猪圆环病毒(PCV)为单股环状DNA病毒，包括三种不同类型病毒，即PCV1、PCV2和PCV3^[1]。无致病性的PCV1被认为是PK-15(猪肾上皮细胞)的污染物^[2]。PCV2是猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的主要病原，依据ORF2基因的变异特性，PCV2可以分为2a~2e等基因型。1992年，加拿大首先报道了PCV2的感染，欧美等国家有陆续报道^[3-4]。

2016年，Palinski等^[5]通过高通量测序技术从皮炎肾病综合征和繁殖障碍猪的病料中鉴定了一种新型的猪圆环病毒，命名为PCV3。PCV3基因组长度约为2.0 kb，病毒粒子无囊膜呈二十面体结构，直径为17~20 nm。病毒基因组主要包含3个开放阅读框(ORF)：ORF1、ORF2和ORF3基因，其中ORF1基因编码复制酶蛋白(Rep，297 aa)，ORF2基因编码核衣壳蛋白(Cap，214 aa)，其中，Cap N端富含精氨酸^[6]，包含病毒核定位信号区域，与病毒核内定位及诱导动物机体产生特异性的免疫应答反应相关^[7]。本实验室报道了国内部分猪场PCV3流行情况。ORF3编码一个未知功能的蛋白质(231 aa)。Wen等^[8]报道了在广西地区检测到PCV3，并且PCV3阳性检出率为37.96%(41/108)，屠宰场中阳性检出率为19.14%(9/47)。Zheng等^[9]检测山东地区有临床症状的猪，在其组织样品中PCV3的阳性检出率为59.46%(132/222)，其中PCV2和PCV3的混合感染率高达39.39%(51/132)。

目前，血清抗体的检测方法主要是ELISA。此方法操作简单、快速，易于标准化，适合临床上检测大量样品。因此本研究以截短的ORF2编码的蛋白(Cap蛋白)为包被抗原，建立了检测PCV3抗体的间接ELISA检测方法，同时将其应用于临床检测，调查临床血清中PCV3抗体的阳性率。

1 材料与方法 1.1 质粒、器材及血清

PCV3阳性病料为本实验室PCR检测为阳性并保存。PCV3阳性血清是采用本实验室分离到的第10代PCV3病毒(WH株)(2.08×10⁵copies·μL^-1)，通过免疫20日龄PCV3抗原抗体均为阴性的仔猪，3周后采集，经间接免疫荧光试验检测为抗体阳性，作为标准阳性血清。PCV3阴性血清是由本实验室制备自未感染猪，经IFA方法和qPCR检测抗体和病原均为阴性的未吃初乳仔猪血清，作为标准阴性血清。pET-30a质粒由本实验室保存。DH5α和E. coli BL 21(DE3)感受态细胞、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit(质粒小提试剂盒，EM101)等均购自北京全式金生物技术有限公司；BamHⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶购自宝生物工程有限公司(大连TaKaRa公司)。Ni-NTA蛋白纯化试剂盒购自南京金斯瑞公司；HRP标记的羊抗猪IgG购自安特捷生物技术有限公司。TMB底物显色液购于武汉科前生物股份有限公司。

1.2 试验方法 1.2.1 引物设计

参照GenBank数据库中PCV3-ORF2序列(GenBank NO.:KY354039)，根据ORF2编码框从第361位开始设计一对引物扩增出一段长为285 bp的基因。上游引物F的序列：5'-CGGGATCCTGGCTCCAAGACGACCCTTAT-3'；下游引物R的序列：5'-GGAATTCTTAGAGAACGGACTTGTAACGA-3'。下划线处分别是BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位点序列。上述引物由上海生物工程股份有限公司合成。

1.2.2 重组质粒pET-30a-ORF2的构建

将原核表达载体pET-30a与扩增后的ORF2基因片段分别用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，并回收纯化。将回收得到的产物于4 ℃过夜连接并进行转化，PCR扩增鉴定重组菌。将PCR鉴定的阳性菌提取质粒进行双酶切鉴定，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析。

1.2.3 重组PCV3 Cap蛋白的表达纯化及鉴定

将测序正确的重组质粒pET-30a-ORF2转化到E. coli BL21(DE3)表达感受态细胞，通过对表达条件包括时间、IPTG浓度的筛选，确定最佳蛋白诱导表达体系，最终将表达的蛋白进行纯化并测定其浓度。对纯化的Cap蛋白取样进行SDS-PAGE验证，以及用PCV3阳性猪血清作为一抗，HRP标记的羊抗猪IgG为二抗，作Western blot鉴定。

1.3 间接ELISA诊断方法的建立 1.3.1 抗原最佳包被浓度和待检血清稀释度的选择

通过ExPASy-ProtParam tool对表达的Cap蛋白进行等电点预测，其等电点为9.60。因此本试验采用方阵滴定法，以碳酸盐缓冲液(0.05 mol·L^-1、pH9.6)为包被液将纯化的Cap蛋白稀释至终浓度为0.5、1、2、4、8、10 μg·mL^-1每个浓度包被3列，每孔100 μL，4 ℃包被过夜。PBST洗涤4次，每次5 min，之后拍干。用1%BSA溶液，100 μL·孔^-1，37 ℃封闭1 h，洗涤方法同上。将阴、阳性血清进行1: 10、1: 20、1: 40、1: 80、1: 160、1: 320、1: 640、1: 1 280，8个梯度倍比稀释后加入ELISA包被板中，每个血清稀释度做3个生物学重复，100 μL·孔^-1，37 ℃作用1 h，取出洗涤，方法同上。加入1: 5 000倍稀释的HRP标记的羊抗猪IgG酶标二抗，100 μL·孔^-1，37 ℃反应45 min。PBST洗涤4次，每次5 min，弃去孔内液体。洗涤后加入TMB底物液，100 μL·孔^-1，室温避光反应10 min。加入2 mol·L^-1硫酸溶液，50 μL·孔^-1，终止反应，测定OD_{630 nm}值。以阳性血清OD_{630 nm}值接近1，P/N值最大孔的抗原浓度和血清稀释度作为最佳抗原包被浓度和血清稀释度。

1.3.2 抗原最佳包被条件和最佳封闭液条件的选择

以最适抗原浓度包被酶标板之后，用3种不同条件处理酶标板：4 ℃包被12 h；37 ℃孵育30 min之后4 ℃包被12 h；37 ℃孵育60 min之后4 ℃包被12 h。选择最佳包被时间和包被温度。之后取4组封闭液：0.5% BSA、1% BSA、5%脱脂奶粉(5%SMP)、10%脱脂奶粉(10%SMP)，其他步骤同“1.3.1”，选择最合适的封闭液。再将37 ℃孵育封闭时间分为4组：30、60、90和120 min。其他步骤同“1.3.1”，计算其P/N值，选择最佳封闭时间。

1.3.3 待检血清(一抗)最佳孵育时间和最佳二抗孵育时间的选择

血清按照确定的最佳稀释度加入酶标板，37 ℃分别孵育30、45、60、90 min，确定最佳一抗孵育时间。将酶标抗体(二抗)按照推荐的稀释倍数1: 5 000加入酶标板后，37 ℃分别作用30、45、60、90 min，以选择最适的酶标抗体作用时间。

1.3.4 最佳显色时间的选择

按照上述最优方法进行包被，封闭，以及一抗、二抗的最佳工作浓度和时间选择后，加入TMB底物液，100 μL·孔^-1，室温避光分别反应5、10、15 min，之后加入终止液50 μL·孔^-1，于酶标仪630 nm波长读数。计算出对应的P/N值，选择最佳底物显色时间。

1.3.5 临界值的确定

取60份临床未吃初乳仔猪的血清作为阴性血清，在最优条件下测定血清OD_{630 nm}, 同时测阳性血清OD_{630 nm}，计算出阴、阳性血清对照孔平均值。另取60份经间接免疫荧光试验确定的阴性血清样品，测定其OD_{630 nm}，进而算出样品的S/P值。阴性样品S/P值的平均值(x)，标准偏差(s)。根据统计学原理，当S/P值≥x+3s时判为阳性，S/P值≤x+2s判为阴性，介于两者之间判为可疑。

1.3.6 重复试验

批内重复试验：将同一批次纯化的蛋白包被ELISA板，取5组不同抗体水平的阳性血清样品和1组阴性血清样品，每份血清做3个生物学重复，并于6个不同时间点分别进行ELISA检测，统计检测结果并计算标准差、平均值和变异系数。

批间重复试验：用不同批次制备的6批蛋白抗原分别包被ELISA板，对5组不同阳性血清样品和1组阴性血清样品分别检测，计算其标准差、平均值和变异系数。

1.3.7 实验室特异性试验

用本方法分别检测PCV2阳性血清(PCV2⁺)、猪瘟病毒阳性血清(CSFV⁺)、猪伪狂犬病病毒阳性血清(PRV⁺)和猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清(PRRSV⁺)，同时设阴、阳性血清对照，进行特异性试验分析。

1.3.8 临床血清样品检测

应用本研究建立的ELISA方法和PCV2-ELISA试剂盒检测2018年河南、湖北等地区多个猪场采集的439份不同日龄的临床猪血清样品，以此评估当前PCV3的流行情况和与PCV2共感染情况。

2 结果 2.1 目的基因的扩增和重组质粒pET-30a-ORF2的构建

以临床PCV3阳性病料DNA为模板，通过PCR扩增可得到大小为285 bp的特异性条带(图 1A)，与预期的片段大小相符。

对阳性菌落提取质粒进行BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，结果分别可见大小约为5 400和285 bp的条带(图 1B)。对其进行测序，测序结果表明重组质粒正确。

2.2 重组蛋白的表达、纯化及SDS-PAGE和Western blot鉴定

将重组质粒菌液pET-30a-ORF2经1 mmol·L^-1的IPTG诱导后，分别于第4、5、6小时取样进行SDS-PAGE验证(图 2A)。并分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE验证，结果表明重组蛋白以非可融蛋白形式大量表达，存在于沉淀中(图 2B)。对沉淀蛋白进行变性复性处理，并Ni-NTA蛋白纯化(图 2C)。对纯化蛋白进行Western blot鉴定，在17 ku处有特异条带(图 3)。

2.3 重组蛋白抗原最佳包被浓度和血清稀释度的确定

方阵滴定试验结果表明，当抗原包被浓度为1 μg·mL^-1，血清稀释倍数为1: 20时阳性血清OD_{630 nm}值接近1，且此稀释度的P/N值最大。因此选择最佳抗原包被浓度为1 μg·mL^-1，最佳血清稀释倍数为1: 20。

2.4 抗原最佳包被条件和最佳封闭液条件的确定

试验结果表明，当抗原4 ℃包被12 h，5%的脱脂奶粉封闭90 min时P/N值最大，因此确定最佳包被条件是4 ℃，12 h，最佳封闭条件为5%的脱脂奶粉封闭90 min。

2.5 血清最佳作用时间和酶标抗体最佳作用时间的确定

试验结果表明，一抗血清在37 ℃孵育60 min，酶标二抗在37 ℃孵育45 min时P/N值最大，确定最佳一抗孵育时间为37 ℃ 60 min，最佳酶标二抗孵育时间为37 ℃ 45 min。

2.6 最佳显色时间的确定

加入底物显色液后分别于室温避光反应5、10、15 min，结果表明，当加入底物显色液于避光反应10 min时P/N值最大，确定最佳显色时间为10 min。

2.7 临界值的确定

取60份制备的PCV3抗体阴性血清和1份人工感染制备的阳性血清，每份血清做3个生物学重复。在优化ELISA条件下进行检测，其阳性血清平均OD值为1.290，阴性血清平均OD值为0.056；取另外60份经间接免疫荧光试验确定的阴性血清样品，再用建立的ELISA测定，结果如表 1所示，并计算阴性血清样品的S/P值。

$ \begin{array}{l} {\rm{S/P}} = \\ \frac{{样品{\rm{O}}{{\rm{D}}_{{\rm{630}}\;{\rm{nm}}}} - 阴性对照{\rm{O}}{{\rm{D}}_{{\rm{630}}\;{\rm{nm}}}}平均值}}{{阳性对照{\rm{O}}{{\rm{D}}_{{\rm{630}}\;{\rm{nm}}}}平均值 - 阴性对照{\rm{O}}{{\rm{D}}_{{\rm{630}}\;{\rm{nm}}}}平均值}}。\end{array} $

阴性样品S/P值的平均值x=0.141，标准偏差s =0.044。根据统计学原理，S/P≥x+3 s = 0.273时判为阳性，S/P≤x+2 s =0.229时判为阴性，介于两者之间为可疑。

2.8 重复试验

试验结果表明，批内重复试验的变异系数在1.06%~3.74%，批间重复试验的变异系数在2.51%~8.47%，均小于10%。

2.9 特异性试验

用建立的间接ELISA方法分别检测PCV2阳性血清、猪瘟病毒阳性血清、猪伪狂犬病病毒阳性血清和猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清，同时设阴、阳性血清对照。结果表明该ELISA检测其他病毒血清，均无假阳性反应。

2.10 临床血清样品检测

用本试验建立的间接ELISA-PCV3抗体检测方法，对2018年河南、湖北等地区多个猪场采集的439份临床猪血清进行检测，结果显示：PCV3阳性血清总检出率为60.59%。并对其中已知的343份不同日龄的血清进行检测，结果显示：母猪检出率为91.55%(65/71)；仔猪检出率为17.95%(7/39)；保育检出率为50.44%(57/113)；育肥检出率为70%(84/120)。其中PCV2阳性血清检出率为57.40%(252/439)，PCV3和PCV2混合感染率为42.14%(185/439)，这与Deng等^[10]从2015—2017年的PCV3阳性检出率为22.35%~51.88%的结果基本一致。

3 讨论

2016年在美国首次报道PCV3^[5]，随后各个国家相继报道在临床样品中检测到PCV3。PCV3在各国的检出率呈上升趋势，且各国之间PCV3的同源性和序列相似性很高，提示PCV3可能存在跨国传播情况^{[5, 11-13]}。目前针对PCV3的检测方法主要有：常规PCR技术^[13]、单重TaqMan实时荧光定量^[14]、多重实时荧光定量^[15]、环介导等温扩增^[16]、基于PCV3-Cap全长蛋白的间接ELISA检测方法^[10]等。这些检测方法操作复杂，特异性和敏感性不高。因此有必要建立一种快速、简便、敏感、特异性更高的检测方法。

ORF2基因是PCV3的主要结构蛋白基因，编码核衣壳蛋白，与PCV1和PCV2 Cap蛋白相似性分别为21%和36%，因此，以Cap蛋白为抗原建立的ELISA可特异检测PCV3抗体。Nawagitgul等^[17]分别以细胞培养病毒和表达的重组衣壳蛋白为抗原建立了两种ELISA方法，结果证明，利用重组衣壳蛋白作为包被抗原比用细胞培养的病毒作为抗原更为有效。基于PCV3-Cap全长蛋白的间接ELISA方法可能与PCV2有交叉反应。因此，本研究通过对PCV3-Cap蛋白进行抗原表位预测，分析发现其抗原表位多聚集在C端100氨基酸附近^[6]，而N端前34氨基酸为核定位序列。通过表达去除N端前120个氨基酸的Cap蛋白，纯化后作为包被抗原，建立间接ELISA检测方法，可避免其在检测PCV1、PCV2抗体时，产生假阳性反应。

多次特异性试验结果显示，该方法可特异性检测PCV3抗体，这包括用分离的PCV3病毒感染猪所产生的抗体，也能与用表达的PCV3 Cap蛋白免疫动物产生的抗体，且与PCV2阳性血清、猪瘟病毒阳性血清、猪伪狂犬病病毒阳性病毒血清、猪繁殖与呼吸综合征阳性血清均无反应。批内和批间试验结果表明，试验变异系数在1.06%~8.47%之间，证明该方法重复性好。

利用本研究建立的间接ELISA-PCV3检测方法，对2018年河南、湖北等地多个猪场采集到的439份不同日龄血清进行检测。结果显示：PCV3阳性血清总检出率为60.59%，并且在不同阶段PCV3阳性血清检出率有所不同，在仔猪阶段阳性抗体检出率较低，到保育阶段阳性抗体开始有所上升，育肥阶段抗体阳性检出率达到70%，其中PCV3和PCV2混合感染率为42.14%。以上研究均证明在2018年PCV3阳性血清检出率较之前有所上升，并且存在PCV2和PCV3共感染，但是两者之间的共感染机制仍有待深入研究。

本试验研究了猪圆环病毒3型间接ELISA检测方法的建立和应用，为当前PCV3的诊断和流行病学调查提供有利工具，为商业化PCV3抗体ELISA检测试剂盒的研究奠定了基础。未来将进一步用本方法监控PCV3感染后抗体消长规律，明晰抗体存在的时间长短，为相关疾病的诊断提供新数据。

4 结论

利用大肠杆菌表达系统和His融合标签，成功表达去除N端前120个氨基酸的Cap蛋白。经Western blot分析，Cap蛋白可与PCV3阳性血清发生特异性反应，具有很好的免疫学反应原性，并经Ni-NTA亲和层析柱成功纯化。用纯化后的Cap蛋白作为包被抗原，通过对各项反应条件的优化，初步建立特异性检测PCV3血清抗体的间接ELISA方法。利用建立的PCV3-ELISA方法，对2018年华中地区多个猪场进行血清检测，PCV3血清抗体阳性率为60.59%，表明PCV3感染情况在我国可能较为严重。