Excel 2016软件统计绵羊LHR基因g.75741060A>C、g.75747399C>G、g.75747421A>C、g.75747646C>T、g.75748150A>G、g.75748191A>T和g.75748200T>A位点的有效等位基因数(Ne)、杂合度(He)、多态信息含量(PIC)、基因型频率和等位基因频率，随后进行Hardy- Weinberg检测。
使用yijkl=μ+LSi+Pj+Gk+eijkl模型进行最小二乘方差分析。其中，yijkl为产羔数的记录值；μ为群体平均值；LSi为第i个产羔季节的固定效应；Pj为第j个胎次的固定效应；Gk为LHR基因第k种基因型的固定效应；eijkl为随机残差效应。用SPSS19.0软件中一般线性模型对小尾寒羊基因型与产羔数据进行关联分析，所有数据以“均值±标准误”表示。
2 结果 2.1 总RNA提取和cDNA合成使用RNA提取试剂盒提取小尾寒羊各组织的RNA，用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，所提取的小尾寒羊各组织的RNA完整度好，且无降解和污染。以cDNA为模板对β-actin进行sqRT-PCR扩增，检测cDNA质量，结果显示，持家基因β-actin引物扩增效果良好(图 1)，目的片段与预期的97 bp一致，且条带单一，cDNA可以用于后续的荧光定量试验。
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M.DNA相对分子质量标准；1~7.垂体、输卵管、小脑、下丘脑、大脑、卵巢、子宫 N.DL2000 DNA marker; 1-7.Pituitary, oviduct, cerebellum, hypothalamus, brain, ovary, uterus 图 1 cDNA电泳检测 Fig. 1 cDNA electrophoresis detection |
利用荧光定量PCR技术对LHR基因在小尾寒羊垂体、输卵管、小脑、下丘脑、大脑、卵巢和子宫组织的表达水平进行研究，结果见图 2。LHR基因在卵巢组织高表达，在大脑、下丘脑低表达，在小脑、输卵管、垂体、子宫组织几乎不表达。LHR基因在小尾寒羊多羔群体卵巢、大脑、下丘脑组织表达量均极显著高于小尾寒羊单羔群体(P < 0.01)。
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*表示差异显著(P < 0.05)；**表示差异极显著(P < 0.01)，下同 * mean significant difference(P < 0.05); ** mean extremely significant difference(P < 0.01), the same as below 图 2 LHR基因在小尾寒羊各组织的表达 Fig. 2 Expression of LHR gene in different tissues of Small Tail Han sheep |
分型发现LHR基因7个SNPs位点在单、多羔品种中均存在3种基因型，见图 3。g.75741060A>C位点基因型分别为AA、CA和CC；g.75747399C>G位点基因型分别为CC、CG和GG；g.75747421A>C位点基因型分别为AA、CA和CC；g.75747646C>T位点基因型分别为TT、CT和CC；g.75748150A>G位点基因型分别为AA、GA和GG；g.75748191A>T位点基因型分别为AA、TA和TT；g.75748200T>A位点基因型分别为TT、TA和AA。
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图 3 LHR基因不同SNPs位点的分型结果 Fig. 3 Genotyping of different SNPs of LHR gene |
LHR基因不同位点基因型频率和等位基因频率在单、多羔品种间的差异水平见表 2，LHR基因g.75741060A>C和g.75747421A>C位点差异均不显著(P>0.05)，g.75747399C>G位点差异达到显著水平(P < 0.05)，g.75747646C>T、g.75748150A>G、g.75748191A>T和g.75748200T>A位点差异极显著(P < 0.01)。就g.75747399C>G位点而言，多羔和单羔品种中CC为优势基因型，C为优势等位基因；就g.75747646C>T位点而言，多羔和单羔品种中CC为优势基因型，C为优势等位基因；就g.75748150A>G位点而言，多羔和单羔品种中AA为优势基因型，A为优势等位基因；就g.75748191A>T位点而言，多羔品种和单羔品种中优势基因型均为AA，优势等位基因均为A。
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表 2 LHR基因不同SNPs位点在单、多羔绵羊品种中的基因型频率和等位基因频率 Table 2 Genotype and allele frequencies of different SNPs of LHR gene in uniparous and multiparous sheep |
由表 3可知，LHR基因的g.75741060A>C和g.75748200T>A位点在小尾寒羊、滩羊、苏尼特羊、策勒黑羊、湖羊以及草原型藏羊、g.75747646C> T在小尾寒羊、苏尼特羊和策勒黑羊、g.75747421A>C在小尾寒羊和湖羊中均表现为中度多态(0.25 < PIC < 0.5)；g.75747399C>G、g.75748150A>G和g.75748191A>T在小尾寒羊、滩羊、苏尼特羊、策勒黑羊、湖羊以及草原型藏羊、g.75747646C>T在滩羊、湖羊以及草原型藏羊、g.75747421A>C在滩羊、苏尼特羊、策勒黑羊以及草原型藏羊中均表现为低度多态(PIC < 0.25)。另外，卡方适合性检验结果表明，除了小尾寒羊、策勒黑羊和滩羊在g.75747421A>C位点，藏羊在g.75747646C>T位点，策勒黑羊在g.75748150A>G位点，湖羊、小尾寒羊和策勒黑羊在g.75748191A>T位点，小尾寒羊在g.75748200T>A和g.75747399C>G位点中处于哈代温伯格不平衡状态以外(P < 0.05)，其余位点在各品种中均处于哈代温伯格平衡状态(P>0.05)。
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表 3 基因不同SNPs位点在不同绵羊品种中的群体遗传学分析 Table 3 Population genetic analysis of different SNPs of LHR gene in different sheep breeds |
由表 4可知，LHR基因g.75741060A>C的多态性与小尾寒羊第3胎产羔数显著相关(P＜0.05)；g.75747421A>C的多态性与小尾寒羊第2胎产羔数极显著相关(P＜0.01)，g.75748150A>G的多态性与小尾寒羊第1、2胎产羔数极显著相关(P＜0.01)，而g.75747399C>G、g.75747646C>T、g.75748191A>T和g.75748200T>A的多态性与小尾寒羊各胎产羔数均没有显著相关(P＞0.05)。g.75741060A>C、g.75747421A>C、g.75747646C>T和g.75748200T>A位点突变纯合型的产羔数大多数都高于野生纯合型，而g.75747399C>G、g.75748150A>G和g.75748191A>T位点突变纯合型的产羔数低于野生纯合型，杂合子的产羔数基本位于二者之间或最高。
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表 4 LHR基因不同位点各基因型小尾寒羊产羔数最小二乘均值及标准误 Table 4 Least square means and standard errors of litter size of individuals with different genotypes at different SNPs of LHR gene in Small Tail Han sheep |
哺乳动物的生殖活动主要受下丘脑、垂体、性腺轴相关激素的调节，GnRH通过刺激促性腺激素细胞分泌合成FSH，FSH与其受体相结合发挥作用，诱导促黄体素(LH)合成与释放并与LHR相结合，从而促进卵泡的发育和成熟，这一过程对动物繁殖性状的调控起着重要作用[17]。因此，阐明LHR mRNA在生殖器官的相对表达量对研究绵羊多羔机制有十分重要的意义。在人[18]、小鼠[19]和狗[20]中，LHR已经被证实在卵巢组织的膜细胞和排卵前卵泡的颗粒细胞中表达。而Wei等[21]和Wohlres-Viana等[9]对绵羊和瘤牛的研究也表明，LHR的表达水平会影响卵泡的发育，从而影响动物的繁殖性能。本研究发现，在小尾寒羊中，LHR基因在卵巢组织中高表达，与之结果相一致，暗示LHR基因在卵巢组织的高表达对小尾寒羊的产羔性状有一定的调控作用。另外，Chen等[22]、Huo等[23]和胡威等[8, 24]的研究发现，LHR除了在牦牛传统的性腺靶位点(如卵巢)表达，还在性腺外组织有一定的表达，并推测其可能参与调控牦牛的繁殖性能。本研究发现，LHR在小尾寒羊的大脑和下丘脑中有一定的表达，和Chen等[22]、Huo等[23]和胡威等[8, 24]的研究结果相一致，但是LHR基因在脑组织中的表达是否也会影响绵羊的繁殖性状，还需要后续的研究证明。LHR基因在垂体、输卵管、小脑组织中几乎不表达，与Chen等[22]、Huo等[23]和胡威等[8, 24]不一致，说明在不同的物种、不同的组织中，LHR的表达模式也有一定的差异。LHR基因在小尾寒羊多羔群体卵巢、下丘脑、大脑组织表达都极显著高于小尾寒羊单羔群体(P<0.01)，说明LHR基因是影响小尾寒羊产多羔的主效基因，它对绵羊的繁殖活动有着深刻的影响。
3.2 LHR基因与绵羊产羔数之间的关系在LHR基因多态与繁殖性状相关性方面，王利红等[25]在湖羊群体中检测到LHR基因有2个SNPs位点，但不同基因型个体间产羔数差异不显著。张善文[26]在长白猪和大白猪中检测到LHR基因在exon 8上的多态位点与繁殖性状不存在关联。Kathiravan等[27]在buffaloes牛中检测到LHR基因的exon 11的多态位点与繁殖性状没有显著相关性。本研究中，LHR基因g.75741060A>C和g.75747421A>C位点的基因型频率和等位基因频率在单、多羔品种间差异均不显著(P>0.05)；g.75747399C>G位点差异达到显著水平(P<0.05)；g.75747646C>T、g.75748150A>G、g.75748191A>T和g.75748200T>A位点差异极显著(P < 0.01)，初步表明这些位点与绵羊的繁殖性状有一定的关联；这7个位点中，发现不同位点在不同绵羊品种中的选择强度并不一致，可能是由于某些绵羊品种遗传多样性贫乏或选择的各品种数量不同的原因造成。另外，g.75741060A>C、g.75747399C>G、g.75747421A>C、g.75747646C>T、g.75748150A>G、g.75748191A>T和g.75748200T>A位点在大部分绵羊品种中都处于哈代温伯格平衡状态(P>0.05)，说明经过长期的进化选择，这7个位点在适应性方面有相对的遗传优势；值得注意的是，g.75748191A>T位点在滩羊和苏尼特羊中没有任何突变型，可能是与突变型适应性较差、因突变致死或选择的这两种羊的样本数量少有关。关联分析发现，LHR基因g.75741060A>C的多态性与小尾寒羊第三胎产羔数显著相关(P＜0.05)；g.75747421A>C的多态性与小尾寒羊第二胎产羔数极显著相关(P＜0.01)，g.75748150A>G的多态性与小尾寒羊第一、二胎产羔数差异极显著相关(P＜0.01)，而g.75747399C>G、g.75747646C>T、g.75748191A>T和g.75748200T>A的多态性与小尾寒羊各胎产羔数均没有显著相关(P＞0.05)。值得注意的是，g.75741060A>C和g.75747421A>C都是突变纯合型的产羔数高于野生纯合型；而g.75748150A>G是野生纯合型的产羔数高于突变纯合型，说明这个位点的野生纯合在一定程度上增强了绵羊的产羔能力，而突变纯合则对产羔能力有一定的削弱；g.75747399C>G、g. 75747646C>T、g.75748191A>T和g.75748200T>A位点的各基因型与产羔数之间的关联均不显著，推测这4个位点可能并不是影响绵羊产羔数的关键位点。
4 结论本研究发现，LHR基因的3个SNPs位点的多态性与小尾寒羊各胎产羔数显著关联，表明其可能参与了小尾寒羊多羔性状调控，深入探究该基因功能对小尾寒羊繁殖性状的选育具有一定的参考意义。
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